1. CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES
D’ANALYSES SUR
LES PRODUITS
LAITIERS

2. LABORATOIRE
DÉPARTEMENTAL
VÉTÉRINAIRE DU
FINISTÈRE
• Création en 1961
• Accrédité COFRAC
• Une centaine d’employés
• Locaux de 4300m2

3. LES DIFFÉRENTS SECTEURS
D’ACTIVITÉ
• Santé Animale
• Microbiologie des aliments et de l’eau
• Chimie Alimentaire, eau, environnement
• Administratif

4. LE SERVICE
CHROMATOGRAPHIE
Analyses pour la qualité des :
• Eaux naturelles et de
traitement
• Animaux d’élevage
• Produits laitiers
Les principaux clients :
• DDASS
• DSV
• Industriels privés

5. ANALYSES SUR LES
PRODUITS LAITIERS
• Teneur en eau
• Matière sèche non grasse
• pH
• Acidité oléique
• Indice de peroxyde
• Dosage carotène, acide énantique, sitostérol

6. LES TRACEURS DANS LES
PRODUITS LAITIERS
• La CE vend des produits à prix réduits
• Marque de reconnaissance : ajout de traceurs
• Il existe 2 catégories :
 Chimique : acide énantique (B0)
sitostérol (B1)
 Physique : vanilline (A0)
carotène (A2)

7. LES MÉTHODES
D’ANALYSES
ÉTUDIÉES

8. DOSAGE DU CAROTÈNE
•
Détermination de la pureté du carotène
• Gamme d’étalon
• Mesure des échantillons par un spectrophotomètre à
440nm

9. PRINCIPE DU DOSAGE
• Mesure de l’absorbance
• Loi de Beer Lambert :
A=ElC
Avec E le coefficient d’extinction

10. DOSAGE DE LA VANILLINE
Principe :
• Extraction
• Détermination
RP-HPLC
Conditions chromato :
 Pompe : débit 1.0mL/min
 Injecteur : 20µL
 Détecteur : UV à 306nm
 Colonne : RP18
(merck 5µm)
 Phase mobile : eau
(dont 3%acide acétique)
-méthanol (70:30, v/v)

11. PRINCIPE DE LA HPLC
• Séparation des
constituants
d’un mélange

12. LES DIFFÉRENTS TYPES DE
HPLC
1 - chromatographie d'adsorption
2 - chromatographie de partage
(en phase directe(2A) ou
inverse(2B))
3 - chromatographie d'échange
d'ions (+ chromatographie
ionique)
4 - chromatographie de paires
d'ions
5 - chromatographie d'exclusion
6 - chromatographie d'affinité
7 - chromatographie adaptée à la
séparation d'énantiomères

13. HPLC en phase inversée
• En phase inverse l’éluant est plus polaire
que la phase stationnaire
• Donc silice greffée dans la colonne

14. PHASE MOBILE
Deux possibilité :
Gradient d’élution : variation de la
concentration de l’éluant
(utilisé pour les mélanges complexes)
Mode isocratique : concentration constante

15. VALIDATION ET
CARACTÉRISATION
DE MÉTHODES

16. • Méthode validation basée sur
la Norme XPT 90-210 AFNOR de décembre 1999
« Protocole d’évaluation d’une méthode alternative
d’analyse physico-chimique quantitative par rapport à
une méthode de référence »
• Trois plans à suivre de type A, B et C

17. PLAN DE TYPE A
Il permet de caractériser :
La linéarité
La limite de quantification
La limite de détection

18. LA LINÉARITÉ
• Connaître jusqu’où la mesure est linéaire
• Caractérisation de l’étalonnage
• Réalisation d’un plan à 5 niveaux de concentration
et 5 répétitions
• Vérification par des calculs statistiques

19. LIMITES DE
QUANTIFICATION ET DE
DÉTECTION
• Il existe 3 méthodes :
 Issue de l’étude de la linéarité
 Issue de l’étude du blanc de matrice
 Par vérification d’une limite choisie :
Une concentration choisie
10 prises d’essais identiques
Dans des conditions de répétabilité
Vérification par calculs statistiques
• Limite de détection = LQ/3

20. PLAN DE TYPE B
• Il permet de contrôler les effets de la matrice sur la
mesure
• Réalisation d’ajouts dosés
• Vérification de la présence d’interférences
• C’est la spécificité de la méthode

21. PLAN DE TYPE C
• Il permet d’estimer la répétabilité et la justesse de
la méthode
• Comparaison
méthode de référence/méthode alternative

22. LA CARACTÉRISATION
• Valider une méthode de référence
• Les étapes à suivre :
 Linéarité
 Limites de détection et de quantification
 Répétabilité et reproductibilité
• Les facteurs étudiés dépendent de la manipulation

23. APPLICATIONS

24. LE CAROTÈNE
• La linéarité de
l’appareil:
Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par
spectroscopie
1,000
Gamme d’essais de 0.55
à 2.75 µg/mL en
étalon de carotène
0,900
0,800
Absorbance
0,700
0,600
y = 0,3061x
R2 = 0,9977
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
0,5
1
1,5
Concentration A2 (µg/mL)
La linéarité est validée
2
2,5
3

25. •
Limites de détection et de quantification :
1) Essais à 0.1µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.2µg/mL
Limite de quantification à 0.2µg/mL validée
Limite de détection est 0.067µg/mL

26. • Répétabilité :
Etude de la linéarité des traceurs A2 dans le beurre par
spectroscopie
10 mesures avec des
ajouts de 21µg de
carotène dans le
beurre non tracé
• Linéarité de la
manipulation :
Gamme de 0.55 à 2.75
µg/mL par ajouts
1,100
1,000
0,900
0,800
0,700
Absorbance
Rendement de 99%
1,200
0,600
y = 0,334x
R2 = 0,9369
0,500
0,400
0,300
0,200
0,100
0,000
0
0,5
1
1,5
Concentration A2 (µg/mL)
2
2,5
3

27. LA VANILLINE
Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par
chromatographie
•Linéarité de l’appareil:
1500000
Aire du pic
Gamme d’étalons de 0.25
à 2 µg/mL
2000000
1000000
y = 819571x
R2 = 0,9901
500000
0
0
La linéarité est validée
0,5
1
1,5
Concentration A0 (µg/mL)
2
2,5

28. •
Limites de détection et de quantification :
1) Essais à 0.2µg/mL
Limite non vérifiée
2) Essais à 0.25µg/mL
Limite de quantification à 0.25µg/mL validée
Limite de détection est 0.083µg/mL

29. Etude de la linéarité des traceurs A0 dans le beurre par
chromatographie
2000000
y = 610624x
R2 = 0,9712
1500000
Aire du pic
• Répétabilité et
reproductibilité :
10 échantillons mesuré
avec 2 répétitions pour
une concentration de
0.5µg/mL
Rendement de 107%
• Linéarité de la
manipulation :
Gamme de 0.25 à 2 µg/mL
avec des ajouts dans le
beurre
1000000
500000
0
0
0,5
1
1,5
Concentration A0 (µg/mL)
2
2,5

30. CONCLUSION
Les méthodes d’analyses du carotène et de la
vanilline sont caractérisées