1. SLE adalah penyakit otoimun sistemik yang melibatkan banyak organ dan menyebabkan gejala klinis yang beragam. 2. Pemeriksaan sel Lupus Eritematosus (sel LE) merupakan salah satu temuan penting untuk mendiagnosis SLE. 3. Ada beberapa metode untuk memeriksa sel LE, termasuk menggunakan darah defibrinated, darah heparin, dan darah yang membeku.

1. TUTOR HEMATOLOGI PEMERIKSAAN SEL LUPUS ERITEMATOSUSNUZULUL QURIYAH / PAULUS BUDIONO N. 1

2. PENDAHULUAN (1) SLE . SLE SLE Sistemik Lupus Eritematosus (SLE) adalahpenyakit yang penyebabnyatidakdiketahui Terjadikerusakanjaringandanselolehotoantibodidankompleks-imunpatogenik Merupakan penyakit otoimun yang melibatkan banyak organ dan memberikan gejala-gejala klinik yang beragam 2

3. . SLE SLE Etiopatogenesisdanpenatalaksanaanmasihdiperdebatkandanberbagaipenelitiandarisegalaaspektelahdilakukan, namunbelummenjawabsejumlahpertanyaan Sel Lupus Eritematosus (sel LE) merupakansalahsatutemuan yang memberikankeyakinanbahwa SLE merupakanpenyakitotoimun PENDAHULUAN (2) 3

4. PERMASALAHAN Manifestasi klinis SLE sangat bervariasi, gambaran klinis terutama keluhan penderita juga beragam Kelambatan diagnosis SLE Pemeriksaan sel LE masih digunakan atau dipertimbangkandi daerah Pemeriksaan serologis awal yang sering digunakan untuk menegakkan diagnosis SLE adalah pemeriksaan ANA (Antinuclear Antibody) cukup mahal www.themegallery.com 4

5. Pembentukan Sel LE 1 2 3 Depolimerisasi DNA inti sel lekosit yang rusak, diikuti pelepasan bagian-bagian dari inti sel, sehingga terbentuk masa globular yang homogen, kemudiandifagositoleh sel netrofil sel LE Tubuh akan membentuk antibodi (otoantibodi) faktorLE Kerusakan pada jaringan penyambung menyebabkan pelepasan protein ke dalam aliran darah(antigen) www.themegallery.com 5

6. 1 2 Metode Pemeriksaan Sel LE Defibrinated Blood (Metode Zinkham dan Conley) Dipakai di RSU dr. Soetomo 6 MereaksikanSerum Pasien dengan Lekositnya Sendiri Metode 5 Darah Heparin 3 4 Mereaksikan Serum Pasien denganLekosit Orang Normal Clotted Blood (Metode Zimmer dan Hargraves) www.themegallery.com 6

7. Metode Menggunakan Defibrinated Blood 1 3 2 Darah vena10 ml dimasukkan dalamErlenmeyer yang berisi glass beads. Digoyang dengangerakan memutar selama 5 menit atausampai tidakterdengar suara gelas lagi, untukmendapatkan defribinated blood. Kemudian dimasukkan dalam inkubator pada suhu 37ºC selama 3 - 4 jam Lapisan buffy coat diambil dengan pipet Pasteur dan dibuat sediaan hapus, dipulas dengan pewarnaan Romanowsky Darah dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe, disentrifus pada kecepatan 3000 rpm selama 10 menit www.themegallery.com 7

8. Metode Menggunakan Darah Heparin Darah vena 10 ml dimasukkandalamtabungberisi heparin 60 unit danglass beads 3 mm sebanyak 10 buah. Tabungdibolak-balikkansupayadarahdan heparin tercampur Darah diinkubasi pada suhu kamar 30 menit dan diletakkan pada rotator selama 30 menit Metode Menggunakan Darah Heparin Dibiarkan lagi selama 30 menit.Kemudian disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menit Plasmanya dibuang dan lapisan buffy coat diambil dengan menggunakan pipet Pasteur, dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe Disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 5 menit Lapisan buffy coat diambil dan dibuat sediaan hapus dan dipulas www.themegallery.com 8

9. Metode Menggunakan Clotted Blood Darah vena 10 ml dibiarkan beku pada suhu kamar kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 2 jam Bekuan darah diambil dan ditempatkan di atas saringan yang terbuat dari kawat. Serum dan sel yang keluar dari saringan dimasukkan dalam tabung Metode Menggunakan Clotted Blood Disentrifus pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit Diambil 1 ml lapisan yang teratas dari sel, dimasukkan ke dalam tabung Wintrobe dan disentrifus lagi pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan lapisan buffy coat Dibuat sediaan hapus dari buffy coat dan dipulas dengan pewarnaan Romanowsky www.themegallery.com 9

10. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekosit Orang Normal (1) Serum : darah vena10 ml dibiarkan beku pada suhu kamar, kemudian disimpan pada suhu -20°C sampai digunakan. 1 2 Normal Leucocyte Suspension : darah golongan O, jumlah 5 ml dimasukkan dalam tabung yana berisi heparin 1 ml.Disentrifus pada kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Setengah bagian bawah dari sel dibuang dengan memakai pipet Pasteur,sisanya dicampur dan dibiarkan mengendap pada suhu 37°C sampai didapat 1 – 2 ml plasma.Supernatan plasma ini disentrifus pada kecepatan 1000 rpm dan dicuci 3 kali dengan normal salin. Kemudian salin dibuang dan suspensi lekosit ditampung (0,5 ml) www.themegallery.com 10

11. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekosit Orang Normal (2) Campur 1 volume serum dan 1 volume suspensi dan diinkubasi 37°C selama 3 – 4 jam 3 Disentrifus pada 1000 rpm selama 5 menit, lapisan buffy coat dibuat sediaan hapus dan dipulas dengan pewarnaan Romanowsky 4 www.themegallery.com 11

12. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekositnya Sendiri(1) 1 Persiapan spesimen dan merusak dinding lekosit a. Darah vena 10 ml diletakkan pada waterbath dengan suhu 37°C selama 1 – 2 jam sampai terjadi bekuan. Kemudian bekuan dengan kawat saringan diletakkan pada mortir dan dihaluskan dengan alat penumbuk b. Darah heparin 5 ml dalam tabung 15 ml yang berisi glass bead, disentrifus pada kecepatan 50 rpm selama 30 menit pada suhu 37°C. Kemudian diletakkan pada suhu 37°C selama 15 menit www.themegallery.com 12

13. Metode Mereaksikan Serum Pasien dengan Lekositnya Sendiri (Lanjutan...) Spesimen darah dipindahkan ke beberapa tabung Wintrobe dengan pipet Pasteur, disentrifus pada kecepatan 2500 rpm selama 20 menit. Serum yang hemolisis dipindahkan, buffy coat disimpan 2 3 4 Diperiksa dengan mikroskop pada pembesaran 1000x Bagian buffy coat dipindahkan dengan pipet Pasteur yang bersih, diteteskan ke 3 slide mikroskop, dibuat hapusan dan dipulas dengan pengecatan Leishman atau Wright www.themegallery.com 13

14. Metode di RSU Dr. Soetomo(1) Darah vena 5 ml dibiarkanbekupadasuhuruangan 1 – 2 jam Serum dibuang dan bekuannya dihaluskan dalam mortir. Setelah halus, diambil dengan pipet kapiler Metode di RSU Dr. Soetomo Dibiarkanselama 10 – 15 menit agar terjadifagositosis Kemudian disentrifus pada kecepatan 2000 rpm selama 5 menit Lapisanbuffy coatdiambildandibuathapusan Pewarnaan dengan giemsa selama 3 – 4 menit. Dibilas air dan dilihat dengan mikroskop dengan pembesaran 1000x www.themegallery.com 14

15. Metode di RSU Dr. Soetomo(2) Syarat pembacaan : 1 Dibuat 3 buah hapusan buffy coat Diperiksa dengan mikroskop pembesaran 1000x selama minimal 10 menit 2 www.themegallery.com 15

16. INTERPRETASI Positif Negatif False negatif False positif rheumatoid arthritis, anemia hemolitik, interaksi obat (penisilin, hidralazin, obat antikonvulsi, metildopa) didapatkan kurang dari 2 sel LE didapatkan minimal 2 sel LE pemakaian adenokortiko-steroid, severe leucopenia, remisi spontan www.themegallery.com 16

18. Membedakan Sel LE dengan Sel Tart (2) Sel LE Sel Tart 18

19. PENUTUP Di daerah penggunaan pemeriksaan sel LE masih dipertimbangkan, meski dari penderita SLE yang diperiksa hanya 75% yang ditemukan sel LE-nya, karena relatif lebih murah dibanding pemeriksaan ANA www.themegallery.com 19

20. Atas Perhatiannya Terima Kasih 20

21. KEPUSTAKAAN Brown, Barbara A. Hematology : Principles and Procedures. 3rd ed. Philadelphia : Lea & Febiger, 1980, pp. 184 - 187 Dacie, S.J.V. et al. Practical Haematology. 7th ed. Singapore : Churchill-Livingstone, Medical Division of Longman Group UK Ltd, 1991, pp. 530 – 532 Dacie, S.J.V. et al. Practical Haematology. 8th ed. Singapore : Churchill-Livingstone, Medical Division of Longman Group UK Ltd,1998, pp. 569 – 571 Harrison. Prinsip-PrinsipIlmuPenyakitDalam. 13th ed. Volume 4. Jakarta : EGC, 2000, pp. 1834 – 1839 Mukherjee, Kanai L. Medical Laboratory Technology. 1st ed. Volume I,New Delhi : Tata Mc. Graw Hill Publishing Company Limited, 1988, pp. 337 – 341 Seiverd, Charles E. Hematology for Medical Technology. 5th ed. Philadelphia : Lea & Febiger, 1983, pp. 522 – 527 Simmons, Arthur. Technical Hematology. 3rd ed. Philadelphia : J.B. Lippincott Company, 1980, pp. 126 – 129, 145 SimposiumNasional I Systemic Lupus ErythematosusdanPembentukanPerhimpunan SLE Indonesia. Jakarta, 1995 21

22. Buffy Coat 22

23. Buffy Coat

24. Pewarnaan Giemsa Komposisi : Bubuk warna Giemsa 0,75 g Methanol 65 ml Glycerol 35 ml Buffer : KH2PO4 6,63 g Na2HPO4 3,20 g Aquades ad 1000 ml Panaskan 50° /15 menit lalu saring Sebagai stok cat Giemsa Larutan cat Giemsa kerja: Encerkan dengan buffer dengan perbandingan 1 : 4-5 24

25. Tehnik Pengecatan Giemsa Fiksasimetanol 1 – 2 menit Tuangihapusandenganlarutankerja cat giemsa 20 – 30 menit Cucidengan buffer Keringkandanlihatdibawahmikroskopdenganpembesaran 1000 x 25

26. Pewarnaan Wright Komposisi : Eosin & Methylene blue dg pelarut methanol Buffer : KH2PO4 6,63 g Na2HPO4 3,20 g Aquades ad 1000 ml 26

27. Tehnik Pengecatan Wright Hapusandarahkeringdifiksasidenganmeneteskan cat wrightmenutupi rata hapusandarah, selama 2 menit Meneteskanlarutan buffer samaatau 1,5 kalinya. Tiupsampaitimbulwarnametalikdantunggusampai 20 menit Cucihapusandengan air, sampaiseluruhlapisan cat tercuci Keringkandanlihatdenganpembesaran 1000 x 27

28. Pewarnaan Leishman Komposisi : Bubuk warna Leishman 0,2 g Methanol 100 ml Buffer : Disodium hydrogen phosphate 3,76 g (Na2HPO4-2H2O) Potassium dihydrogen phosphate anhydrous (KH2PO4) 2,10 g Aquades ad 1000 ml Bilas botol bersih dengan metanol tambah beberapa glass beads, tambahkan bubuk warna dan metanol ,kocok agar larut. 28

29. Teknik Pengecatan Leishman Fiksasidenganmetanol 2-3 menit PengenceranLeishmanstainningdenganlarutan buffer ( 1: 2 ). Biarkanselama 7 – 10 menit Bilasdenganlarutan buffer. Biarkan 2 - 3 menit Buangsisalarutan buffer dankeringkan Lihatdenganmikroskoppembesaran 1000X 29

30. Kriteria ARA (American Rheumatology Association) 1982 Ruamkupu-kupu Lupus diskoid Fotosensitivitas Ulkusronggamulut Artritis Serositis a. Pleuritis : terdengar “gesekan” olehdokteratauefusipleura atau b. Perikarditis : tampakpada EKG atau “gesekan” atauadanyaefusi pericardial KelainanGinjal a. Proteinuriapersisten > 0,5 g/dl per hari 30

31. Kriteria ARA (2) 7. b. Silinderselular; mungkinseldarahmerah, hemoglobin, granular tubular ataucampuran Kelainanneurologis a. Seizures (serangantiba-tiba); tanparangsanganobatataukekacauanmetaboliktertentu b. Psikosistanparangsanganobat Kelainanhematologis a. Anemiahemolitik; denganretikulosis, atau b. Lekopenia : 4.000 sel/µL padaduaataulebihpemeriksaan, atau c. Limfopenia : 1.500 sel/µL padaduaataulebihpemeriksaan, atau d.Trombositopenia : 100.000 /µL tanpaadanyagangguanobat 31

32. Kriteria ARA (3) Kelainanimunologis a. Sel LE positifpadasediaan, atau b. Anti DNA : adanyaantiboditerhadap DNA asli dengantiter abnormal, atau c.Anti-SM : adanyaantiboditerhadap antigen- nuklear-SM (Smooth Muscle) d.STS (Serologis test for syphilis) positifpalsu paling sedikit 6 bulantesTPI (TreponemaPallidumImmobilization) atau FTA (Fluorescence TreponemalAntibody). 11. Antibodi-antinuklear : suatutiterabnormal antibodi- antinukleardengancaraimunofluoresen 32

33. PEMERIKSAAN ANA(ANTINUCLEAR ANTIBODY) POSITIF PADA BEBERAPA PENYAKIT AUTOIMUN: - SLE, SJOGRENS SYNDROMES 33

34. DETEKSI ANA Beberapa otoantibodi dapat merupakan suatu petanda (marker) pada penyakit tertentu, seperti anti ds-DNA, anti-SM, anti PCNA untuk SLE Anti Sc 170 dan anti centromer (ACA) untuk Sklerosis Sistemik 34

35. Substrat antigen : sel kultur HEp2(human carcinoma larynx) Bahan : serum, pengenceran 1:25 / 1:40 Tehnik : IMUNOFLUORESEN yang memberi fluoresensi khas (memakai mikroskop fluoresen) 1. Fluoresensi Nuklear : 5 pola Cenderung pada penyakit : (tidak spesifik) 1.1 Homogen SLE 1.2 Speckled UCTD, PSS, SLE 35

36. 1.3 Rim SLE 1.4 Nucleolar PSS, SLE 1.5 Centromere CREST 2. Fluoresensi Cytoplasmic : dijumpai pada penyakit : 2.1 Fine Speckled (JO-1) SLE 2.2 Ribosomal-p UCTD, PSS, SLE 36

37. Spektrum penyakit autoimun Organ spesifik Hashimotos thyroiditis Thyrotoxicosis Insulin dependent diabetes mellitus Autoimun haemolytic anaemia Idiopathic thrombocytopenic purpura Primary billiary cirrhosis Ulcerative colitis 37

38. Spektrum penyakit autoimun Non organ spesifik Sjogrens syndrome Rheumatoid arthritis Dermatomyositis Scleroderma Mixed connective tissue disease Discoid lupus erythematosus Systemic lupus erythematosus (SLE) 38

39. Pembentukan sel LE menurut Dacie (1993) Lekosit ——> Diberikan trauma : -mekanis - kimiawi Kerusakan membran sel lekosit Inkubasi : inti sel lekosit kontak dengan faktor LE yang ada dalam serum (gama globulin) Depolimerisasi inti, struktur kromatis hilang, massa homogen komplemen Difagosit netrofil yang aktif Sel LE 39

40. Prinsip Pemeriksaan Serum pasien ---->gamma globulin yang secara langsung menuju ke inti lekosit. Inti sesudah bereaksi dengan faktor LE---->badan LE dengan ciri-ciri : bulat, homogen, inti yang terbentuk yang menarik netrofil dan ditelan oleh satu netrofil disebut sel LE. Sel LE mengambil pewarnaan dan dapat dikenali di bawah mikroskop ketika membuat hapusan buffy coat Memerlukan lekosit yang mengalami trauma. Sel LE sering hampir sama dengan Tart Cell ---->monosit memfagosit sel lain biasanya lekosit atau sel nukleus yang lain. 40

41. Sensitivitas Diagnostik = TP x100% TP+FN Jumlah penderita yang memberikan hasil positif dari semua penderita yang diperiksa dengan dugaan menderita penyakit tsb Spesifisitas Diagnostik = TN x 100% TN+FP Jumlah penderita yang memberikan hasil negatif dari semua penderita yang diperiksa dengan dugaan tidak menderita penyakit tsb 41

42. Nilai Ramal Positif = TP x 100% (~ Sp) TP+FP Jumlah penderita dengan hasil benar2 positif dari semua penderita yang memberi hasil positif Nilai Ramal Negatif = TN x 100% (~ Sn) TN+FN Jumlah penderita dengan hasil yang benar2 negatif dari semua penderita yang memberi hasil negatif 42