Este documento descreve um estudo sobre a atividade da enzima nitrato redutase em folhas de plantas. Foram medidos os níveis de atividade desta enzima em folhas de Panicum maximum jacq e Cyperis rotundus sob diferentes condições, como variando o pH, concentração de substrato e temperatura. Os resultados obtidos forneceram informações sobre como esses fatores afetam a atividade da nitrato redutase.

1. Nitrato redutase in vivo nas folhas das plantas
2013
Índice
Índice ..........................................................................................................................................................1
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................................................2
1.1. OBJECTIVOS......................................................................................................................................4
1.1.1. Objectivo geral:..........................................................................................................................4
1.1.2. Objectivo específico:..................................................................................................................4
2. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................................................4
Determinação da atividade da redutase de nitrato “in vivo”, variando-se o pH.................................4
MATERIAIS...............................................................................................................................................5
PROCEDIMENTOS........................................................................................................................................6
RESULTADOS................................................................................................................................................7
DISCUSSÃO..................................................................................................................................................9
LIMITÇÕES ................................................................................................................................................10
CONCLUSÃO..............................................................................................................................................10
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................................................................12
ANEXOS .....................................................................................................................................................13
Grupo I, Subgrupo IV
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2. Nitrato redutase in vivo nas folhas das plantas
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1. INTRODUÇÃO
Nitrato reductase é uma enzima que tem a função de reduzir o ião nitrato em nitrito nas
folhas, para ser metabolizado pela planta, ou seja, incorporado a compostos orgânicos formando
aminoácidos, proteínas e outros compostos nitrogenados, o nitrato (NO 3-) absorvido pelas raízes
deve ser necessariamente reduzido para amónio (NH4+). Esta redução, na maioria das plantas
ocorre nas folhas e em três etapas: a primeira no citoplasma, onde o NO 3- passa para NO2-, e é
mediada pela enzima Nitrato Redutase (RNO3), a segunda nos cloroplastos, onde o NO 2- passa
para NH4+, mediada pela enzima Nitrito Redutase (RNO 2), e a terceira do NH4+ para aminoácidos
e é medido pela enzima glutamina sintetase (GS). No primeiro estágio, o agente redutor é o
NADH, originado na respiração, e no segundo estágio, nos cloroplastos, o agente redutor é a
Ferredoxina, cujos electrões são originados no Fotossistema I (FSI) da fase clara da fotossíntese
(SALISBURY, 1985)
A reductase de NO3- é estimulada pela luz e há indícios de que a actividade da mesma
esteja relacionada com a capacidade de certas plantas em acumular mais proteínas, o que tem
sugerido o melhoramento genético monitorado pela medida da actividade enzimática. Também
tem sido utilizada na avaliação da nutrição nitrogenada em diversas culturas. A actividade da
enzima pode ser estimada pela quantidade de N0 2- formada pela incubação da reductase com o
seu substrato.
Nas plantas superiores e nas algas verdes o doador de elétrons para a redução de NO3- é
a nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida (NADH), enquanto que nas algas cianofíceas o
doador é a ferredoxina reduzida (Fd rd). O doador de elétrons fisiológico para a redução do
nitrito a amônia é a ferredoxina reduzina, formada na fase luminosa da fotossíntese. Portanto, a
redução de NO2- a NH3 está diretamente acoplada com as reações luminosas da fotossíntese. A
atividade na nitrato redutase no tecido foliar é induzida pela luz e pelo nitrato e varia em função
do estágio de expansão da folha, sendo máxima quando a folha atinge sua total expansão,
declinando com a maturação ou envelhecimento da folha. Além disso, as variações da atividade
da nitrato redutase durante o ciclo vegetativo têm sido demonstradas em plantas de importância
agrícola como o feijão. A atividade da nitrato redutase pode ser determinada dosando-se o nitrito
formado, através da reação de Griess-Ilosvay (Oliveira, 1999)
Grupo I, Subgrupo IV
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3. Nitrato redutase in vivo nas folhas das plantas
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A enzima Nitrato Reductase é a principal enzima responsável pela assimilação de
nitrogênio pelas plantas e tem a actividade fortemente afectada pela disponibilidade de água no
solo, por isso é usada como variável na avaliação das plantas em diferentes condições
ambientais.
A enzima Nitrato Reductase é a primeira enzima do metabolismo do nitrogénio na
maioria das plantas. Ela reduz o nitrato (NO3-) para nitrito (NO2-). O caminho bioquímico do
nitrato para os aminoácidos é regulado por uma variedade de factores internos e externos, como a
concentração de nitrato, a composição de aminoácidos, a luz, o CO2 e as hormonas da planta
(Salisbury e Ross, 1992).
A redução do nitrato ocorre em duas reacções distintas catalisadas por enzimas
diferentes. A primeira reacção é catalisada pela nitrato reductase, uma enzima que transfere dois
electrões de NADH ou em algumas espécies de NADPH (Salisbury e Ross, 1992).
NO3- + NADH + H+
NR
NO2- + NAD+ + H2O
Para o processo de redução de nitrato a enzima precisa de NADH + H + como um co-factor. Nas
células vivas, o produto (NO2-) está imediatamente reduzido em amónio (NH4+) pela enzima
Nitrito Reductase (NiR) (Salisbury & Ross, 1992).
A actividade da enzima Nitrato Redutase é afectada por vários factores. Nas folhas e
caules, a luz aumenta a actividade da enzima Nitrato Redutase quando NO 3- está disponível. A
luz actuando através da fotossíntese promove a actividade da enzima Nitrato Redutase porque
aumenta o suprimento de carbohidratos e o NADH necessário para a redução de nitrato é
produzido através destes carbohidratos (Salisbury e Ross, 1992).
Tabela 1: Discrição Taxonomica do material em estudo
Categorias
Reino
Divisão
Classe
Ordem
Família
Género
Espécie
Grupo I, Subgrupo IV
Planta 1 (tiririca)
plantae
Magnoliophyta
Liliopsida
poales
Cyperaceae
Cyperus
Cyperis rotundus
Planta 2 (Colonião de tanganica)
plantae
Magnoliophyta
Liliopsida
poales
poaceae
panicum
Panicum maximum jacq
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1.1. OBJECTIVOS
1.1.1. Objectivo geral:
•
Medir a actividade da enzima Nitrato Reductase in vivo nas folhas das plantas
1.1.2. Objectivo específico:
•
Medir a actividade da enzima Nitrato Reductase in vivo nas folhas de Panicum
maximum Jacq. e Cyperis rotundus (ervas daninhas).
•
Determinar a diferenca entre o Nitrato Reductase actual e o Nitrato Reductase Potencial
•
Avaliar a atividade da redutase do nitrato na parte aérea do Panicum sp. Cyperis
rotundus em função das variações de concentração do substrato (NO3-), temperatura
com pH=7 do meio de incubação.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos de enzimologia foram conduzidos no laboratório de Nutrição e
Metabolismo de Plantas, do Departamento de Biologia da UFLA.
Na determinação da atividade da Redutase de Nitrato “in vivo” foram utilizadas folhas de
Panicum sp.. Realizou-se também a determinação da atividade da invertase do fermento.
Otimização das condições de ensaio para a Redutase do Nitrato “in vivo”
Para a otimização da atividade da Redutase do Nitrato foram testados: pH, concentrações
do substrato, temperatura e tempo de reação.
Determinação da atividade da redutase de nitrato “in vivo”, variando-se o pH
Utilizou-se 500mg de folhas frescas de Panicum sp., após retiradas as nervuras centrais e
recortadas em pequenos segmentos (aproximadamente 2mm).
Os tecidos assim preparados, foram colocados em solução-tampão de fosfato de potássio
0,1M, pH 7,5 com o objetivo de manter a enzima ativa; as amostras foram submetidas à
infiltração à vácuo durante 2 minutos (este procedimento foi repetido duas vezes). A seguir, estes
tecidos foram transferidos para frascos de vidro contendo 5mL do meio de incubação constituído
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de tampão fosfato de potássio 0,1M (pH variando de 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10), nitrato de potássio e 1%
de n propanol para facilitar a permeabilidade do nitrato e seguiram para a incubação em banhomaria, a 30 °C com o objetivo de acelerar a reação, sendo agitados, para que se permitisse a
entrada de NO3 e a saída de NO2
MATERIAIS
•
Folhas de plantas herbáceas (Panicum maximum jacq e Cyperis rotundus),verdes frescas
e maduras..
•
Balança electrónica
•
Banho-maria a 30 º C
•
Banho-maria a 100º C
•
Espectofotómetro a 540 nm
•
Cuvetas
•
Medidor de pH
•
Tesouras
•
2 Placas de Petri com tampas (duas por espécie)
•
Papel absorvente
•
40 Tubos de ensaio secos
•
4 Rolhas de borracha de tubo de ensaio
•
Prateleira de tubos de ensaio, para 24 tubos de ensaio em banho-maria
•
3 Chapas de alumínio
•
2 Pipetas de 1ml, 5 ml e 10 ml
•
Papel milimétrico
•
1 Balão volumétrico de 50 ml
•
Proveta medindo 50 ml
•
5 copos de precipitoção de 5 ml
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Soluções
 Médio de Incubação básico
Médio de incubação A
 Reagente 1
Médio de incubação B
 Reagente 2
Solução de Nitrato padrão
NB: As soluções foram preparadas pelos tecnicos de laboratório.
PROCEDIMENTOS
Parte I
1. Levou-se as folhas das espécies Cyperis rotundus e Panicum maximum jacq, de ervas e
enxaguou-se na água da torneira.
2.
Secou-se e removeu-se as nervuras grandes e cortou-se as folhas em pedaços pequenos de
cerca de 0,5 x 0,5 cm. Manteve-se os pedaços de folha até o seu uso em uma placa de Petri
com papel absorvente humedecido de modo à lhes impedir que secassem.
3. Pôs-se 0,2 g (previamente pesados) de pedaços de folha misturados de espécie 1 em tubos de
ensaio A1 e B1. Fez-se o mesmo para a espécie 2 em tubos de A2 e B2.
4. Embrulhou-se os quatros tubos de ensaio em papel de alumínio de modo a impedir que a luz
entrasse. Adicionou-se aos tubos A1 e A2, 5 ml de Meio de Incubação A e no tubo B 1 e B2, 5
ml de Meio de Incubação B. Fechou-se os tubos com rolhas de borracha e colocou-se em
banho-maria à 30ºC.
5. Depois de exactamente 15 minutos, abriu-se os tubos, tirou-se duas amostras de 0,5 ml de
cada tubo de ensaio e fechou-se novamente. Deixou-se no banho-maria.
6. Levou-se as amostras de 0,5ml novamente (em duplicado) de cada tubo de ensaio depois de
exactamente 45 minutos.
7. Depois de levar-se as últimas amostras, pôs-se os tubos, sem rolhas em um banho-maria
fervente durante 2 minutos, removeu-se e levou-se as amostras finais de 0,5 ml (duplicada).
Todas as amostras foram postas em tubos de ensaio limpos e secos. Depois de todas as
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amostras terem sido coleccionadas e postas nos tubos de ensaio, procedeu-se da seguinte
maneira.
Parte II
1. Acrescentou-se primeiro a cada uma das amostras de 0,5 ml 1,5 ml de água destilada.
2. Adicionou-se 1,0 ml de reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem.
3. Adicionou-se 1,0 ml de reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente.
4. Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiental.
5. Mediu-se a absorvância a 540 nm em espectofotómetro. Usou-se como branco 0,5 ml de
meio A ou B (dependendo do tratamento da amostra) com 1,5 ml de água destilada e 1ml
de reagente 1 e 1ml de reagente 2.
Linha de calibração
1. Pipetou-se 5,0 ml da solução de nitrito padrão para um balão volumétrico de 50 ml e
encheu-se a marca com água destilada.
2. Pipetou-se para tubos de ensaio limpos e secos da solução padrão diluindo-se as
quantidades seguintes (tudo em duplicado!): 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 ml
3. Acrescentou-se água destilada a estes tubos para compor um volume de exactamente 2,0
ml.
4. Adicionou-se 1,0 ml do reagente 1 (sulfanilamide) e misturou-se bem.
5. Adicionou-se 1,0 ml do reagente 2 (NED) e misturou-se bem novamente.
6. Deixou-se durante 15 minutos a temperatura ambiente e mediu-se a absorvância a 540
nm em espectofotómetro.
7. Construiu-se a linha de calibração em papel milimétrico, marcando-se todos os pontos
(absorvância no Y-eixo e a quantidade de nitrito no X-eixo) e desenhou-se uma linha
direita ajustando os pontos.
RESULTADOS
Grupo I, Subgrupo IV
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A tabela 02 que vem asseguir e o grafico 01 em anexos, elucidam de maneira resumida
o teor do nitrato (NaNO3-),
apos o tratamento em banho maria fervente a diferentes
temperaturas, verifica-se na temperaura de 30 °c que a maior absorvancia regista-se no tubo A1
que contem no seu interior o tratamento da Folhas da plantas Panicum maximum jacq com um
teor de 0.1,0.5,e 0.57 de absorvancia respectivamente. Apartir deste dado nota-se a folha de
Panicum maximum jacq que contem maior quantidade da enzima nitrato redutase.
Tempo
Temperatura
15 minutos 30ºC
20 minutos 30ºC
2 minutos a 100ºC
e Absorvância a 540 nm
Tubo
A1
0.1
0.5
0.57
Tubo
A2
0.04
0.07
0.1
Tubo
B1
0.12
0.25
0.28
Tubo
B2
0.046
0.13
0.125
Tabela 2. Absorvância à 540 nm
Para o gráfico 02 que vem a seguir representa a absorvência dos primeiros tubos de ensaio e
estão as medias ponderadas.
Grafico 02:absovancia do nitrito padrão
O comportamento da atividade enzimática da redutase do nitrato com o aumento das
concentrações de NO3-, pode ser observado na Figura 2. Diante deste resultado, observou
se que a melhor concentração do substrato foi de na deluição de 0.6ml do nitrato padrão
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aproximadamente 0.43*10-4M. Concentrações maiores de substrato não aumentaram a atividade
da enzima.
Grafico de absorvancia em função da concentração do nitrito padrão
DISCUSSÃO
A planta que tem o NRa actual mais alto é o Panicum maximum. A planta que tem o NRa
potencial mais alto é também o Panicum maximum. Assim, a redução de nitrato em nitrito ocorre
nas folhas, nos caules especialmente durante dias ensolarados. O Panicum maximum que
apresenta maior quantidade de nitrato reductase é provavelmente a relva que tenha maior
quantidade de cloroplastos e que tenha sido exposta à luz. De acordo com Salisbury & Ross
(1985), nos tecidos verdes a luz activa os cloroplastos presentes nos dois fotossintéticas
aumentando o transporte de NO3- armazenado no vacúolo para o citosol onde há indução da NRa.
A luz desactiva a produção de proteínas que inibem a acção de NRa A luz promove a actividade
de NRa porque aumenta o fornecimento de carbohidratos e de NADH necessários para a redução
de NO3.
A diferença entre o Nra (nitrato Redutase) actual e o potencial é a acção da enzima
reductase durante a transformação de nitrato em nitrito. Eles são determinados fazendo a leitura
da média da absorvância para cada tratamento no eixo dos y e faz-se corresponder o valor da
concentração do nitrito no eixo dos x.
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Depois de ferver a amostra final, embora haja algumas variações, a tendência é de
aumentar a absorvância provavelmente porque com o aumento da temperatura haverá um
aumento de citocromo que aumenta a síntese de várias proteínas, incluindo NRa através dos
ribossomas (Salisbury e Ross,1992).
O comportamento da atividade enzimática da redutase do nitrito, aumenta com o aumento
das concentrações do nitrito, Diante diante o resultado, observou-se que a melhor concentração
do substrato foi com o aumento da concentracao do substrato. no estudo do comportamento da
atividade enzimática da redutase do nitrato em Panicum sp, verificou que com o aumento das
concentrações de NO3-, observou-se que a melhor desempenho da enzima nitrato redutase no
substrato foi em concentrações intermédias pois as concentrações maiores de substrato não
aumentaram a atividade da enzima pois os sítios de ligação a partir dessa concentração
possivelmente estavam saturados (Aragão, 2010).
LIMITÇÕES
Uma das maiores limitações que o grupo teve foi no momento da preparação da linha de
calibração pois decoreu um problema na preparação da mesma, não se verificava as cores que
distinguem as diferencas de concentrações dos meios de incubação e para tal tivemos o auxilio
dos tecnicos de laboratório. Devido a este incidente o tempo para terminar a experiência ficou
muito escasso e tivemos de encurtar o tempo de um dos procedimentos, neste caso foi o de
banho maria de 45 min que so foi feito em 20 min.
CONCLUSÃO
O Nitrato Reductase entrou nas células de folha pelas margens cortadas por um processo
de difusão simples. Para facilitar este processo de difusão, foi adicionado n-propanol que tornou
as membranas mais permeáveis para o substrato e o produto (nitrito).
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Pensa-se que o nitrato foi reduzido nas células pela enzima NRa, usando o NADH
disponível nas células quanto mais alto a NRa in vivo, mais nitrato está disponível para as relvas
nas condições naturais. Então, este teste deu uma indicação boa do nitrato disponível na terra,
mas também da capacidade das relvas para absorver nitrato e usá-lo como fonte de nitrogénio.
Plantas com um NRa alto normalmente são plantas Nitrófilas, para qual a maioria das
nossas plantas de colheita pertence. A diferença entre o Nra (Nitrato Reductase) actual e o
potencial é a acção da enzima reductase durante a transformação de nitrato em nitrito.
As condições que favoreceram a atividade da redutase do nitrato em folhas de Panicum
sp e Cyperis rotundus (ervas daninhas), Com um pH=7, foram as concentração elevadas de
NO3-,e temperaturas de 30ºC para cima proporcionaram melhor desempenho da atividade da
enzima nitrato redutase.
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REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
 SALISBURY e ROSS; (1985), Plant Physiology; third edition, Wadsworth Publishing
Company, California, USA.
 SALISBURY e ROSS (1992), Plant Physiology; fourth edition, Wadsworth Publishing
Company, California, USA.
 DELÚ FILHO, N. Efeito do NaNO3 sobre o crescimento e atividade das enzimas de
assimilação do nitrogênio em plantas jovens de seringueira (Hevea brasiliensis). UFLA,
Tese, 87p. , 1994.
 DELÚ FILHO, N. Efeito do N-NO3 sobre o crescimento e atividade das enzimas de
assimilação do nitrogênio em plantas jovens de seringueira (Hevea brasiliensis). UFLA,
Tese, 87p. , 1994.
 LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L. e COX, M. M. Principles of Biochemistry. 2ed.
Worth Publishers. 1013p.
 OLIVEIRA, D. P.. Variação sazonal da produção de borracha e da atividade da invertase
nos clones RRIM-600 eGT-1 de seringueira (Hevea brasiliensis)UFLA, Dissertação,71p,
1999.
 STRYER, L.. Bioquímica. 4º ed. Guanabara-Koogan. 1000 p..
 http://www.ciagri.usp.br/~luagallo/Enzimas2.htm
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ANEXOS
Grafico 1: absorvancia a (540 nm) dos tratamentos em diferentes meios de incubação
Tabela 3: Linha de calibração
Volume de Nitrito de Sodio (ml)
volume de Nitrito de Sodio no final
0.0
2.0
0,2
1.8
Concentração de Nitrito de Sodio no
final (1x 10-4 M)
0.0
0,11 0,25 0,43 0,67 1.0
Absorvância (NO2)
Médi
a
0,4
1.6
0,6
1.4
0,8
1.2
0.04 0.39 0.61 0.8
1.0
1
1.0
1.2
Tabela 4: absorvancia de linha de calibracao
Observação em tubos de ensaio com as concentracoes
Concentração do nitrito
padrão
0
Absorção
0.04
Grupo I, Subgrupo IV
0.2
0.39
0.4
0.61
0.6
1.2
0.8
0.1
1
0.046
13