Anti-paludogramme - Tests de chimiosensibilité in vitro : un test de phénotypage - Travaux pratiques de la 2e édition du Cours international « Atelier Paludisme » - ANDRIANANTENAINA Hery - RANDRIANARIVELOJOSIA Milijaona - RASON Marie-Ange

1. Travaux Pratiques
Tests de chimiosensibilité in vitro :
un test de phénotypage
Milijaona Randrianarivelojosia
milijaon@pasteur.mg
Avec le concours de Dr Marie Ange Rason
et de M. Herilalaina Andrianantenaina

2. …, il est impératif de surveiller la sensibilité/résistance de
Plasmodium sp aux antipaludiques, notamment dans les
pays d’endémie.
P. falciparum P. vivax
peuvent être résistant
aux drogues
P. malariae P. ovale

3. Evaluation de la sensibilité de
P. falciparum aux antipaludiques
Test de
chimiosensibilité
Echantillon
Tests in vitro
de sang
Génotypage
(marqueurs de
résistance)
Test in vivo
(traitement et
suivi)

4. Evaluation de l’efficacité des traitements
Test in vivo
(traitement et
suivi)

5. Evaluation de l’efficacité thérapeutique des
antipaludiques
Protocoles d’étude
- WHO/CDS/CSR/EPH/2002.17
- WHO/MAL96.1077 Augmentation
de taux d’échec:
Alerte !
Médicaments
- molécules préconisées par la politique nationale
- molécules autorisées sur le marché et utilisées dans un pays
Dosage de taux plasmatique des médicaments
et/ou des métabolites

6. Evaluation de la chimiosensibilité de
P. falciparum in vitro
Test de
chimiosensibilité
Echantillon
Tests in vitro
de sang
Génotypage
(marqueurs de
résistance)

7. Test de chimiosensibilité in vitro
Examen microscopique
OMS, CTD/MAL/97.20 Rev. 2 2001
Phénotype
résistant + :
Colorimétrique (Elisa)
Alarme !
Moreno et al, 2001 : LDH
Noedl et al, 2002 : HRPII
Méthode isotopique
Desjardins et al, 1979; Le Bras & Deloron, 1983
Mise en culture des
parasites viables
Cytométrie en flux
Pattanapanyasat et al, 1997

8. Quand aura « facilement » les anticorps, …
Min
Concentration de drogue
Max
des tests seront faisables dans des structures hospitalières (périphériques)

9. Différentes étapes du test de chimiosensibilité
in vitro (1)
Réception des
prélèvements
Plaques de culture à fond
plat prémédicamentées

10. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in
vitro (2)
Milieu de culture
RPMI ; Sérum humain AB+ (ou
albumax); Hypoxanthine-3H
Suspension parasitaire
Lavage du culot de globules
rouges parasités (GRP) ;
préparation et distribution de la
suspension de GRP sous la
hotte

11. Différentes étapes du test de
chimiosensibilité in vitro (3)
Mise en culture
Incubation pendant 42h à
37°C; atmosphère humide; en
microaérophilie
Congélation et décongélation
des plaques de culture

12. Schématisation de l’incorporation de l ’hypoxanthine tritiée
dans l’ADN du parasite
Hypoxanthine-3H
+
ADN plasmodial
(au début du ADN plasmodial
test) marqué au
tritium

13. Différentes étapes du test de chimiosensibilité
in vitro (4)
Collecte du contenu
des puits sur un
filtre en fibre de
verre

14. Différentes étapes du test de chimiosensibilité in
vitro (5)
Comptage de la radioactivité
(cpm) à l’aide du Microbeta
Calcul des CI50 (concentration
inhibitrice 50%) et des CI90
des antipaludiques

15. Comptage de radioactivité après un test
d’antipaludogramme : illustration
Chloroquine Amodiaquine Mefloquine Quinine
Faible
concentration
A 3019 3126 3174 3221 3053 3288 2593 2464 3185 2963 3017 3174
B 2582 2951 2315 875 1006 870 2472 2446 2484 2570 2772 2608
C 1737 1767 1685 102 100 110 1678 1552 1557 1526 1716 1732
D 482 415 595 120 106 101 702 651 541 695 762 795
E 164 138 192 82 77 85 112 122 119 218 327 276
F 96 133 94 90 73 75 66 72 87 110 155 131
G 90 108 3040 78 104 3340 105 76 3552 111 122 2943
Forte
concentration
H 103 100 3276 101 114 3045 77 104 3187 113 135 3017
Cellules colorées en jaune = témoin (i.e. puits sans
antipaludiques)

16. Pfcrt, marqueur de résistance P. falciparum
à la chloroquine
MAL7P1.27 (www.plasmoDB.org)
(Fidock et al, 2000)

17. Pfdhfr, marqueur de résistance de P. falciparum
à la pyriméthamine
59
51
Drug/substrate
108
NADP
164
pfDHFR

18. Détections des mutations des
marqueurs de résistance
Génotype
PCR/séquençage
mutant + :
Alarme !
PCR nichée mutation spécifique
Utilisation des sondes
Amplification
par PCR PCR/RFLP
(Ranford-Cartwright et al, 2002)

19. Stratégie de surveillance (1)
Analyse des rapports émanant des structures de santé de
base, de district, provinciales …
Suivi de cohortes (sites sentinelles)
Mise en place de réseau (national, régional, …)
…

20. Stratégie de surveillance (2)
(Randrianarivelojosia et al, 2002)

21. Pratique de radioprotection
et utilisation de produits tritiés
Exemple du GRP de l’IPM
par
Marie Ange Rason
mieange@pasteur.mg
Avec le concours de Dr Milijaona Randrianarivelojosia et de Madagascar-INSTN

22. Pourquoi la technique isotopique ?
Paludisme : problème de santé publique ; avec risque
de résistance des parasites, notamment de P.
falciparum, aux drogues
Intérêt en santé publique : surveiller la sensibilité
ou résistance de l’agent causal du paludisme aux
drogues

23. Surveillance de la chimiosensibilité des
parasite du paludisme à Madagascar
Collaboration entre Ministère de la Santé et du Planning
Familial et l’Institut Pasteur de Madagascar
Avec une standardisation de la technique
But : doter Madagascar (et la sous région de l’Océan
Indien) d’un outil d’évaluation de l’efficacité des
antipaludiques

24. Surveillance de la sensibilité du parasite
Tests in vitro
Détection des mutations au niveau des marqueurs
génétiques de la résistance qui implique une
amplification par PCR des gènes d’intérêt (technique
isotopique ou non-isotopique)
Antipaludogramme utilisant le technique de marquage
isotopique avec l’hypoxanthine tritiée pour l’étude de la
sensibilité de Plasmodium falciparum aux antipaludiques

25. Source de rayonnement utilisée
Hypoxanthine tritiée
Source non scellée, aqueuse, rayonnements β-
Faible activité
Période longue (12,4 ans)
Précurseur d’acides nucléiques et est incorporée dans
l’ADN pendant la phase de division des cellules.

26. Mise en culture des parasites
Mise en culture pendant 48 heures de sang parasité
(parasites viables dans un échantillon de sang veineux)
dans du milieu de culture + hypoxanthine tritiée, et en
présence de différentes concentrations d’antipaludiques,
Paramètre utilisée pour classer selon la sensibilité : CI
50% ou concentration inhibitrice du médicament qui inhibe
à 50% la croissance du parasite.

27. IPM : Pratique de la radioprotection
Deux personnes compétentes en radioprotection
Gestion des produits et des déchets ; protections
individuelles et collectives
Procédures disponibles ; répartition de taches (et
seules les personnes autorisées peuvent
manipuler l’hypoxanthine tritiée)

28. Moyens de protection
Individuelle : Port des gants et blouse est obligatoire,
masque lors de la dilution des déchets liquides
Collective : Hotte à flux laminaire pour la culture, hotte
de chimie pour la collecte, salle spéciale pour la
radioactivité, matériels à usage unique, pipette
automatique, microplaques, papier aluminium et
absorbant, balisage des portes d’entrées, poubelles
spéciales, plateaux récupérateurs.

29. Gestions des déchets radioactifs à l’IPM
Liquides : Stockage dans des bidons plastiques dans la
salle radioactive en attente des contrôles par Madagascar-
INSTN avant le rejet
Solides : Compacter et stocker dans des fûts métalliques
qui sont supportés par des bois carrés, dans une fosse
bétonnée dans l’enceinte de l’IPM.

30. Autorisation, contrôle, inspection, rigueur
Limitation de quantité manipulée : activité annuelle (totale)
utilisée = 6,4.108 < 1,2.1010 Bq (LAI)
Contrôle régulier de surface (détection de contamination
des plans de travail)
Autorisation d’utilisation délivrée par Madagascar-INSTN
(et nous avons eu un projet IAEA)
Inspection fréquente/collaboration des officiers de
radioprotection de l’INSTN-Madagascar
Suivi médical (annuel) du personnel