Le diagnostic biologique du paludisme par microscopie - Conférence du 6e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - MENARD Didier - Madagascar - dmenard@pasteur.mg

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LE DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
DU PALUDISME PAR
MICROSCOPIE
6ème édition de l’Atelier Paludisme
Session 2008
17 Mars au 18 Avril 2008
Dr Marie Ange Rason - Dr Didier Ménard
Unité de Recherche sur le Paludisme
Institut Pasteur de Madagascar

2. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
DU PALUDISME
Il comprend plusieurs étapes
- ETAPE 1-
Prélèvement du malade
- ETAPE 2-
Préparation et coloration de la goutte épaisse et du frottis mince
- ETAPE 3-
Examen de la goutte épaisse à la recherche des parasites du
paludisme
Si la recherche est négative : Conclure par « Examen négatif, Absence de
Plasmodium »
Si la recherche est positive, passer à l’étape 4
- ETAPE 4-
Identification des espèces de Plasmodium sur la goutte épaisse
et le frottis mince
- ETAPE 5-
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte épaisse (si il y a peu
de parasites) ou sur le frottis mince (si il y a beaucoup de parasites)
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3. ETAPE 1
Prélèvement du malade
Matériel nécessaire
 Lames de verre propres
 Lancette stérile
 Méthanol ou Ethanol
 Coton hydrophile
 Crayon gras ou stylo graveur
Méthode
 Chez les enfants et adultes, la
piqûre se fait au niveau du 3ème
ou 4ème doigt de la main gauche,
sur le côté qui est moins sensible
que le bout du doigt
 Chez les nourrissons de moins de
6 mois, la piqûre se fait au niveau
du talon ou du gros orteil.
 Nettoyer l'endroit choisi d'abord
avec un tampon de coton imbibé
d'alcool, puis avec un tampon sec
pour enlever toute trace d'alcool.
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4.  Piquer d'un coup sec et rapide.
 Essuyer la première goutte de
sang avec un tampon de coton
sec
 De la main droite : prendre une
lame
en la tenant par les bords.
De la main gauche : presser le
doigt piqué pour faire sortir une
goutte de sang.
 Prendre une 2ème lame et
recueillir une seconde goutte de
sang en la mettant délicatement
en contact avec une extrémité de
la lame
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5. ETAPE 2
Préparation et coloration de la goutte épaisse et
du frottis mince
Préparation de la goutte épaisse
 Faire un étalement épais, au centre de la lame.
 Étaler le sang avec le coin d'une lame propre jusqu'à épaississement uniforme.
 Les étalements trop minces ou trop épais ne se colorent pas bien.
 Au bout de la lame, inscrire au crayon gras le numéro du malade.
 Laisser sécher à l'air pendant au moins 10 minutes, par exemple sur un plan
de travail ensoleillé, à condition de protéger l'étalement contre les mouches et
la poussière.
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6. Préparation du frottis mince
 Tenir la lame d'une main. De l'autre, poser le bord de la lame rodée juste en
avant de la goutte de sang.
 Faire glisser la lame rodée jusqu'à ce qu'elle touche la goutte de sang.
 Laisser le sang se répartir tout le long du bord de la lame rodée.
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7.  Pousser la lame rodée jusqu'au bout de la lame d'étalement, d'un mouvement
doux et régulier (tout le sang doit être réparti avant que l'on atteigne le bout de
la lame.
 Vérifier que l'étalement est bien fait (voir dessin A) :
- il ne doit pas présenter de lignes transversales ou horizontales
- il doit être lisse aux extrémités, et non irrégulier ou strié, comme sur le
dessin B
- il ne doit pas être trop long ni trop épais
- il doit être étalé uniformément
 Un séchage correct est capital pour conserver la qualité de l'étalement,
surtout dans les pays à climat humide. Sécher en agitant rapidement à 5 cm
environ d'une lampe à alcool allumée ; sur le côté de la lampe, un peu au-
dessus de la flamme (mais jamais directement au-dessus).
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8.  Inscrire sur la lame le nom et le numéro du malade. Écrire au crayon gras sur
la partie épaisse de l'étalement, qui n'est pas utilisée pour l'examen.
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9. Coloration de la goutte épaisse
Matériel nécessaire
 Éprouvette de 50 ml
 Pipette en verre de 5 ml
 Poire en caoutchouc
 Bac à coloration
 Agitateur
 Pinces à lame
 Râtelier à lames
 Minuterie
 Colorant de Giemsa
 Eau du robinet ou de pluie
Préparation du Giemsa à 10 %
 Remplir le bac à coloration avec 45 ml d’eau du robinet ou de pluie
 Ajouter 5 ml de colorant de Giemsa à l’aide d’une pipette plastique
 Mélanger à l’aide d’un agitateur
NB : La solution de Giemsa à 10 % ne se conserve que 2 jours
Coloration des lames
 Plonger les lames à colorer dans la cuve à coloration contenant la solution
de Giemsa à 10 %
 Laisser colorer pendant 10 minutes
 Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
 Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale
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10. Coloration du frottis mince
Matériel nécessaire
 Coloration rapide Kit RAL 555 (3 x 100 ml)
 Recharge fixateurs RAL 555
 Recharge Eosine RAL 555
 Recharge Bleu RAL 555
Coloration des lames
 Plonger 30 secondes la lame dans le fixateur (flacon 1)
 Plonger 30 secondes la lame dans l’éosine (flacon 2)
 Rincer la lame à l’eau du robinet
 Plonger la lame 2 minutes dans le bleu (flacon 3)
 Sortir la lame, rincer en laissant la lame sous un filet d’eau du robinet
 Laisser sécher la lame à l’air pendant 30 minutes en position horizontale
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11. ETAPE 3
Examen de la goutte épaisse à la recherche des
parasites du paludisme
L'examen d'une goutte épaisse est basé sur l'observation microscopique de 100
champs de bonne qualité. C'est-à-dire que l'on ne peut pas déclarer le
prélèvement négatif avant d'avoir examiné 100 champs sans parasite.
Technique d'examen des gouttes épaisses
1. Mettre de l'huile à immersion sur la goutte épaisse.
2. Amener l'objectif à immersion 100 x au-dessus de la zone sélectionnée de la
goutte épaisse.
3. Abaisser l'objectif jusqu'à ce qu'il entre en contact avec l'huile.
4. S'assurer que la zone choisie a bien la qualité requise et examiner la lame
sur 100 champs avec l'objectif à immersion. Ne déplacer la lame que d'un
champ à la fois, en suivant le schéma ci-dessus. Corriger la mise au point
fine avec la vis micrométrique.
5. Pour vous aider, utilisez un compteur manuel pour compter le nombre de
champs examinés.
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12. A l'examen, vous devez observer :
 La goutte épaisse est formée d'un grand nombre d'hématies
déshémoglobinisées rassemblées en paquets.
 Lors de la coloration de la goutte épaisse, l'eau de la solution de Giemsa agit
sur les globules rouges non fixés : le contenu des cellules se dissout alors
dans l'eau.
 Les leucocytes et les plaquettes présentent un aspect très semblable à ce que
l'on observe dans un frottis. Comme ils n'ont pas été étalés par le frottis, les
globules blancs paraissent plus petits, avec un cytoplasme plus compact
autour du noyau.
Hématies
N : Neutrophile
E : Éosinophile
L : Lymphocyte
P : Plaquettes
Dans les gouttes épaisses, les parasites, comme les globules blancs,
apparaissent plus petits que dans les frottis. Il vous faudra sans doute regarder
avec beaucoup d'attention avant de les apercevoir. Vous devrez refaire la mise au
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13. point fine avec la vis micrométrique chaque fois que vous changez de champ.
Vous observerez ainsi la goutte épaisse dans différents plans horizontaux.
Les fins anneaux de cytoplasme apparaissent parfois interrompus ou incomplets.
C'est l'aspect normal des trophozoïtes dans les gouttes épaisses.
De même l'absence d'hématie peut également rendre difficile l'observation des
granulations de Schüffner ; en fait, dans les parties les plus épaisses de la goutte
il est parfois impossible de les voir. On peut cependant souvent observer le
«fantôme» des globules rouges entourant les parasites dans les parties les plus
fines, en général au bord de la goutte épaisse, ce qui aide à poser le diagnostic.
Remarque : Il est impossible d'observer les taches de Maurer avec P. falciparum
dans une goutte épaisse.
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14. Les espèces plasmodiales dans les gouttes épaisses
Plasmodium falciparum
Trophozoïtes jeunes, en croissance, et/ou gamétocytes matures
généralement visibles
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
Plasmodium vivax
Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner dans les
fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la goutte épaisse
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
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15. Plasmodium ovale
Tous les stades sont visibles; semis de granulations de Schüffner nettement
visibles dans les fantômes des érythrocytes de l’hôte, surtout sur les bords de la
goutte épaisse
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
Plasmodium malariae
Tous les stades sont visibles
Trophozoïtes Schizontes
Gamétocytes
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16. ETAPE 4
Identification des espèces de Plasmodium sur la
goutte épaisse et le frottis mince
En cas de résultat positif, il est nécessaire d’examiner le frottis mince pour
déterminer le ou les espèce(s) en cause.
Examen du frottis mince
Pour examiner un frottis, procéder de façon systématique et normalisée :
 Mettre la lame sur la platine.
 Placer l'objectif 100 x à immersion au-dessus du bord du frottis, à mi-distance
de ses deux extrémités.
 Mettre une goutte d'huile à immersion à cet endroit.
 Abaisser l'objectif à immersion jusqu'à ce qu'il soit en contact avec l'huile.
 Examiner le frottis de la façon suivante pour déterminer le ou les espèce(s) en
cause.
Identification des espèces plasmodiales
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17. Les parasites découverts dans le sang en sont à différents stades de
développement
Les hématies parasitées peuvent rester identiques ou changer de couleur ou de
forme, ou encore contenir des granulations roses (granulations de Schüffner).
Attention : on peut trouver plusieurs espèces associées chez un même malade.
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18. Plasmodium falciparum
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : petit anneau fin, bleu pâle, sans granulations
Chromatine : 1 ou 2 petits grains rouges
Trophozoïte adulte
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, ou aspect en virgule, ou en point
d'exclamation
Schizonte
Très rare
Pratiquement jamais trouvés dans les étalements de sang (sauf dans les cas très
graves)
Mérozoites : 18 à 32
Pigment: brun foncé ou noir
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19. Gamétocyte
Stade assez fréquent
Forme : banane, croissant ou faux
Couleur : bleu (mâle) ou bleu soutenu (femelle)
Noyau : rose-rouge
Pigment : quelques grains bleu- noir situés au centre du cytoplasme, ou dispersés
Hématie
De taille normale
Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.
Densité parasitaire
Souvent très élevée
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20. Plasmodium malariae
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu soutenu épais, avec quelques grains de pigments noirs
Chromatine : 1 grosse tâche rouges
Trophozoïte adulte
Stade fréquent
Cytoplasme : soit tâche compacte, arrondie, bleu foncé, avec de nombreux grains
de
pigment noirs, soit disposé en bande (étalements minces seulement).
Chromatine : tâche ronde ou bande rouge
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21. Schizonte
Stade assez fréquent
Mérozoites : 8 à 10
Chacun est une grosse tâche rouge entourée d’un peu de cytoplasme pâle.
Ils peuvent avoir une disposition irrégulière (forme jeune) ou être disposés en
couronne (forme adulte
Gamétocyte
Stade assez fréquent
Forme : grand, ovale ou arrondi
Couleur : bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
Noyau : une tâche ronde de chromatine rouge contre un bord
Pigment : gros grains noirs dans le cytoplasme
Hématie
De taille et forme normales
Peuvent comporter des cellules crénelées contenant des trophozoïtes adultes.
Contiennent souvent quelques grains rouges de taille et de forme irrégulières.
Densité parasitaire
Faible
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22. Plasmodium vivax
Trophozoïte jeune
Stade fréquent
Cytoplasme : anneau bleu assez gros, à contour irrégulier
Chromatine : 1 grain rouge, assez gros
Trophozoïte adulte
Stade peu fréquent
Cytoplasme : large tâche bleue, irrégulière (quelque fois divisée en 2, 3 ou 4),
avec de petits grains de pigment brun-orange.
Chromatine : une tâche rouge
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23. Schizonte
Stade assez fréquent
Mérozoites : 12 à 18 gros grains rouges compacts, posés sur le cytoplasme bleu
pâle
Gamétocyte
Stade fréquent
Femelle : ovale ou arrondi, bleu soutenu (femelle) ou clair (mâle)
Noyau triangulaire rouge soutenu, souvent placé à une extrémité; nombreux
grains de pigments orange dans le cytoplasme.
Mâle : arrondi, bleu clair
Noyau central rond, rouge clair; quelques
grains de pigments orange dans le cytoplasme
Hématie
Grosses granulations de Schüffner, souvent colorées en rose, surtout autour des
trophozoïtes adultes.
Densité parasitaire
Moyenne
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24. Plasmodium ovale
Trophozoïte jeune
Cytoplasme : anneau régulier, bleu soutenu
Chromatine : 1 grain rouge de taille moyenne
Trophozoïte adulte
Cytoplasme : tâche ronde compacte, très bleue avec quelques grains de pigment
bruns.
Chromatine : une grosse tâche rouge
Schizonte
Mérozoites : 8 à 14 grosses tâches rouges en couronne, autour d’un amas central
de grains de pigments bruns.
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25. Gamétocyte
Stade fréquent
Forme : grand, ovale ou arrondi bleu soutenu
Noyau : une tâche ronde
Pigment : quelques grains bruns dans le cytoplasme
Différent de P. vivax par son pigment brun et de P. malariae par la présence de
grains de Schüffner
Hématie
Peut paraître ovale, avec des extrémités irrégulières
Grosses granulations de James rouges, facilement visibles.
Densité parasitaire
Moyenne
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26. ETAPE 5
Estimation de la densité parasitaire sur la goutte
épaisse ou sur le frottis mince
En cas de résultat positif, il est nécessaire d’estimer la densité parasitaire car la
gravité de l’infection palustre est liée au nombre d’hématies parasitées.
Un paludisme à P. falciparum est considéré comme sévère quand le nombre
d’hématies parasitées est supérieur à 100000 par µl, l’accès pernicieux est
probable au-delà de 150000 par µl. Une parasitémie supérieur à 400 000 par µl
est un élément de très mauvais pronostic
Sur la goutte épaisse
On estime la densité parasitaire sur la goutte épaisse quand le nombre de parasite est faible.
Le calcul de la densité parasitaire va être établit par rapport aux leucocytes. Il
suffit de compter le nombre de parasites que l’on voit et de compter au moins 200
leucocytes. On peut s’aider pour cela d’un compteur de cellules. On estime que le
nombre moyen de leucocytes est de 8000 par µl.
Le calcul du nombre de parasites par µl est
8000 x Nombre de parasites comptés
Nombre de parasites par µl =
Nombre de leucocytes comptés
Le pourcentage d’hématies parasitées peut en être déduit en prenant comme
nombre moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :
Nombre de parasites par µl
Pourcentage d’hématies parasitées =
45000
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27. Exemple :
On compte 358 parasites et 205 leucocytes sur la lame
Le nombre de parasites par µl est donc : (8000 x 358) / 205 = 13 971 par µl
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : 13 971 / 45 000 = 0,31 %
Sur le frottis mince
On estime la densité parasitaire sur le frottis mince quand le nombre de parasite est élevé.
On compte le nombre d’hématies parasitées par rapport au nombre d’hématies
saines et on établit le pourcentage d’hématies parasitées.
Il suffit pour cela de compter dans 3 à 4 champs microscopiques, choisis au
hasard mais éloignés les uns des autres, le nombre d’hématies (au minimum de
1000 hématies) et le nombre d’hématies parasitées.
NB : un champ microscopique à l’immersion (x 100) contient entre 150 et 300
hématies
Environ 150 hématies Environ 300 hématies
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc :
Nombre d’hématies parasitées x 100
Pourcentage d’hématies parasitées =
Nombre d’hématies saines
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28. Le nombre de parasites par µl peut être calculé en prenant comme nombre
moyen d’hématies, 4 500 000 par µl :
Nombre de parasites par µl = % d’hématies parasitées x 45 000
Exemple :
On compte 16 hématies parasitées sur 5 champs microscopiques d’environ 300
hématies.
Le pourcentage d’hématies parasitées est donc : (16 x 100) / 1500 = 1,06 %
Le nombre de parasites par µl est donc : 1,06 x 45 000 = 48 000 par µl
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