1. CÈL·LULES MARE
PLURIPOTENTS I MEDICINA
REGENERATIVA
Begoña Aran
Banc de Línies Cel·lulars
Centre de Medicina Regenerativa de Barcelona

2. CÉLULAS MADRE
Se trata de células indiferenciadas que se
han localizado en la masa celular interna del
blastocisto, en algunos tejidos fetales, en el
cordón umbilical y la placenta y en varios
tejidos adultos.
Son células pluripotentes (o en algunos casos
totipotentes) que dan lugar a células y
tejidos especializados.
Su utilidad estriba en la utilización para
tratamientos de patologías con pérdida de
función celular

3. Células madre embrionarias: autorenovación y pluripotencialidad
Division Autorenovación Diferenciación
asimétrica

4. CELULAS PLURIPOTENTES
• Células madre
• CM embrionarias
• CM fetales
• CM adultas
• Células pluripotencia inducida (iPS)

5. Pluripotency

6. células madre adultas
• son células indiferenciadas que se hallan
en tejidos adultos diferenciados y que
son capaces de renovarse a sí mismas y
diferenciarse en todos los tipos celulares
del tejido del que provienen.
• algunas pueden ser pluripotentes.
• se encuentran en hígado, médula osea,
pancreas, piel, cerebro, sangre…

7. células madre
adultas
su frecuencia es baja, son difíciles de
identificar y purificar, su proliferación es
limitada y son difíciles de mantener en
un estado indiferenciado.

8. células madre fetales
• se trata de tipos celulares primitivos que se
hallan en el feto y que pueden desarrollarse
en células madre neuronales, células madre
hematopoyéticas (cordón umbilical y
placenta), progenitores
de islotes pancreáticos.

9. células madre embrionarias
son las que derivan de la
masa celular interna
(MCI) de un blastocisto
(día +5/6 de desarrollo,
± 150 células). Las
células de la MCI dan
lugar a las 3 líneas del
embrión: ectodermo,
mesodermo y
MCI
endodermo.

10. In vivo
In vitro

11. Modelo de enfermedades Estudio del desarrollo y
y desarrollo de fármacos organogénesis
Terapia celular

12. ENFERMEDADES CON PÉRDIDA DE FUNCIÓN
CELULAR POTENCIALMENTE TRATABLES
MEDIANTE TERAPIA BASADA EN CM
Alteraciones neurodegenerativas
Accidentes vasculares
Lesiones medulares
Fallo cardíaco
Diabetes mellitus

13. Derivación células madre embrionarias
• Descongelación de los embriones (centros RA)
• Cultivo embrionario*
los embriones en distinto estadío embrionario deben
cultivarse hasta blastocisto
* Deben seguirse los protocolos utilizados en el laboratorio de FIV.

14. Derivación células madre embrionarias
Cultivo hasta
Descongelación
blastocisto
embriones
D+5/6
Eliminación de la Eliminación del
zona pellucida trofectodermo
- 5mg/ml pronasa
- Ac. Tyrode’s
Monocapa de fibroblastos humanos
(HFF-1) irradiados
(CCD1112SkATCC), en placas
cubiertas de gelatina (0.1%)
Feeders cells

15. Derivación células madre embrionarias
Siembra y cultivo del blastocisto o
MCI sobre monocapa de
fibroblastos humanos (HFF-1)
irradiados, en placas cubiertas de
gelatina (0.1%)
CULTIVO
KO-DME Medium supplementado con:
2 mmol/l Glutamax
0,05 mmol/l 2-mercaptoethanol
8 ng/ml basic fibroblast growth factor (FGF)
1% non-essential amino acids
20% KO-Serum Replacement
0,5% penicillin-streptomycin

16. Derivación ES[2]
p0 d4 (10x) p0 d7 (20x) p0 d9 (20x)
p0 d12 (10x) p1 d2 (4x) p1 d6 (4x)

19. Células somáticas de pluripotencia
inducida (IPS)
• Paciente-compatible Fibroblastos
• No problemas éticos
• Disponible en humanos
• Pluripotentes
Integración
• Integración medianter vector
(virus) genes (virus)
• Segura? Activación oncogenes,
transmisión línea germinal?
Células
ES-like
Takahashi et al., 2007
Nakagawa et al., 2007
Park et al., 2007

20. Método reprogramación
Lentivirus/retrovirus mediated reprogramming methods are still
major approaches for generation of iPS

21. Modeling human disease with iPS cells

22. Modeling human disease with iPS cells

23. Modeling human disease with iPS cells

24. Modeling human disease with iPS cells

25. Modeling human disease with iPS cells

28. Caracterización
Fosfatasa Actividad
alcalina Telomerasa
Inmunocitoquimica
Immunocitoquimica
para marcadores de
para marcadores de
pluripotencialidad
diferenciación In
vitro
Formación de
cariotipo cuerpos
embrioideos
Inmunohistoquímica
para marcadores de
Microsatélites & HLA
diferenciación In vivo
(formación teratomas)

30. DIFERENCIACIÓN
Proceso mediante el cual
una célula madre
indiferenciada se
transforma en células
especializadas
(diferenciadas) de un
determinado tipo celular.

31. DIFERENCIACIÓN
• Cambios en la expresión de genes mediante
mecanismos epigenéticos
• Cambios fisiología: tamaño, forma, polaridad, actividad
metabólica…
• capacidad proliferativa diferenciación
c.madre c precursora c. diferenciada

32. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vitro
3 líneas germinales:
- Ectodermo: neuronas
- Mesodermo: cardiomiocitos
- Endodermo: tejido glandular
Embryoid bodies

33. 3 days in suspension in differentiation media
Ectodermo Endodermo Mesodermo
DMEM/F 12 KO DMEM KO DMEM
Neural basal medium FBS FBS
N2 Glutamax Glutamax
B27 Amino acidos no-esenciales Amino acidos no-esenciales
Glutamax P/S P/S
P/S β-mercaptoetanol β-mercaptoetanol
Ac. Ascórbico 0,5 mM
PA6 Gelatine
14-16 days 15-20 days

34. Diferenciación in vitro
Ectodermo: beta-tubulina

35. Diferenciación in vitro
Mesodermo: alfa-actinina y GATA4

36. Diferenciación in vitro
Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2

37. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Teratomas Ratones SCID de 8 semanas
1millón células
• intramuscular
• subcutáneo
• en algunos órganos
2 meses

38. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo
Mesodermo (Cartilago) Endodermo (epitelio
respiratorio)
Endodermo (epitelio respiratorio)
Mesodermo (Cartilago)

39. CARACTERIZACIÓN: Diferenciación in vivo

40. Diferenciación in vitro
Ectodermo: beta-tubulina

41. Diferenciación in vitro
Mesodermo: alfa-actinina y GATA4

42. Diferenciación in vitro
Endodermo: Alfa-feto proteina y FOXA2

46. Diferenciación de las CME
• ADIPOCITOS • PRECURSORES LINFOCITOS
• ASTROCITOS • MASTOCITOS
• CARDIOMIOCITOS • NEURONAS
• CONDROCITOS • OLIGODENDROCITOS
• CÉL. HEMATOPOYÉTICAS • OSTEOBLASTOS
• CÉL. DENDRÍTICAS • ISLOTES PANCREÁTICOS
• CÉL. ENDOTELIALES • MÚSCULO LISO
• KERATINOCITOS • MÚSCULO ESTRIADO
• HEPATOCITOS • TROFECTODERMO
• GAMETOS

47. • Banqueo
• Registro en el Banco Nacional de Líneas
Celulares

49. Criterios mínimos
• Consentimiento informado
• Trazabilidad
• Aprobación Comité Ética
• Datos derivación (origen, métodos, etc)
• Disponibilidad
• Cariotipo
• Modificación genética
• Marcadores celulares de pluripotencia
• Diferenciación a las 3 líneas germinales (in vitro y/o in vivo)

50. Terapia celular en medicina regenerativa
Trasplante de células diferenciadas , obtenidas
a partir de CM, destinado a reparar tejidos en
los que se ha perdido la funcionalidad.

51. Terapia celular con CMP
hacia la aplicación clínica:
PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-transplante
• Aspectos metodológicos

52. PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-transplante
• Aspectos metodológicos

53. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO
Como evitarlo?
• iPS
• Uso de fármacos inmunosupresores
• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM
• Inducción de inmunotolerancia: administración
previa de material embrionario o hematológico del
donante
• CM procedentes de embriones clonados
mediante transferencia nuclear

54. TERAPIA CON CME Y RECHAZO INMUNOLÓGICO
Como evitarlo?
• iPS
• Uso de fármacos inmunosupresores
• Uso de células HLA compatibles: bancos de CM
• Inducción de inmunotolerancia: administración
previa de material embrionario o hematológico del
donante
• CM procedentes de embriones clonados
mediante transferencia nuclear

56. Stojkovic et al, 2005

58. PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-trasplante
• Aspectos metodológicos

59. PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-transplante
• Aspectos metodológicos

60. PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-transplante
• Aspectos metodológicos

61. Funcionalidad y viabilidad post-
trasplante
• Es necesaria la integración y realización de
conexiones necesarias para restablecer la
funcionalidad del órgano.
• Estudio mecanismos control del crecimiento,
migración, destino y diferenciación celular
• Estudios de restauración de la funcionalidad
en modelos animales
• Órgano: varios tipos celulares

62. Estudios funcionalidad
• Páncreas endocrino, ratones diabéticos. Soria, 2000;
Kroon, 2008.
• Neuronas, enfermedad de Parkinson. Sonntag, 2007; Cho,
2008.
• Precursores neuroectodérmicos, lesiones medulares.
Cummings, 2005; Keirstead, 2005; Nakamura, 2005;
Kumagai, 2009.
• Precursores miocárdicos, accidentes vasculares. Kehat,
2004; Menard, 2005; Laflamme, 2007; van Laake, 2009.
• Epitelio pigmentado de retina. Retinitis pigmentosa. Idelson,
2009.
• Neuronas estriadas. Enfermedad de Huntington. Aubry,
2008.

63. PROBLEMAS TÉCNICOS
• Rechazo inmunológico
• Formación de tumores
• Optimización de protocolos de diferenciación y
purificación
• Funcionalidad y viabilidad post-transplante
• Aspectos metodológicos

64. Aspectos metodológicos
• Estandarización protocolos: procedencia material,
métodos de cultivo, preparación, almacenaje,
banqueo, transporte.
• Eliminación xenobióticos
• Condiciones GMP
• Control de calidad
• Supervisión por comités externos de protocolos y
ensayos clínicos. Valoración riesgos.
• Consentimiento informado
ISSCR: guidelines for clinical translation of stem cells.
http://www.isscr.org/clinical_trans/pdfs/ISSCRGLClinicalTrans. pdf

65. Primeros ensayos clínicos
• Geron corp.: Oligodendrocitos
derivados de CME, lesionados
medulares
• Advanced Cell Technologies: Epitelio
pigmentado de retina derivado de
CME, distrofia macular de
Stangerdt’s.

66. Moltes gràcies per la vostra atenció
baran@cmrb.eu