Diagnostic biologique du paludisme - Séances Pratiques de la 5e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - Didier MENARD et Vincent THONIER

1. Diagnostic biologiqueDiagnostic biologique
du paludismedu paludisme
Dr Didier Ménard
Unité de Recherche sur le Paludisme
Vincent Thonier
Unité de Recherche sur le Paludisme
Institut Pasteur de Madagascar
Mercredi 7 Mars 2007
5ème Atelier Paludisme

2. PlanPlan
importance du diagnostic biologique
Les différentes méthodes disponibles
mise en évidence directe des parasites
mise en évidence des antigènes parasitaires
mise en évidence de l’ADN parasitaire
Bilan complémentaire du paludisme
En pratique

3. importance du diagnostic biologique duimportance du diagnostic biologique du
paludismepaludisme
Faible spécificité des signes cliniques
Surestimation des cas de paludisme
Antananarivo : sujets consultants au niveau des CSB pour suspicion de
paludisme : 2% RDT +
Toamasina : sujets hospitalisés pour suspicion de paludisme : 10% GE +
surprescription et surconsommation de traitement
antipaludique
Mauvaise prise en charge des cas de fièvre avec Sous estimation
des autres pathologies
majore la pression médicamenteuse exercée sur le parasite

4. mise en évidence directemise en évidence directe
des parasitesdes parasites
Deux principales techniques :
la goutte épaisse et le frottis mince
le QBC

5. goutte épaisse et frottis mince (1)goutte épaisse et frottis mince (1)
= gold standard
principe techniqueprincipe technique
- ETAPE 1-
Prélèvement du malade
- ETAPE 2-
Préparation et coloration de la ge et du fm
- ETAPE 3-
Examen de la ge à la recherche des parasites du paludisme
Si la recherche est négative : Examen négatif, Absence de Plasmodium »
Si la recherche est positive, passer à l’étape 4
- ETAPE 4-
Identification des espèces de Plasmodium sur la ge et le fm
- ETAPE 5-
Estimation de la densité parasitaire
sur la ge (peu de parasites)
ou sur le fm (beaucoup de parasites)

6. AvantagesAvantages
Bonne sensibilité
faible coût
Identification des stades et des
espèces
Mesures quantitatives
Lecture rétrospective
InconvénientsInconvénients
Délai du rendu des résultats
Personnel qualifié
Équipement
Problèmes des infections mixtes
goutte épaisse et frottis mince (2)goutte épaisse et frottis mince (2)

7. mise en évidence des antigènesmise en évidence des antigènes
parasitairesparasitaires
Deux principales techniques
Test immunochromatographique = test de diagnostic Rapide = tdr
(rdt)
RIA et ELISA (Pas d’intérêt dans le diagnostic)

8. principe techniqueprincipe technique
Détection d’antigènes parasitaires par Immunochromatographie
Test immunochromatographique =Test immunochromatographique = tdrtdr
((rdtrdt) (1)) (1)

9. 3 Groupes d’antigènes détectés par les tdr
HRP II : Histidine-rich protein 2
pLDH : Plasmodium lactate dehydrogenase
Aldolase
tdrtdr (2)(2)
TDR commercialisés :
HRP II seule
HRP II + aldolase
pLDH (Falciparum-specific pLDH and
pan-specific pLDH)
HRP II + pan-specific pLDH
HRP II + pan-specific pLDH + vivax-specific pLDH
aldolase

10. TDR (3)TDR (3)
AVANTAGESAVANTAGES
Rapidité : 15-20 min.
Simplicité d’utilisation
Peut être réalisé sans expérience
Bonne sensibilité et bonne spécificité
Ne nécessite pas d’équipements
spécifiques
Adapté au terrain
InconvénientsInconvénients
Coût : 1-2 USD.
Pas quantitatif
Ne distingue pas P.v des autres
espèces
Stabilité des réactifs sur le terrain ?
Nombre important de faux positifs
Ne donne pas d’indication sur la
viabilité des parasites

11. mise en évidence de l’ADNmise en évidence de l’ADN
parasitaireparasitaire
La Biologie moléculaire (1)La Biologie moléculaire (1)
Principe technique
Prélèvement Sang
Extraction de L’ADN
parasitaire
Amplification par PCR
Révélation
Avantages
Sensibilité
Diagnostic d’espèce
Possibilité de quantification
Étude génome du parasite
Travail de grande série
Inconvénients
coût
Équipement très sophistiqué
Personnel qualifié
Délai de réalisation

12. La sérologieLa sérologie
technique
ELISA
IFI
Indications
En aucun cas le
diagnostic d’accès
palustre
études épidémiologiques
Dépistage des donneurs de sang
Diagnostic rétrospectif (non valable
en zone d’endémie)
Paludisme viscéral évolutif
Ag=
plasmodium
Ac sérique ?
Ac
secondaire =
anti globuline
humaine
Fluorescéine
Excitation UV

13. bilan biologique complémentairebilan biologique complémentaire
Intérêt =
recherche de signes de gravité biologique définis par L’OMS
en 2000
Ictère (clinique) :
bilirubine avec prédominance de la forme libre
hémoglobinurie macroscopique
Insuffisance rénale : créatinine (> 265 µmol/L, valeur plus basse chez
l’enfant), diurèse, clearance de la créatinine
Acidose métabolique (bicarbonates plasmatiques < 15 mmol/L) ou Gaz du
sang
Troubles de l’hémogramme
Anémie grave (Hb < 50g/L ou Ht < 15%)
Thrombopénie
Hypoglycémie (< 2,2 mmol/L)

14. Conclusion = En pratiqueConclusion = En pratique
Diagnostic direct du parasite :
Si laboratoire à proximitéSi laboratoire à proximité
A lui de définir à sa stratégie diagnostiqueA lui de définir à sa stratégie diagnostique
Si pas de laboratoire à proximitéSi pas de laboratoire à proximité
tests rapidestests rapides (préférentiellement HRP(préférentiellement HRP--2)2)
Jamais de sérologie pour un diagnostic d’accès palustre
Ne pas oublier les signes biologiques de gravitéNe pas oublier les signes biologiques de gravité

15. QBC (1) =QBC (1) = quantitativequantitative buffybuffy coatcoat
principe techniqueprincipe technique
- ETAPE 1 -
Prélèvement du malade
- ETAPE 2 -
Centrifugation dans un capillaire = concentration
(hématies parasitées + légères) +
action de l’Acridine orange = agent intercalent et fluorescent
- ETAPE 3 -
Lecture avec microscopie UV
- ETAPE 4 -
Identification des espèces de Plasmodium
P. falciparum P. vivax

16. QBC (2) =QBC (2) = quantitativequantitative buffybuffy coatcoat
AVANTAGESAVANTAGES
Très Bonne sensibilité
(1 parasite par µl)
Volume examiné : 60 µl vs 0.,2 µl GE
Rapidité
InconvénientsInconvénients
Toxicité de l’acridine
coût élevé
Équipements
Personnel expérimenté
Pas approprié au terrain
Pas quantitatif, espèces

17. mise en évidence de l’ADNmise en évidence de l’ADN
parasitaireparasitaire
La Biologie moléculaire (2)La Biologie moléculaire (2)

18. Pour moiPour moi
LDH se négative en 3 jLDH se négative en 3 j
HrpHrp--2 se négative en 10 j2 se négative en 10 j
HrpHrp--2 bien meilleur stabilité que LDH e2 bien meilleur stabilité que LDH e aldolasealdolase
HrpHrp--2 bien meilleure sensibilité que LDH2 bien meilleure sensibilité que LDH falcifalci etet
aldolasealdolase ( la moins bonne sensibilité)( la moins bonne sensibilité)
idéale Tana HRP2+ panidéale Tana HRP2+ pan pLDHpLDH sisi trptrp cher HRP2cher HRP2
LDH suppose une viabilité du parasite = meilleurLDH suppose une viabilité du parasite = meilleur
suivi efficacité du traitementsuivi efficacité du traitement