Tecnologie avanzate per la diagnosi prenatale non invasiva di malattie genetiche e cromosomiche e per la predittività delle complicanze nella gravidanza

1. Contributi Regionali alla Ricerca
Sanitaria Nazionale
Programma strategico- Area tematica 4-
Salute della donna-area materno-infantile anno 2007
Tecnologie avanzate per la diagnosi prenatale
non invasiva di malattie genetiche e
cromosomiche e per la predittività delle
complicanze nella gravidanza
Destinatario Istituzionale: Piemonte
Tullia Todros Responsabile Scientifico del Progetto Capofila
Gabriella Restagno
Torino, 22 gennaio 2008

2. Unità operative del progetto strategico
direttamente coinvolte dal Piemonte
Prog. 1- Early markers predictive of pregnancy
complications (UO1, coordinatore,UMF) and new
technology for non-invasive prenatal diagnosis of
aneuploidies (UO2, S.S. Diagnosi e Consulenza
Genetica)
Prog. 2- Identification of inflammation markers as early
indicators of pregnancy complications (Dipartimento
Medicina Sperimentale, Università “La Sapienza”, Roma)
Prog. 3- Advanced genomic technologies for non-
invasive prenatal diagnosis of genetic diseases and
monitoring of pregnancy complications (Unità di
Genomica, Fondazione Centro San Raffaele del Monte
Tabor, Milano)

3. Progetti strategici 2007 accorpati a livello
nazionale con capofila il Piemonte
Development of a method for non invasive prenatal diagnosis of
genetic disorders and its transfer into the national health
system (Regione Sardegna)
A new protocol for prenatal diagnosis (Regione Toscana)
Analysis of the results from 30 years experience of prenatal
diagnosis for genetic anomalies as a basis for the development
and validation of innovative diagnostic protocol (Regione
Liguria)
Harmonization of prenatal diagnosis, genetic counselling and
development of an original tool for recovery of foetal cells from
the maternal blood based on a microelectronic chip tecnique
(IRCCS S. Giovanni Rotondo)
Development of guidelines for offering tests in pregnancies at
risk: implementation of processes of evaluation of genetic tests
(Regione Emilia-Romagna)

4. Prog 1 – UO1: Marcatori precoci di
complicanze della gravidanza
PREECLAMPSIA E IPOSVILUPPO FETALE
La preeclampsia (PE) colpisce il 5-8% delle donne
gravide e rappresenta una delle principali cause
di mortalità e morbilità materna, di mortalità e
morbilità perinatale e di esiti neurologici dovuti a
fetal growth restriction (FGR) e/o parto
pretermine.
Non esistono ad oggi possibilità di prevenzione e
terapia efficaci, se non l'espletamento del parto;
ciò riflette il fatto che l'eziologia della PE non è
nota e molti aspetti della sua patogenesi devono
essere ancora chiariti.

5. INFIAMMAZIONE/INFEZIONE
I patogeni più probabilmente implicati sono quelli
coinvolti nelle patologie cardiovascolari, come
l'Helicobacter pylori, associato a danno
endoteliale e attivazione piastrinica.
L'infezione da H.pylori è più frequente nelle donne
affette da PE che nei controlli [Todros T et al.
Expert Rev Obstet Gynecol 2007]. Ipotizziamo
che anche altre infezioni possano avere un ruolo
eziologico.
Marker generico di infiammazione/infezione:
EPCIDINA

6. OBIETTIVI UO1 (UMF)
Verificare, mediante uno studio
prospettico, se la rilevazione di infezione
da Helicobacter pylori ed il dosaggio di
epcidina nel corso del I trimestre di
gravidanza possano essere utilizzati come
test di screening per identificare un
gruppo di gravide ad elevato rischio di
sviluppare preeclampsia (PE) e/o
restrizione di crescita fetale (FGR, Fetal
Growth Restriction).

7. TEMPI DI SVILUPPO DEL
PROGETTO 1
Gantt Diagram PROJECT 1 (Coordinator)
months
0 3 6 9 12 15 18 21 24
Recruitment of patients and data collection
Collection, processing and storage of samples
Optimization of quantitative immunoenzimatic tests
Serological tests
Collection of follow-up data
activities
Data analysis
Recruitment of patients and data collection
Collection and processing of blood samples
Fetal DNA extraction from maternal plasma
Optimization of methods
Collection of follow-up data
Quantification of paralogous sequence for fetal aneuploidy detection
Data analysis
UO1 UO2

8. UO2: Perché la DP non invasiva
Le aneuploidie sono l'indicazione maggiore alla diagnosi
prenatale invasiva. La DP invasiva ha un rischio di
aborto di circa 1% ed è eseguibile solo in Centri di
ecografia prenatale specializzati e collegati a laboratori
specialistici di Genetica e Citogenetica.
Recentemente approcci alternativi a tale diagnosi (come
l’analisi del DNA fetale nel plasma materno) dimostrano
che in un futuro prossimo potranno essere applicati, in
casi selezionati, in luogo del prelievo di villi coriali o
dell'amniocentesi.
Soprattutto nelle situazioni in cui il rischio di aneuploidia
è trascurabile, sarebbe un enorme vantaggio per la
salute materno-fetale avere a disposizione tecniche di
diagnosi non invasiva che abbiano elevata affidabilità.

9. Le tecnologie di routine di diagnosi citogenetica e sul DNA in DPN invasiva
non sono attualmente trasferibili alla DPN non invasiva
DPN
invasiva
Sequenza del DNA
QF-PCR Cariotipo

10. Problematiche della DPN non invasiva
Il DNA libero fetale nel plasma materno ha una
concentrazione bassa (0,4%): è necessaria una
ottimizzazione della separazione e concentrazione
del DNA libero fetale
Necessità di aumentare la concentrazione del DNA
fetale (diminuire il background materno) in
abbinamento a metodiche di rivelazione sensibili, ad
elevata produttività e costi accessibili

11. La DPN non invasiva: stato dell’arte
Lo YM et al. Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal
aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in
maternal plasma. PNAS, 2008 Dec 23,105(51):20458-63
Quake SR et al. Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by shotgun
sequencing DNA from maternal blood PNAS, 2008 Oct
21,105(42):16266-71
Holzgreve W et al. Isolation of serum nucleic acids for fetal DNA
analysis: comparison of manual and automated extraction methods.
Prenat Diagn. 2008 Dec;28(13):1227-31
Chitty LS et al. SAFE-The Special non- invasive Advanced in Fetal and
Neonatal Evaluation network: aims and achievements. Prenat Diagn.
2008, Feb 28(2):83-8
Rouillac-Le Sciellour C. Noninvasive fetal RHD from maternal plasma.
Use of a new developed free DNA fetal Kit RhD. Tranfus Clin Biol. 2007
Dec,14(6).572-77
Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase
chain reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-
thalassemia Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14

12. OBIETTIVI UO2 (S.S.Diagnosi e
Consulenza Genetica)
Valutare la fattibilità della diagnosi
prenatale (DPN) non invasiva
mediante l’analisi quantitativa di
sequenze paraloghe di origine fetale
nel plasma materno con metodiche
di real-time PCR

13. UO2, Dati preliminari: Sensibilità di PSQ96
Dati preliminari di
sensibiltà del metodo
(UO2):
diluizioni in serie di un allele
mutato in eterozigosi (5-10
pg) in presenza di Dna wild-
type (40 ng)/ il limite di
detection è 5 pg (un genoma-
equivalente corrisponde a 6,6
pg di DNA che è il contenuto
di una cellula diploide
Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase
chain reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-
thalassemia Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14

14. UO2, Dati preliminari: aumento della
sensibilità con PNA
Cremonesi L. et al. Peptide-nucleic acid-mediated enriched polymerase chain
reactionas a key point for non-invasive prenatal diagnosis of beta-thalassemia
Haematologica. 2008 Apr ,93(4):610-14

15. Geni paraloghi del cromosoma 21
21
22
15 5 8
6
11
Processed
18
9
7
Genomic
14
Duplication
X
10 2
20 1
19
12
13

16. Quantificazione di geni paraloghi
Test gene gtgactattgtttatttttaaTgggtatttcaga
|||||||||||||||||||||
||||||||||||
Gene paralogo
gtgactattgtttatttttaaCgggtatttcaga
TC TC T C
RATIO 1:1 RATIO 3:2 RATIO 1:2
NORMALE TRISOMIA DELEZIONE di UN CROMOSOMA
= e.g. cromosoma 21

17. Risultati preliminari
Trisomy Chromosome allele: A
Control Chromosome allele: T
A/T ratio (%)
49.6/50.4
A/T ratio (%)
60.4/39.6 = TRISOMY
Courtesy S. Deutsch

18. Grazie per l’attenzione e grazie per
l’entusiasmo nell’avvio del Progetto a:
Dario Roccatello, CMID
Simona Cardaropoli, UMF
Luca Sbaiz, SS Diagnosi e Consulenza Genetica, OIRM-
S.Anna
Guglielmo Bracco, Dipartimento di Diagnostica, OIRM-
S.Anna
Elsa Viora e collaboratori, Centro di Ecografia e Diagnosi
Prenatale, OIRM-S.Anna
Samuel Deutsch, Università di Losanna, Svizzera
Laura Cremonesi, Fondazione Centro San Raffaele del
Monte Tabor