1. Abundancia y Diversidad funcional de bacterias
fijadoras libres de nitrógeno en suelos del Sur del
Trapecio Amazónico Colombiano
Andrea Mantilla M.Sc
Andrea Mantilla M.Sc
Andrea Mantilla M Sc
Septiembre de 2010
Septiembre de 2010

2. Contenido
1. Introducción
2. Objetivos
3. Metodología
3 M d l
4.
4 Resultados
5. Conclusiones
Flor de Inirida. Fuente: Rene López

3. Introducción
Amazonia: Reserva Natural de Biodiversidad
Bosque húmedo tropical. PNNA. Fuente: Augusto Mazorra. Mico. Tarapacá. Fuente: René
López. Heliconias. Guaviare. Fuente: René López. Comunidad Indígena. Fuente: René López
?

4. El suelo y la rizósfera
El suelo y la rizósfera
 Diversidad de macro y
microorganismos.
 Ciclos biogeoquímicos.
 Actividad microbiana
microbiana.
P y N más limitantes.
Perfil Suelo Amazónico. Fotografía Clara Peña.

5. FBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la Tierra
FBN: Mantenimiento del equilibrio de N en la Tierra
Arazá. Fuente: Jaime Barrera
amaneciendopensamientos1.blogspot.com/2008/03 Cocona. Fuente: Jaime Barrera

6. Bacterias fijadoras de nitrógeno
Bacterias fijadoras simbióticas Bacterias diazótrofas
Formación de nódulos. Fuente: http://locuras‐ Formación de quistes de Azotobacter sp.p. Fuente:
mooy.blogspot.com
mooy blogspot com http://locuras‐mooy.blogspot.com
http://locuras‐mooy blogspot com

7. Diazótrofas PGPR
1 2 3
Fijación de Nitrógeno Producción de Auxinas
Desarrollo Vegetal
1)Azospirillum. Fuente: http://www.dista.unibo.it. 2) Morfogénesis Copoazú. Fuente: Olga Rodríguez. 3)
Ensayo matera. Fuente: http://www.dista.unibo.it. 4) Copoazú. Fuente: Jaime Barrera
4

8. Objetivo general
Estimar la abundancia y diversidad funcional
de bacterias diazótrofas aisladas en suelos del
sur del trapecio amazónico colombiano para
p p
seleccionar aislamientos con potencial para el
desarrollo de preformulaciones.

9. Objetivos específicos
Objetivos específicos
Aislar y caracterizar la comunidad cultivable de bacterias diazótrofas
a partir de suelo.
Evaluar y seleccionar in vitro los microorganismos diazótrofos con
g
mayor capacidad fijadora de nitrógeno.
Evaluar y seleccionar in vitro aislamientos diazótrofos productores de
AIA.
Evaluar l efectividad d b t i di ót f como promotoras d
E l la f ti id d de bacterias diazótrofas t de
crecimiento vegetal sobre el crecimiento de cocona bajo condiciones
de cultivo in Vitro.

10. Área de estudio
Área de estudio
Bosque PNNA. Fuente: Augusto Mazorra
Pastizal. Finca ganadera Villa Claudia. Fuente: J. P. Forero
Chagra .Fuente: Clara Peña

11. Aislamiento de diazótrofas
Aislamiento de diazótrofas
10 g de muestra en 90 ml Cortar raíces, macerarlas
C í l
de S.S. 0,85% (10‐1) y homogenizar con el suelo
Agitación a 250 rpm x 1 h 30°C
Diluciones seriadas hasta 10 ‐5
M
A I
E Siembra dilución 10‐4 en medios C
Burk´s y Ashby Incubar x 8 d 30ºC
R R
O O
B Siembra diluciones 10 ‐2 a 10 ‐5 A
I Incubar x 5 d 30 C
Incubar x 5 d 30°C en JMV y Nfb semisólidos E
O Recuento (UFC/g de suelo) y R
S descripción morfológica O
L
Recuento por NMP/g de suelo y
R t NMP/ d l I
protocolo de Dobereiner O
S

12. Ensayos ARA y AIA
Cromatografía de gases
y suspensión Reemplazo de 0.2%
S S 0 85%
en S.S. 0.85% Inoculación con C2H2
C2H2
DO: 1.8 – 2.2 Incubación Aerobios: 4.5h
BHI x 24h Abs: 600nm por 48h Microaerófilos: 24h
30ºC
Producción de C2H4
Centrifugar y
filtrar
C.N + Trp 0.3% x
C.N + Trp 0.3% x
72h en
oscuridad
Cromatograma de HPLC muestra 35‐2
Cromatografía Líquida

13. Amplificación gen nifH
Amplificación gen nifH
A B C
E D
(A): Extracción DNA. Fuente: Corpogen. (B): Amplificación nifH. Fuente: E. Mendoza. (C): Secuenciación. Fuente: Sinchi –
Corpogen. (D): Alineamiento de secuencias NCBI‐GB. Fuente: Corpogen. (E): Análisis filogenético. Fuente: Corpogen.

14. Evaluacion del efecto promotor
Evaluacion del efecto promotor
Porcentaje de germinación
y evaluación viabilidad de Tª ambiente y exposición
y p
a luz directa
semillas
Selección de 5
aislamientos: altos valores Valores de ARA:12,518 (847,25
de ARA y valores + 551,9 nmoles de
bajos, medios y altos de etileno/h/ml).
AIA
Preparación del inóculo Cultivos de 24‐48 h en
microbiano en buffer PBS. AN a una concentración
final de 106 UFC
Inoculación: 5 replicas por 25C con un fotoperiodo de
inoculo, cada replica con 10 16 horas de luz y 8 h de
semillas. N= 350 oscuridad durante 5 días. .

15. Abundancia Diazótrofas Aerobias y Microaerófilas
Abundancia Diazótrofas Aerobias y Microaerófilas
Diazótrofas aerobias Diazótrofas Microaerófilas
140
1.20E+03
UFC/g de suel o (10 exp5)
120
1.00E+03
g de suelo
100 8.00E+02
80 6.00E+02 Terraza
NMP/g
60 Terraza 4.00E+02 Várzea
40 Varzea 2.00E+02
20 0.00E+00
Bosque Pastizal Chagra
0
PASTIZAL CHAGRA BOSQUE Cobertura
COBERTURA
 51 aislamientos agrupados en 19 morfologías.
 Nº de Morfologías: B > CH > P.
Distribución morfologías: B > CH > P.
 No relación entre paisajes y distribución de morfologías

16. Ensayo de ARA
Ensayo de ARA
Relación ARA y Cobertura
3000
 Aislamientos aerobios: Valores hasta
2500
ileno/hora/ml de
11,062 + 170,24 nmoles etileno/hora/ml
2000
de medio de cultivo de Burk´s.
medio de cultivo
1500 Diazótrofos aerobios
 Aislamientos microaerofilos: valores
d
1000
nmoles de eti
500 hasta 8905,72 + 1117,57 nmoles
0 etileno/hora/ml de medio Nfb.
BOSQUE PASTIZAL CHAGRAA. vinelandii
Control positivo (Azospirillum
Aislamientos ARA positivo brasilense ): valores entre 847,25 + 551,9
Medio de Aislamientos Aislamientos
nmoles de etileno/hora/ml.
cultivo recuperados
p ARA (+)
( )
 117 aislamientos fueron ARA (+) 38
(+),
Burk´s 76 28
perdieron está capacidad, siendo 79 los
Ashby 51 45 que se encuentran conservados en
Nfb 110 39 CryoBank.
y
JMV 76 5
TOTAL 313 117

17. GC1
Producción de compuestos indólicos
Producción de compuestos indólicos
 41 aislamientos registraron valores de producción de AIA por HPLC mayores a los
registrados por el control positivo A. lipoferum, con valores que oscilan entre 16,61 + 0,52 y
357,13 + 22,43.
 Los valores de AIA reportados por los aislamientos de bacterias diazótrofas del banco del
Instituto han sido hasta 100 veces mas altos que bacterias de los mismos géneros aisladas
en maíz (Bashan, 2004), pastizales y caña de azúcar (Baldani et al. 2007).

18. Diapositiva 17
GC1 Gladys Cardona, 25/04/2010

19. Amplificación del gen nifH
Amplificación del gen
Amplificación del gen nifH
2 y 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C+ C‐ MP
320 pb
6
Filotipo Alineamiento de secuencias
1 Bradyrhizobium sp CBC
sp.,
2 A. Vinelandii, CBC
3 A. Vinelandii, CBC
4 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
5 K. pneumoniae, Enterobacter sp. CBC
7
6 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
7 Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
8 K. pneumoniae, Enterobacter sp. , P. agglomerans, CBC
9 Paenibacillus sp., CBC
10 S. enterica, Enterobacter sp. y CBC 4

20. Efecto promotor sobre semillas de Cocona
Efecto promotor sobre semillas de Cocona
Viabilidad y Calidad de las semillas Medición tamaño de la radícula
Figura 1. Determinación del efecto de bacterias diazótrofas Figura 2. Efecto de bacterias diazótrofas sobre el crecimiento y
sobre el crecimiento de la radícula de semillas de cocona. germinación de semillas de cocona, dado en peso seco.

21. Conclusiones
La FBN de bacterias diazótrofas de la región amazónica (a partir de los
ensayos de ARA) mostraron una alta eficiencia (400% mas fijación)
ARA),
comparados con los controles positivos usados A. Vinelandii .
 l valores d AIA reportados por l aislamientos d b
los l de d los i l i de bacterias di ó f
i diazótrofas
del banco del Instituto han sido hasta 100 veces mas altos que bacterias de
los mismos géneros aisladas en maíz (Bashan, 2004), pastizales y caña de
azúcar (Baldani et al 2007)
al. 2007).
 Los resultados de secuenciación del gen nifH agruparon los aislamientos
en 10 fil ti
filotipos, en d d el fil ti (7) albergó a l mayoría d aislamientos.
donde l filotipo lb ó la í de i l i t
La mayoría de éstos géneros pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
ampliamente reportados como fijadores de nitrógeno y patógenos para el
hombre,
hombre animales y plantas
plantas.

22. Conclusiones
S d
Se destaca que más d l 50% d l
á del de los alineamientos d l secuencias
li i de las i
encontradas corresponden a bacterias no cultivables, resaltando que gran
parte de las bacterias diazótrofas existentes en la zona de estudio son géneros
aún desconocidos y por tanto constituyen una fuente de nuevas especies
especies.
 El banco de bacterias diazótrofas del sur del Trapecio Amazónico se
destaca por su potencial promotor d crecimiento vegetal, constituyéndose
d i l de i i l i é d
como un insumo importante para el desarrollo de preformulaciones
microbianas para potencializar el efecto de enmiendas orgánicas sobre el
desarrollo de cultivos de importancia económica para la región amazónica
colombiana.

23. Muchas Gracias