Aspects cliniques et moléculaires de l'histoire naturelle du paludisme : transmission et résistance aux antipaludiques, deux facteurs clé - Conférence de la 3e édition du Cours international « Atelier Paludisme » -ROGIER Christophe - IMTSSA, Marseille-Armées - France - christophe.rogier@wanadoo.fr

1. Aspects cliniques et moléculaires
de l'histoire naturelle du paludisme :
transmission
et résistance aux antipaludiques,
deux facteurs clé.
Christophe ROGIER
Unité de Recherche en Biologie &
Epidémiologie Parasitaires
IMTSSA - Le Pharo – Marseille
christophe.rogier@wanadoo.fr

2. Malariothérapie par P. falciparum de 3 patients neurosyphilitiques n’ayant
Malariothé
pas été exposé au paludisme : guérison spontanée des infections
exposé gué spontané
D’après Collins W. E. & Jeffery G. M.
aprè
6
4
2
log ( parasites asexu és / mL + 1)
0
0 50 100 150 200 250
6
(parasites asexué
4
2
0
0 50 100 150 200 250
6
4
2
0
0 50 100 150 200 250
Jours

3. ..
No trophozoites/100 leucocytes
100
200
200
0
0
Je 31
Ma 5
Ve 8
Ma 12
Juin
Juin
Sa 16
Ma 19
Sa 23
Ma 26
Sa 30
Je 5
Di 8
Ma 10
Sa 14
Juillet
Juillet
Ma 17
Sa 21
Ma 24
Me 25
Di 29
Ma 31
Sa 4
Ma 7
Sa 11
Ma 14
Août
Août
Sa 18
Ma 21
Me 22
Sa 25
Ma 28
Sa 1
Ma 4
Septembre
Sa 8
Septembre
Ma 11
Sa 15
Ma 18
Sa 22
29/06, 3,5 ans
29/06, 3,5 ans
Ma 25
Sa 29

4. Dielmo, 250-300 habitants, 100-300 PI/pers./an
250- 100-
17° O 16° 15° 14° 13° 12°
16° N
15°
14°
13°
Ndiop, 300-350 habitants, 10-30 PI/pers./an
Ndiop, 300- 10-

5. Enfant 01/05, 4 ans, du 29/5/90 au 30/9/90
Température rectale (°C)
40
38,5
35
Symptômes "Corps chaud"
Céphalée
Asthénie, Nausées,
Vomissements...
Parasitémie à Plasmodium falciparum (Log)
0
0 20 40 60 80 100 120
Temps (jours)

6. trophozoites/100
No trophozoites/100 leucocytes
0
200
400
600
800
Juin
1
T
Sa 23
2
T
Je 5
3
M a 10
Juillet
Sa 21
4
M e 25
5
Ma 7
Période d'étude (jours)
Août
6
M a 21
7
Ma 4
Septembre
12/07, 1 an

7. « Gènes » avec région variable
(par la taille : répétitions de séquence ADN)
e.g. structure du gène msp 1 Amplification
par PCR
Mad20
K1
RO33
conservé
semi-conservé
variable

8. Infections multiples en zone d’endémie
O. Puijalon, IP Paris
Puijalon,
C. Rogier, IMTSSA
Amplification msp1bloc2 ou msp2 - gènes copies uniques
msp1 bloc2
K1-168 bp Mad20-176 bp K1-177 bp Mad20-202 bp
3D7-275 bp FC27-408 bp
msp2

9. 04/01, Dielmo, 15 août - 7 septembre 2002
O. Puijalon, IP Paris.
Puijalon,
! !

10. Accès palustres en zone d'endémie
• croissance rapide de parasites récemment
inoculés, au delà d’un seuil
• accès successifs chez un enfant associés
à des souches parasitaires différentes
• contrôle de la multiplication de certains
génotypes (asymptomatiques) mais non
d’autres (accès)

11. Rapid turn-over in Dielmo
High transmission season (≈ 200 ib/p/y)

12. Chronic carriage in Pikine
[ December May ] : no transmission
ID 407 ID 512 ID 385

13. Geographical microheterogeneity: distinct
msp 1 allele distribution in Dielmo and
Ndiop , Oct 1994
msp 1 block 2 K1 types
35
% of each allele within the family
30
Ndiop
25
Dielmo
20
15
10
5
0
160
170
190
200
210
220
230
240
250
260
270
330
130
140
150
180
280
290
300
310
fragment size (bp)
(bp)
Konate L et al. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1999;93 (suppl. 1) : 21-28.
21-

14. Variations temporelles de la distribution
des familles alléliques msp 1 & msp 2
3D7
K1
Ndiop: msp 1 msp 2 FC27
Mad20 3D7/FC27
RO33 FC27/3D7
80
Proportion (%) des allèles
70
70
60
60
50
50
40
40
30 30
20 20
10 10
0 0
Sep94 Oct Dec Jan May Sep95 Sep94 Oct Dec Jan May Sep95
Zwetienga J et al. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1999;93:375-380.
1999;93:375-

15. Marqueurs microsatellites
de Plasmodium falciparum
non soumis à pression sélection
(répétitions ≠ tri ncléotides
- u «non codant»)
≈ 60 marqueurs microsatellites criblés
(PCR, spécificité, facilité d’interprétation)
17 microsatellites retenus pour validation
Analyse non biaisée diversité & structure
Thèse H. Bogreau

16. Endémicité et transmission de P. falciparum
à Dakar, Niamey, Djibouti et dans la zone rurale de Zouan-
Henien (Ouest de la Côte d’Ivoire, région de Danané)
Hypo
IP < 5% Hypo-méso
Hypo-
<<1PI/p/an IP<5% ±30-50%
30-
Dakar <1PI/p/an
Niamey Djibouti
Hypo
<<5%
<<1PI/p/an
Zouan-Henien
Hyper-holo
Hyper-
> 80%
> 200 PI/p/an • Multiplicité des infections
• Diversité génétique
• Structure-différenciation géographique
Thèse H. Bogreau
article en préparation • Déséquilibre de liaison-association entre loci

17. Prévalence des infections multiples (PIM), Multiplicité des
infections (MOI) et Diversité génétique (He)
(C4M79, Pf2689, TRAP, Pf2802, 7A11,C4M69)
PIM = 38%
MOI = 1.41 PIM = 49%
He = 0.73 MOI = 1.63
Dakar He = 0.76
Niamey Djibouti
PIM = 26%
MOI = 1.31
H = 0.53
Zouan-Henien
PIM = 75%
MOI = 2.68 He : probabilité que deux parasites tirés au hasard aient le même allèle à un locus donné
He = 0.76 Indice of Heterozygosity (Nei, 1978)
Nei,
Thèse H. Bogreau
article en préparation

18. Différentiation géographique (θ)
(C4M79, Pf2689, TRAP, Pf2802, 7A11,C4M69)
Marqueur de résistance à la CQ : mutation Pfcrt K76T
θ=0.109
CQR 67% (0.025-0.181)
(0.025-
Dakar
θ=0.042 Niamey Djibouti
(-0.008-0.094)
0.008- θ=0.197 CQR 95%
(0.102-0.280)
(0.102-
θ=0.107
(0.005-0.237)
(0.005- θ=0.122
(0.015-0.252)
(0.015-
Zouan-Henien θ=0.243
CQR 95% (0.155-0.325)
(0.155-
θ : Coancestry coefficient (Weir & Cockerham, 1984)
(Weir Cockerham,
Thèse H. Bogreau
article en préparation

19. Analyse factorielle des correspondances
(C4M79, Pf2689, TRAP, Pf2802, 7A11,C4M69)
1.70
Zouan-Hounien (CI)
Zouan-
Dakar
1.02 Djibouti
Niamey
0.34
AXE II
-0.34
-1.02
-1.70
-3.0 -1.5 0.0 1.5
AXE I
Thèse H. Bogreau
article en préparation

20. Association between loci : Genetic Linkage disequilibrium in Djibouti
• Epidemic clonal expansion Haplotypes from mono infected isolates
• Selfing (auto-fecundation)
(auto- fecundation)
• Walhund effect Complete data Curtailed data
Number of :
Haplotypes 29 14
Repeated haplotypes 15 0
Isolates 29 14
Pairs of loci R² P-value R² P-value
C4M79 X Pf2689 0.02102 0.07833 0.06410 0.47000
C4M79 X TRAP 0.06161 0.19750 0.03186 0.82500
C4M79 X Pf2802 0.12666 0.30917 0.12874 1.00000
C4M79 X 7A11 0.02541 1.00000 0.06563 1.00000
C4M79 X C4M69 0.11126 0.00417 0.06997 0.27667
Pf2689 X TRAP 0.12222 0.06667 0.11121 0.59917
Pf2689 X Pf2802 0.07907 0.04083 0.05843 0.46750
Pf2689 X 7A11 0.09078 0.59917 0.14219 0.67167
Pf2689 X C4M69 0.10320 0.02083 0.09034 0.32750
TRAP X Pf2802 0.23530 0.00083 0.08005 0.27583
TRAP X 7A11 0.16306 0.00250 0.12115 0.08083
TRAP X C4M69 0.24631 0.00083 0.10154 0.29000
Pf2802 X 7A11 0.13315 0.00417 0.07169 0.49083
Pf2802 X C4M69 0.28891 0.00083 0.10612 0.32083
7A11 X C4M69 0.21044 0.01000 0.12091 0.58500
Thèse H. Bogreau
article en préparation

21. Djibouti, Horn of Africa
"# • Low and irregular
0 20
transmission (Anopheles
km
arabiensis)
#
($ % • Autochthonous cases of
& '!
malaria since the 1970s
• Incidence usually low
'$ !
• Chloroquine resistance since
1990 (RII/RIII, NAMRU-3, Rodier et
%#
$ # al.)
• Suspected importation of
malaria parasites from
adjacent countries
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

22. Monthly incidence of clinical malaria attacks, Djibouti-city, CHA Bouffard, January 1997 - June 2002
N° of
attacks
250
200
150
100
50
0
97
M 2
M 8
M 9
M 0
M 1
ay
ay
ay
ay
ay
ay
p
p
n v
n v
p
p
p
n v
n v
n v
ar
ar
ar
ar
ar
ar
l
l
l
l
l
0
9
9
0
0
Ju
Ju
Ju
Ju
Ju
J a No
J a No
Se
Se
J a No
J a No
J a No
Se
Se
Se
19
20
19
19
20
20
M
M
M
M
M
M
M
n
Ja
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

23. Monthly incidence of clinical malaria attacks, Djibouti-city, CHA Bouffard, January 1997 - June 2002
N° of Rainfall
attacks (mm)
250 200
180
200 160
140
150 120
100
100 80
60
50 40
20
0 0
M 8
97
M 9
M 0
M 1
M 2
ay
ay
ay
ay
n v
ay
n v
ay
p
p
p
p
p
n v
n v
n v
ar
ar
ar
ar
ar
ar
l
l
l
l
l
9
9
0
0
0
Ju
Ju
Ju
Ju
Ju
J a No
J a No
J a No
J a No
J a No
Se
Se
Se
Se
Se
19
19
19
20
20
20
M
M
M
M
M
M
M
n
Ja
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

24. Ja Monthly incidence of clinical malaria attacks
n
0
50
19
100
150
200
97 250
M
ar
M
ay
Ju
l
Se
p
J a No
n v
19
9
2005,11:317-
M 8
ar
M
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
ay
Ju
l
Se
p
J a No
n v
1998
19
9
M 9
ar
M
ay
1999
Ju
l
Se
p
J a No
n v
20
0
M 0
ar
M
ay
Ju
l
Se
p
J a No
n v
20
0
M 1
ar
M
ay
Ju
l
Se
p
J a No
n v
sampling periods of clinical malaria isolates, Djibouti-city, CHA Bouffard,
20
0
M 2
ar
M
ay
2002

25. Stable distribution of msp1 block2 and msp2 alleles in Djibouti
Isolates with only one allele detected by locus
percentage 1998 1999 2002
80
60
40
20
0
129 203 166 184 193 202 237 241 131 221 226 248 253 261 275 282 284 308 346 366 371 173 373 408 444 468
K1 Mad20 RO33 3D7 FC27
msp1 block2 msp2
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

26. Genetic diversity of the P. falciparum population
before, during and after the 1999 epidemic
100%
msp1 block2
Unbiased expected heterozygocity
msp2
80%
60%
40%
20%
0%
1998 1999 2002
(Sept.-Dec., n=46) (April, n=61) (March-May, n=32)
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

27. In vitro activity of antimalarials on P. falciparum isolates, Djibouti,1999
Drug No Cut-off % 95%
Isolate values resistant Mean confidence
s isolates IC50 intervals
Chloroquine 27 > 100 nM 93% 326 nM 224 – 474
nM
Amodiaquine 27 > 80 nM 0% 10.0 nM 8 – 13 nM
Pyrimethamine 25 > 2,000 nM 4% 69 nM 41 – 117 nM
Cycloguanil 24 > 500 nM 4% 13 nM 8 – 21 nM
Rogier C. et al. EID 2005,11:317-321.
2005,11:317-

28. Pfcrt, Pfdhfr and Pfdhps genotypes before & during the outbreak
Pf-crt Pf-dhfr Pf-dhps
codon codon codon
100%
76 51 59 108 436 437 540
80%
60%
40%
20%
0%
98 99 98 99 98 99 98 99 98 99 98 99 98 99
Wild type (no mutation detected)
Mixed (both wild-type and mutant genotype present in the same infection)
Mutant (only mutant genotype detected)

29. Pfcrt, Pfdhfr and Pfdhps genotypes in Djibouti in 1998, 1999 & 2002
Pf-crt Pf-dhfr Pf-dhps
codon codon codon
100%
76 51 59 108 436 437 540
80%
60%
40%
20%
0%
98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02 98 99 02
Wild type (no mutation detected)
Mixed (both wild-type and mutant genotype present in the same infection)
Mutant (only mutant genotype detected)

30. Dielmo, 250-300 habitants, 100-300 PI/pers./an
250- 100-
17° O 16° 15° 14° 13° 12°
16° N
15°
14°
13°
Ndiop, 300-350 habitants, 10-30 PI/pers./an
Ndiop, 300- 10-

31. Anti-malaria drug intakes in Dielmo (1990-1999) Quinimax (x 50 g)
Chloroquine (x 20 g)
3 Sulfadoxine (x 5g) +
Monthly anti-malarial intake
Pyrimethamine (x0,25g)
2,5
2
1,5
anti-
1
0,5
0 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999
900
800
No malaria treatments/year
700
600
500
400
300
200
100
0
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999

32. clinical P. falciparum malaria attacks/100 children (<10y)/year
attacks/100 (<10y)/year
EIR (infected bites / person / year)
(infected year) % of CQ
failure
600 Malaria morbidity in Dielmo 12%
500 10%
400 8%
300 6%
200 4%
100 2%
0 0%
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999

33. Malaria transmission in Dielmo
ma : number of
anopheline bites
)*+
/ person /
semester #
15000 4%
3%
10000
2%
5000
1%
0 0%
1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999
Semesters

34. TIPTENGA
THIAGO
FATIN
TEMEYE SALANE
SANINTE
NDIAKHAYE KATE
MALLA BOCKI
NIOKO II S26
S29-30
S29-
PISSY S17 TCHOLLIRE II
SAKDJE YOUKOUT
Dakar
Niamey
Djibouti
Dienga
Danané
Danané
THIOBO MELEN/
SAMAL BANTATA NIENA NKOLAFENDEK
MIATTA / DJOUZE
ASSONI TIABEDJI
ENDEGUE/ ZOEBEFAM/
LANDE ABDELON NKOLEMBOULA
RUNDE/BAITIL
YEN/
TENASSO Q. DOGONA MEBAN II
Q. SAMAGAN Q. KUINIMA

35. Immunocapture CQ & PYR par anticorps monoclonaux fixés sur
bandelette de nitrocellulose et révélation enzymatique.
(Schwick P et coll. Trop Med Internat Health 1998;3:828-32)
coll. 1998;3:828-
Contrôle
Pyriméthamine
Pyrimé
Chloroquine
CQ - , PYR - CQ+ , PYR-
PYR- CQ - , PYR + Ininterprétable
Ininterpré
Seuils de détection annoncés :
dé annoncé CQ +
CQ et DECQ, (AMQ) ≥ 20 ng/ml
ng/ml
PYR, (PG) ≥ 50 ng/ml
ng/ml
Méthode reproductible :
Gamme de CQ & lecture « en aveugle »
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+ -

36. F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

37. Consommation de CQ (IC95%) selon les sites
100%
Prévalence de CQu+ chez les enfants de 2 à 9 ans
80%
60%
40%
20%
0%
nord sud nord sud nord sud
Sénégal Burkina-Faso Cameroun
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

38. Consommation de CQ (IC95%) par pays et régions
100%
Prévalence de CQu + chez les enfants de 2 à 9 ans
CQ Nord
CQ Sud
80%
60%
40%
CQu+
20%
0%
Sénégal Burkina Faso Cameroun
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

39. Prévalence de CQu+ chez les enfants âgés de 2 à 9 ans
et accès aux soins
100%
80%
60%
40%
20%
0%
< 1 km 1-3,9 km 4-7,9 km ≥ 8 km < 1 km 1-9,9 km ≥ 10 km
Distance routière structure Distance routière
sanitaire la + visitée pharmacie la + visitée
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

40. Prévalence de CQu+ chez les enfants âgés de 2 à 9 ans
et mobilité/isolement des populations
100%
80%
60%
40%
20%
0%
< 15% ≥ 15% < 2% ≥ 2% < 2 km 2-24 km ≥ 25 km
Prop. migrants
Prop. Prop. visiteurs
Prop. Accès réseau
ménage ménage goudronné le + proche
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

41. Prévalence de CQu+ chez les enfants âgés de 2 à 9 ans
et niveau socio-économique des populations
100%
80%
60%
40%
20%
0%
< 7 p. 7-9 p. ≥ 10 p. < 10% ≥ 10% < 10% ≥ 10% < 10%≥ 10% ≥
< 50% 50%
Nb moy. hab. /
moy. Raccord. Raccord.
ménage eau électricité Téléphone Véhicule
% des ménages avec
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

42. Taux de chloroquinurie (CQ+, immunocapture sur bandelette)
& GE+ à Plasmodium falciparum, 3.052 enfants (2-9 ans),
30 sites, DYNAPOP, sept.-déc. 2003.
100%
2 à 3 ans
4 à 5 ans
80%
6 à 7 ans
Taux Chloroquinurie
8 à 9 ans
60%
40%
20%
0%
0% 20% 40% 60% 80% 100% Hypo Méso Hyper Holo
Taux GE+ à P. falciparum Endémicité de P. falciparum
F. Simon, DEA 2004, Dynapop/PAL+
Dynapop/PAL+

43. mobilité
traitements
usage réponses
½ vie immunes
Exposition
antérieure
autres infections
transmission
intensité
parasites
Polymorphisme fréquence
allélique
Variation
caractères innés
antigénique génétiques
Infections xples âge, état nutritionnel
résistance

44. Unité de Recherche en Centre Muraz CNRP /
Biologie & Epidémiologie & Institut P. Richet UPRES
Parasitaires - IMTSSA M.C. Henry R. Durand
H. Bogreau S. Assi J. Lebras
H. Bouchiba
B. Pradines Institut Pasteur Institut Pasteur
F. Simon (HIA Laveran) à Paris de Dakar
O. Puijalon A. Tall
IRD N. Noranate A. Spiegel (DESP--Paris)
(DESP
J.F. Trape H. Contamin
F. Bâ F. Ntoumi
C Sokhna J. Zwetienga
D. Fontenille
L. Basco
V. Foumane Min. Santé Djibouti
M.A. Kamil
CNRS / IRD
F. Renaud UCAD - Dakar
L. Konaté