Patologia GáStrica
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O documento discute a metaplasia e o gene CDX2 no contexto do cancro gástrico. Apresenta várias técnicas como imunohistoquímica, imunofluorescência e RT-PCR usadas para detectar a presença de metaplasia intestinal e a expressão do gene CDX2 em amostras de tecido gástrico. Discute também o papel da bactéria H. pylori na indução da metaplasia e subsequente desenvolvimento de cancro gástrico.
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- 1. PATOLOGIA GÁSTRICA METAPLASIA E CDX2 Ana Mariz 27 Julho – 7 Agosto 2009 Cláudia Correia
- 2. Tipo difuso Tipo intestinal Aproximadamente 95% dos casos são esporádicos «Já estávamos contentíssimos com a repercussão do trabalho e tivemos agora a cereja em cima do bolo.»
- 3. Cancro gástrico do tipo difuso – tem tendência para se estender por outras regiões
- 4. Cancro gástrico do tipo intestinal
- 5. PORTUGAL 80% Têm a bactéria 30% Robin Warren e Barry Marshall Apresenta metaplasia intestinal 7% Desenvolve cancro gástrico
- 6. H.pylori consegue desenvolver-se A urease converte ureia em amoníaco e graças à enzima urease dióxido de carbono Do amoníaco resulta um género de auréola que cria um micro ambiente favorável à bactéria http://www.sumanasinc.com/scienceinfocus/helicobacter/helicobacter_fla.html A bactéria desloca-se com a ajuda da sua “cauda” Liberta compostos que causam a Propulsiona-se através do muco que protege as célulasdeteorização das células epiteliais do estômago Agrega-se às células epiteliais e usa a urease para desacidificar o micro ambiente destas
- 7. Aparecimento de células intestinais ao nível de tecido gástrico Fase que antecede o cancro e resulta da inflamação das células devido à presença de H.pylori
- 8. Gene que normalmente se expressa apenas em células intestinais Factor de transcrição intestinal Expressão anormal no estômago - metaplasia intestinal
- 9. Estudo da expressão do CDX2 ao nível de mRNA e proteína em tecidos gástricos e em linhas celulares de carcinoma Técnicas utilizadas Imunohistoquímica RT-PCR Imunofluorescência
- 10. Método Directo Método Indirecto Interacção anticorpo antigénio Utilização de anticorpo Utilização de um só primário e anticorpo anticorpo secundário Permite determinar a presença de proteínas Maior Amplificação do sinal
- 11. • Desparafinação e hidratação • Fixação • Recuperação antigénica • Bloqueio da peroxidase endógena • Soro Normal • Anticorpo primário • Anticorpo secundário biotinilado • Anticorpo Secundário conjugado com FITC • Sistema de Amplificação ABC • Substracto cromogénico • Contraste nuclear • Desidratação • Montagem Vectashield • Montagem Entellan Resultados
- 12. Antes de começar a técnica de RT-PCR o RNA tem que ser extraído. As principais etapas são: Centrifugação • Provoca a lise Clorofórmio • Usado para celular e é inibidor precipitar o RNA de RNAses • Separa as 3 fases: aquosa – RNA; interfase – DNA; orgânica - proteínas TRI reagent Isopropanol Deixa-se secar para completa evaporação de resíduos indesejáveis e, após a resuspensão, congela-se para depois ser usado para a técnica de RT-PCR.
- 13. Mostra alguma degradação do RNA Bandas de RNA
- 14. O RT-PCR utiliza RNA que, com a ‘ajuda’ da enzima transcriptase reversa, vai originar uma cadeia de DNA complementar, o cDNA. Esta técnica baseia-se nos seguintes passos: 1. Num eppendorf junta-se: RNA RH Água RT Buffer – solução “tampão” RNAse out DTT 2. Vai para o termociclador onde a enzima vai originar cDNA a partir do RNA.
- 15. O PCR é um método de amplificação do DNA obtido na técnica anterior, o RT-PCR. Buffer “solução tampão” Cloreto de cDNA magnésio MgCl2 Eppendorf Enzima Taq dNTPs polimerase Primer Primer reverse forward
- 16. Leva-se ao termociclador onde vai ser submetido a diversas temperaturas: 95ºC Desnaturação e separação da molécula de DNA em duas cadeias simples 52ºC Cada primer liga-se a uma das cadeias, um no inicio (primer forward) e o outro no final (primer reverse) 72ºC Temperatura óptima para a enzima actuar e sintetizar as cadeias complementares das duas simples existentes Ao fim de 25/35 ciclos obteve-se uma replicação exponencial das cadeias de DNA. O produto foi visto após realizar a técnica de electroforese em gel de agarose.
- 17. Imunohistoquímica e Imunocitoquímica Imunofluorescência PCR Extracção de RNA
- 18. Metaplasia Intestinal Tecido intestinal
- 19. AGS MKN45 GP202 Controlo Negativo
- 20. AGS HeLa
- 21. GAPDH CDX2 Bandas inespecíficas
- 22. • O estudo da metaplasia é essencial para a compreensão do cancro gástrico. • Não se pode ignorar o papel do gene CDX2 e da sua proteína como localizadores de metaplasia. • Utilizando técnicas como a imunohistoquímica, a imunofluorescência e o RT-PCR/PCR é possível detectar a existência ou não de metaplasia num determinado tecido. Esta experiência foi bastante enriquecedora uma vez que contribuiu para a nossa cultura cientifica e fez-nos despertar para a importância da investigação.