O documento descreve a técnica de Southern blotting, que envolve (1) a separação de fragmentos de DNA por eletroforese em gel, (2) a transferência dos fragmentos para uma membrana de nylon, e (3) a detecção de sequências específicas de DNA através da hibridização com sondas marcadas radioativamente. A técnica permite identificar alterações genéticas e tem sido usada em diversas aplicações, como a detecção de genes associados a doenças.

1. MÓDULO IV
Southern
Blotting

2. Southern Blotting:
analisando borrões de DNA
Laboratório Virtual de Biotecnologia
Introdução
iluminando o gel com luz UV, o que
A técnica de Southern blotting
permite observar as bandas de DNA
permite a detecção de moléculas de
originadas. Fotografa-se o gel para o
DNA,
poder comparar posteriormente com o
após
a
sua
separação
electroforética, por hibridação com
uma
sonda
cuja
sequência
complementar
à
desenvolvida
por
Southern,
honra
em
desse
é
solução alcalina para desnaturar o
M.
DNA, uma vez que ele tem que estar
se
qual
Depois, o gel é imerso numa
Foi
DNA.
Edmund
do
resultado do Southern blotting.
em
baptizou a técnica.
cadeia
simples
para,
posteriormente, hibridar com a sonda.
Apesar de ter sido superada pela
Após neutralização do pH por imersão
PCR, esta técnica continua a ter muita
numa solução apropriada, o gel é
utilidade em diversas áreas. É uma
colocado sobre um papel de filtro
ferramenta extremamente poderosa
grosso que está em contacto com
na análise da estrutura de genes, por
uma solução-tampão salina. Por cima
exemplo.
do gel são colocados por esta ordem
uma
membrana
de
nylon
(ou
O que é a
nitrocelulose), uma camada de folhas
técnica de Southern blotting?
de papel absorvente e um objecto
A técnica de Southern blotting
baseia-se
na
habilidade
de
uma
pesado.
Assim,
a
solução-tampão
salina passa para as folhas de papel
cadeia de DNA para procurar e se
absorvente,
ligar à sua sequência complementar,
transferindo o DNA do gel para a
fenómeno denominado hibridação.
membrana
A
realização
um
de
do
nylon.
As
gel,
cadeias
Southern
simples de DNA ligam-se à membrana
blotting envolve várias etapas (Fig.1):
de nylon (blotting) na mesma posição
Após ter sido extraído, o DNA é
que ocupavam no gel. Este é um
clivado com uma (ou mais) enzima de
processo lento e demora cerca de 14
restrição e os fragmentos resultantes
horas
são
processo de blotting, o DNA é fixado à
separados
de
através
electroforeticamente
a
estar
concluído.
num gel de agarose. A visualização
membrana
dos
Após
o
administração de calor.
fragmentos
é
feita
utilizando
de
nylon
pela
brometo de etídio para corar o DNA e
2

3. A seguir, a membrana é incubada
demora 24 horas ou mais a ser
com um DNA heterólogo, em geral
realizado. Após várias lavagens, para
DNA de esperma de salmão, sendo
remover restos de sonda e ligações
coberta com este para impedir a
não
posterior ligação não específica da
híbridos
sonda (pré-hibridação). Em paralelo,
exposição da membrana de nylon a
prepara-se uma sonda de DNA (ou
um
RNA)
(autorradiografia).
em
cadeia
incorporação
de
simples
por
nucleótidos
radioactivos.
nylon e a sonda são misturadas num
gel,
de
feita
raios
Comparando
por
X
o
é
possível
do
identificar
as
que
são
DNA
A interpretação dos resultados de
um
moléculas
análise
suficientemente
é
dos
complementares à sonda.
que a sonda vai emparelhar com as
DNA
detecção
radioactivos
filme
regiões
processo designado hibridação, em
de
a
filme obtido com a fotografia original
do
Seguidamente, a membrana de
específicas,
Southern
blotting
visual
das
envolve
a
bandas
complementares, formando duplexes
autorradiográficas
radioactivos. O processo de hibridação
tamanho e a presença dos ácidos
que
indicam
o
1. Extracção do DNA das células
2. Restrição do DNA por enzimas de
restrição (formação de fragmentos)
3. Electroforese
(separação dos fragmentos de DNA)
4. Blotting (transferência dos fragmentos
para a membrana de nylon)
5. Hibridação (incubação dos fragmentos
de DNA com uma sonda radioactiva)
6. Autorradiografia
7. Análise e interpretação dos
resultados
Figura 1 – Sequência das diferentes etapas de um Southern blotting.
3

4. nucleicos na amostra. A ausência de
bandas
indica
sequências
a
ausência
Esta técnica foi muito importante
de
na
complementares
para
variedade
a
compreensão
de
de
biológicos,
processos
uma
amostra. A presença de bandas cujo
tais como, o splicing de RNA, o
peso molecular difere das amostras
rearranjo genómico que ocorre em
normais podem indicar uma alteração
determinadas situações e a detecção
no material genético.
de oncogenes rearranjados.
Ao longo dos últimos anos, foram
A técnica de Southern blotting
feitos vários melhoramentos a esta
pode ser utilizada para distinguir dois
técnica.
foram
indivíduos ou estirpes diferentes de
desenvolvidos métodos mais rápidos
um organismo que diferem na sua
de realizar o processo de blotting. Em
constituição
vez de recorrerem à capilaridade,
comum
foram
genes
Por
exemplo,
desenvolvidos
electroforéticos
ou
métodos
que
utilizá-la
É
para
homólogos
ou
também
identificar
similares
de
o
diferentes organismos, usando como
vácuo. Além disso, muitos dos passos
sonda o gene de um dado organismo.
envolvidos
É
nesta
utilizam
genética.
técnica
foram
ainda
muito
utilizada
na
parcialmente automatizados, tornando
identificação de genes associados a
o
doenças genéticas, como nos casos da
processo
menos
menos
moroso
entediante
e
até
para
os
investigadores.
doença
de
falciforme,
Huntington,
fibrose
anemia
quística,
entre
outras.
Aplicações da
A utilidade da técnica de Southern
técnica de Southern blotting
blotting é limitada quando o local
A técnica de Southern blotting é
bastante
específica
dependendo
para
características
da
e
sensível,
isso
desconhecido.
depende
da
gene
A
anormal
sua
proximidade
é
acuidade
entre
a
sequência nucleotídica que está a ser
utilizada. Em muitos casos, pode dar
investigada e a sequência do gene.
informações que não poderiam ser
Contudo, esta limitação não se aplica
obtidas recorrendo a qualquer outro
às sondas para os genes actualmente
método.
identificados
desta
que
do
é
Através
sonda
das
exacto
técnica,
é
como
sendo
possível detectar um fragmento de
responsáveis por doenças genéticas,
restrição único no meio de cerca de
uma vez que a sequência desses
um milhão de fragmentos que podem
genes é bem conhecida.
resultar
genómico
da
clivagem
de
um
de
DNA
organismo
eucariótico com enzimas de restrição.
4

5. Questões de análise
No
Laboratório
Biotecnologia
Virtual
encontrará
de
uma
animação que ilustra e explica cada
etapa da técnica de Southern blotting
(canal 2 da LVBtv).
1 – Descreva as diferentes etapas de
um Southern blotting.
2 – Enumere as principais vantagens
e
desvantagens
desta
técnica
relativamente a outras utilizadas para
identificar sequências de DNA.
3
–
Faça
necessário
uma
para
lista
do
realizar
material
uma
experiência utilizando esta técnica.
4 – Indique duas aplicações desta
técnica.
5

6. ALA CONCEPTUAL
ALA METODOLÓGICA
Teoria:
apresenta sempre o
Conclusões:
mesmo resultado,
Princípios:
independentemente da
amostra de DNA
utilizada?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Sonda 1
Sonda 2
Sonda 3
Pista
1
Pista
2
Pista 2
6
A mesma sonda

7. ALA CONCEPTUAL
ALA METODOLÓGICA
Teoria:
do mesmo modo a
Conclusões:
mesma amostra de DNA?
Princípios:
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Sonda 1
Sonda 2
Sonda 3
Pista
1
Pista
2
Pista 2
7
Todas as sondas marcam

8. ALA CONCEPTUAL
O uso simultâneo de
ALA METODOLÓGICA
Teoria:
os resultados obtidos,
Conclusões:
quando comparado com
Princípios:
os resultados individuais
das sondas?
Registos/Observações:
Pista 1
Conceitos:
Desenho experimental:
Material biológico
DNA alfa-C5
DNA beta-A7
Sonda 1
Sonda 2
Sonda 3
Pista
1
Pista
2
Pista 2
8
duas sondas influencia