3. Presupone el cultivo de plantas o partes de plantas
(explantos) en un medio de cultivo apropiado
El cultivo se desarrolla en condiciones de
temperatura, humedad, fotoperíodo e irradiancia
controlados.
La manipulación se realiza en cabinas de flujo laminar
Esta técnica es importante en la propagación de
especies de interés agroforestal y agrícola:
micropropagación
4. Producen innumerables productos de importancia en
la industria farmacéutica, cosmética y
alimentaria, como alcaloides, compuestos aromáticos
o pigmentos.
Los cultivos in vitro permiten obviar los
inconvenientes derivados de condiciones
geográficas, climáticas y de tiempo de producción.
5.
6. Plasticidad
Totipotencialidad
Es la capacidad de una célula vegetal de dar
lugar al desarrollo de una planta completa. Las
células totipotentes son células somáticas que
han retenido su capacidad de dividirse y
diferenciarse en una planta madura si se
coloca en el medio adecuado.
7. Definición
Cultivo aséptico in vitro de cualquier parte de
una planta en un medio nutritivo.
Tipos de cultivos:
cultivo de células
cultivo de tejidos
cultivos de órganos
8. Puede definirse como el conjunto de
técnicas que permiten el cultivo en
condiciones asépticas de órganos,
Tejidos, células y protoplastos.
CULTIVO DE TEJIDOS
9. es una herramienta de gran utilidad en la biotecnología
Está técnica se basa en la "totipotencialidad celular";
capacidad de una célula vegetal de formar una planta
completa bajo ciertas condiciones químicas y
físicas, dadas en el cultivo in vitro
se obtiene la propagación rápida y masiva de plantas
idénticas a la original a partir de cualquier parte aislada
de la planta, sean estos trozos de tejidos, ápices
meristemáticos o incluso células aisladas.
Inicialmente se usó esta técnica para la multiplicación
masiva de plantas élites o micro propagación y también
en la obtención de clones libres de virus.
C
A
R
A
C
T
E
R
I
S
T
I
C
A
S
10. El cultivo in vitro es un método
de propagación de plantas de
aplicación profesional, puesto que se
realiza en laboratorio, en unas
condiciones estériles y con unas
instalaciones especiales.
El cultivo in vitro consiste en tomar un
trocito de hoja, un embrión, una
porción pequeñita de tallo (de 0,2 a 1
milímetro) o cualquier otra parte de
una planta y ponerla a cultivar en un
tubo de ensayo sobre un medio acuoso
nutritivo.
Lo fundamental es que se hace en
unas condiciones muy controladas y
totalmente estériles
Multiplicación o reproducción de frutal
in vitro
11. Organizado:
Se refiere al tipo de cultivo que se inicia con una parte organizada de la
planta (ápices, hojas, brotes, semillas, etc.) y esa parte u órgano sigue
creciendo in vitro manteniendo sus características estructurales. Se aplica
también cuando se desarrolla una estructura a partir de un tejido
desorganizado.
Desorganizado:
Este tipo de crecimiento se caracteriza porque a partir de fragmentos de
tejidos u órganos se produce un tejido sin estructura especifica que
contiene un numero limitado de algunos tipos de células especializadas
encontradas en una planta intacta. Un tejido desorganizado puede crecer
con subcultivos y puede ser mantenido en medio solido o liquido durante
varios meses o años. Puede ser usado para iniciar suspensión de células y
protoplastos.
14. Callos : en medio sólido,
crecimiento lento, gran
heterogeneidad celular,
Cultivos en suspensión:
derivan de los anteriores,
en medio líquido de
composición adecuada,
crecimiento más rápido y
homogéneo.
Composición del medio de
cultivo. Fuente de carbono,
minerales, vitaminas,
fitohormonas (auxinas,
citoquininas)
15. Tejidos no diferenciados ( a veces
diferenciados), en división activa.
Frecuentemente se desarrollan a partir de
heridas.
16. Mezcla de sustancias en los que las
células, tejidos y órganos pueden dividirse y
crecer.
Sustancias inorgánicas: N, P, K, Ca, Mg, Cl, Na
Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co, I
Suplementos orgánicos complejos: leche de
coco, extracto de levadura.
Reguladores de crecimiento : hormonas.
Fuente de carbono: sacarosa
Con o sin agar: medio semi -sólido o líquido.
17. Hormonas/ Fitohormonas:
Auxinas: grupo de hormonas vegetales
(naturales o sintéticas) que inducen
la elongación, o en algunos casos la
división celular.
Frecuentemente inducen
raíces adventicias e inhiben la
formación de tallos
adventicios.
Cytokininas: grupo de hormonas
vegetales (naturales o sintéticas) que
inducen división celular y frecuentemente
tallos adventicios y en muchos casos
inhiben la formación de raíces
adventicias.
Reglas generales para la acción hormonal:
• Auxina : Cytokinina = ~1 Callo
• Auxina : Cytokinina < 1 Tallo
• Auxina : Cytokinina > 1 Raíces
Son producidos por microorganismos
18. 1. Explanto: porción de tejido u órgano que se
separa de la planta para iniciar el cultivo.
2. Esterilización: procedimiento para la
eliminación de microorganismos.
Autoclave: aparato en el que el medio, material d
vidrio, instrumental, etc., es esterilizado por vapor
bajo presión (121oC, 15 psi, 10-20 min.).
Requerimientos de asepsia: desinfección de superficie
del explanto: generalmente usando lavandina comercial
diluido para evitar el desarrollo de microorganismos.
Cabina de flujo laminar: área de trabajo, mantenida
estéril por el flujo continuo, no turbulento de aire
estéril.
19. Subcultivo: pasaje
de
células, tejidos, órga
nos, etc. Desde un
medio de cultivo
agotado a otro medio
fresco.
Micropropagación:
propagación
vegetativa in vitro de
plantas.
20. Diferenciación: desarrollo de células o tejidos con una función
específica y/o regeneración de órganos, estructuras tipo
órganos (raíces, tallos) o embriones.
Adventicios: desarrollo de órganos
(raíces, yemas, tallos, flores, etc.) o embriones (embryo-like
structures) desde puntos de origen no usuales, incluyendo callos.
21. Formación de tallos, raíces, flores, etc.
¡¡Regeneración de una planta completa!!
Explanto
Organogénesis
Formación de tallos Formación de raíces
Enraizamiento Tallos
Planta completa
22.
23.
24.
25.
26.
27. Proceso mediante el cual se desarrolla un embrión a partir de una
célula huevo fertilizada o asexualmente desde un grupo de células
somáticas (embriogénesis somática).
28. Procedimiento para la regeneración vía
embriogénesis somática
1. Iniciación: callos embriogénicos
2. Proliferación: callos embriogénicos, masas
proembriogénicas (PEM)
3. Desarrollo y maduración de embriones :
embriones
4. Germinación de embriones (Regeneración)
Estadíos de desarrollo en dicotiledóneas:
Masas proembriogénicas
Estadío globular
Torpedo
Embrión somático
29.
30.
31. Semillas sintéticas (artificiales)
1. Producción en masa de semillas genéticamente
mejoradas.
2. Procedimientos:
Encapsular en cápsulas de gel, recubrir con una cubierta
adecuada, almacenar
3. Encapsulación de embriones somáticos:
protección, nutrición, permeable al agua, biodegradable.
Polímeros: gel de alginato, gelatina, agar, goma, etc.
32. Variación fenotípica, genética o epigenética en su
origen.
Permite describir la variabilidad genética observada
en tejidos regenerados a partir de cultivos in vitro
Es común cuando se regeneran plantas a partir de
callos, o cuando los cultivos se establecen a partir de
explantos que no contienen un meristema pre-
organizado.
En muchos casos, el grado de variación es proporcional
a la duración del cultivo in vitro.
Se aplica para mejora de cultivos
33. Protoplasto: célula vegetal sin pared celular
Procedimiento:
(1). Digestión de la pared celular: celulasa,
hemicelulasa, pectinasa. Son producidos por
microorganismos.
(2). Regeneración de la pared celular:
usualmente dentro de las 24 hrs.
(3). División celular: la primera división ocurre
dentro de las 24-48 hrs
(4). Proliferación y diferenciación
34.
35. Aplicaciones:
1. Remoción de pared para captación de DNA :
Microinyección y electroporación
2. estudios de síntesis de pared
celular, transporte de
membrana, citoesqueleto.
3. estudio de desarrollo de embriones
somáticos.
4. hibridización somática (cybridización) de
especies sexualmente compatibles o
incompatibles, por fusión de protoplastos se
obtiene un nuevo germplasma.
36.
37.
38. 1. Mantenimiento del background genético
deseado: micropropagación.
2. Producción en gran escala de cultivares
apropiados: embriogénesis somática
3. Síntesis de productos usando técnicas de cultivo
continuo.
4. Eliminación de virus y otros patógenos.
5. Regeneración de plantas obtenidas por
ingeniería genética.
39. Raíces y tallos
transformados: obtenidas
por transformación
genética con la bacteria
patógena del suelo
Agrobacterium sp.
Se pueden usar para la
producción de metabolitos
derivados de
raíces, crecimiento
rápido, mayor estabilidad
genética, mayor
productividad.
40. El uso de la biotecnología moderna implica,
inicialmente, el conocimiento y aislamiento de
secuencias de ADN que corresponden a genes
responsables de conferir una característica deseada
(fenotipo)
El aislamiento de los genes de interés es realizado por
medio de técnicas de clonado molecular
41. Inducción de la amplificación de una secuencia de
ADN en un organismo vivo.
Vectores de clonado (plásmidos o virus): vectores
en los que la secuencia de ADN es introducida
usando una DNA ligasa. Cuando es necesario el
fragmento de ADN de interés puede ser liberado
del vector por medio de enzimas de restricción.
Una vez aislados los genes de interés son
incorporados al organismo blanco resultando en
un organismo genéticamente modificado (OGM) y
esta característica adquirida pasa a ser hereditaria
42. Es posible transferir genes de
animales, bacterias o virus a las
plantas.
Se amplían los recursos para el
mejoramiento genético.
Los genes de un organismo que son
insertados en otro se denominan
transgenes y tienen la capacidad de
conferirle a este último una
determinada característica.
43. Son excelentes modelos para el estudio de procesos
generales básicos como regulación de la expresión
génica y la genética molecular del desarrollo y
diferenciación celular
Ofrecen la posibilidad de corrección de numerosas
enfermedades hereditarias: terapia génica
44. Pueden funcionar como bioreactores para la
producción de proteínas valiosas o con propósitos
industriales
Deben ser capaces de producir la proteína de
interés en niveles aceptables sin comprometer el
normal funcionamiento de sus células
Deben tener la capacidad de transmitir esta
característica a las siguientes generaciones
En el caso de ser un organismo multicelular deben
ser capaces de producir la proteína exógena en un
órgano definido
45. Acoplar a la secuencia de ADN que codifica para la
proteína de interés secuencias de ADN que
contengan señales responsables de dirigir altos
niveles de producción (promotor) de la proteína
deseada en un órgano específico.
Las técnicas para la inserción de ADN en células
vegetales (transformación) usadas son:
Infección con Agrobacterium tumefaciens
Electroporación de protoplastos
Método biolístico
46. Los primeros experimentos a campo con plantas
transgénicas se realizaron en 1986 en Estados Unidos
y en Francia.
En 1996 y 1997 el número de países que ensayó
plantas transgénicas a campo aumentó a 45
habiéndose realizado en 2 años mas de 10 mil
experimentos.
Los cultivos más usados fueron:
maíz, tomate, soja, batata, algodón, canola.
Las características genéticas introducidas son
tolerancia a herbicidas, resistencia a
insectos, calidad de producto y resistencia a virus.
47. La técnica del clonado in vitro es posible mediante el
cultivo de tejidos
Esta técnica se basa en la totipotencialidad de las
células vegetales, por medio de la regeneración in
vitro, vía organogénesis o embriogénesis somática
48. Se producen cambios por inserción de un gen
proveniente de otro organismo
La transferencia de DNA/genes de un organismo a
otro se realiza sin necesidad de reproducción
sexual.
La transformación exitosa depende de la
incorporación estable del gen nuevo en el genoma
de la planta receptora y su subsiguiente
transmisión a sucesivas generaciones.
49. Requerimientos
Mecanismo de transferencia del gen
Mecanismos de transferencia indirecta
Mecanismos de transferencia directa
Sistemas de regeneración
50. Mediada por Agrobacterium:
Agrobacterium es una bacteria patógena del suelo
para dicotiledóneas y algunas coníferas.
• Agrobacterium tumefaciens – crown gall disease
(tumors)
• Agrobacterium rhizogenes – hairy root disease
(hairy roots)
Las Monocotiledóneas presentan resistencia
natural a Agrobacterium.
51. Agrobacterium tumefaciens & crown gall
disease
Crown gall disease produce nódulos anormales en
raíces. Los árboles jóvenes no crecen, en los
árboles adultos la corteza se pudre.
Esta bacteria entra al árbol a través de heridas.
52.
53. Agrobacterium tumefaciens
La enfermedad crown gall resulta de la
expresión de genes codificados por un
segmento de DNA de la bacteria que se
transfiere e integra en forma estable al
genoma vegetal
El fragmento de DNA bacteriano
contiene genes que producen hormonas
cuando se expresan en las células
vegetales ocasionando divisiones y
crecimiento anormales (tumores).
Agrobacterium es un “ingeniero genético
natural”(1983).
Es un mecanismo de transferencia entre
reinos
54. Transformación mediada por Agrobacterium
Plásmido Ti: plásmido inductor de tumores (A.
tumefaciens)
Plásmido Ri: plásmido inductor de hairy roots (A.
rhizogenes)
T-DNA: DNA que se transfiere
1. genes para síntesis de hormonas: codifican para enzimas
involucradas en la biosíntesis de auxinas y citoquinias. La
expresión de estos genes en la célula vegetal causa la
enfermedad de agalla de corona o la formación de hairy roots
2. Secuencias en los bordes: 25 bp direct repeats, borde derecho
(RB) y borde izquierdo (LB),a ambos lados del T-DNA. Son los
elementos necesarios (en la región del T-DNA ) para dirigir la
transferencia del T-DNA.
55. PlásmidoTi o plásmido Ri:
Genes de síntesis de opinas: responsables de la síntesis de nuevas opinas.
Opinas: derivados de aminoácidos o azúcares producidos por tejidos vegetales infectados
que son por Agrobacterium como única fuente de carbono/nitrógeno.
Clasificación de los plásmidos Ti y Ri:
Plásmidos Ti: plásmidos Nopalina
• Octopine plasmid
• Agropine plasmid
• Succimanopine plasmid
Plásmidos Ri: plásmidos Manopina
• Agropine plasmid
• Cucumopine plasmid
56.
57. Localizados en la región T-DNA:
1.Genes de síntesis de hormonas
2. Secuencias de los bordes: LB y RB
Localizados en cualquier región del plásmido Ti:
3.Genes de síntesis de opinas
4. Genes de virulencia
Localizados en el cromosoma de Agrobacterium (4 loci)
Síntesis de fibrillas de celulosa por Agrobacterium para cubrir la superficie de la célua
vegetal(irreversible). Clusters de Agro son entrampadas en la red de fibrillas de celulosa.
• chvA ychvB (linked): síntesis y excreción de 1,2-glucan
• cel locus: síntesis de fibrillas de celulosa
• pscA locus: afectan la síntesis de cicloglicanos y ácido succinilglicano
• att locus: afecta proteínas de la superficie celular
Algunos de estos loci se encuentran conservados en otras bacterias del suelo que se interasocian con
plantas
58. Las células vegetales se vuelven sensibles a Agrobacterium
cuando son heridas.
El proceso de transferencia se puede dividir en:
En la bacteria: proceso de conjugación bacteriana
En la célula vegetal: las células heridas producen
compuestos fenólicos de bajo PM que actúan como
inductores específicos de los genes de expresión vir.
Acetosyringona (AS), hirdroxi-acetosyringona (OH-AS)
Estos compuestos fenólicos actúan a través de dos sistemas para Regular la
expresión de los genes vir
59.
60. Uso del plásmido Ti de Agrobacterium como
vector de transformación
Se remueven los genes para hormonas
(desarmado)
Para la transformación de introducen genes en
el plásmido Ti
Clonado de DNA
Genes marcadores para selección: de
resistencia a antibióticos
Cassetes:
Promotor + gen + terminador
66. A
P
L
I
C
A
C
I
O
N
E
S
Sus aplicaciones van desde estudios
teóricos sobre fisiología y bioquímica
vegetal, hasta la obtención de plantas libres
de patógenos, conservación de germoplasma,
producción de metabolitos secundarios, pro-
-pagación masiva de plantas,mejoramiento
genético,inducción de mutaciones,selección
in vitro y desarrollo de protocolos de regene-
-ración de plantas para su utilización en inge-
niería genética .
67. ACTIVIDADES (APLICACIONES)
I Producción de materiales libre de virus:
Producción de material libre de virus endémicos de Ajo y
Papa para luego llevar la semilla libre de virus por el
programa de Hortalizas.
Producción de plantas madres de frutales de hoja caduca
para vivero.
Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para la
introducción y cultivo in vitro de especies de interés
hortícola, frutícola, forestales y nativas.
68. II. Conservación de germoplasma:
Conservación en frío a mediano plazo de más de 500
materiales de interés en diversas áreas de producción.
III. Aplicaciones al mejoramiento genético:
Cultivo de anteras en arroz y rescate de embriones en
trigo para lograr un avance generacional mediante la
producción de doble haploides para los programas de
mejoramiento.
Inducción de variación somaclonal en durazno para la
mejor tolerancia a bacteriosis
69. Mantiene la identidad genética del material propagado
sin introducir ninguna variabilidad genética
Propagación clonal rápida
(floricultura, fruticultura, plantas
medicinales, silvicultura)
Eliminación de virus (cultivo de meristemas)
hibridación o fusión somática (fusión de protoplastos)
70. Bancos de germplasma
Semillas sintéticas (embriones somáticos recubiertos
de gel de alginato que también encapsula nutrientes
para el desarrollo del embrión)
71. Puede ser obtenida mediante la
utilización de inhibidores de proteasas
vegetales o a partir de toxinas
bacterianas (Bacillus thuringiensis), o
gen Bt
Como ejemplos de plantas resistentes a
insectos están el maíz, batata y soja
transgénicos
72. Esta modalidad engloba a la mayor
parte de las plantas transgénicas
actuales
Ejemplos: maíz, eucalipto, soja, caña de
azúcar
Un ejemplo cotidiano es la Soja
Roundup Ready
73. Las perspectivas son cada vez mayores a medida
que aumentan los conocimientos acerca de
fitovirus
Silenciamiento génico o protección mediada por
ARN
Por medio de la tecnología del Agrobacterium
tumefaciens o de la biolística y el cultivo de
tejidos, es posible introducir en la planta genes de
la cápside viral posibilitándose así la adquisición
de resistencia por parte de la planta.
74. Dentro del mercado de la floricultura
se abren nuevas perspectivas con el
clonado de genes asociados con la
coloración de las flores.
También se abre la posibilidad de
modificar la arquitectura de la planta y
de las flores, las fragancias y la mayor
durabilidad de las flores.
75. La empresa Calgene produjo aceites ricos en ácido
esteárico.
Se alteró la composición en hidratos de carbono con
vistas a la producción de tubérculos de papa, aumento
del contenido de almidón y reducción de amilosa
En el año 2000 se informó la obtención de arroz
genéticamente modificado que produce beta-
carotenos, precursor de la vitamina A
76. Es posible alterar rutas metabólicas para permitir
que las plantas, o sus células, funcionen como
bioreactores (reactores biológicos).
Es posible, de esta manera, la producción de
sustancias de valor farmacológico, como por
ejemplo, vacunas y biofármacos.
La manipulación del metabolismo secundario de
vegetales, por medio de la transformación
genética, promete ser una de las contribuciones
más importantes de la ingeniería genética aplicada
a la industria.
77. La sobre expresión constitutiva
de genes involucrados en la ruta
biosintética de metabolitos
secundarios podrá aumentar
significativamente la cantidad
de compuestos útiles producidos
en plantas.
Los avances en esta área
permitirán aumentar las
productividad de metabolitos
secundarios obtenidos en
cultivos in vitro con la
consiguiente reducción de costos
de producción o logrando la
producción de nuevos
compuestos.
79. Se usan para realizar reacciones
bioquímicas sencillas en las que no se
necesita diferenciación ni crecimiento
celular
Hidroxilación estereoespecífica en
posición 12- de la - metil
digoxina, glicósido cardiotónico, por
células de Digitalis lanata.
80. Diferencias más importantes en el cultivo de células
microbianas, animales y vegetales
Característica Células microbianas Células animales Células vegetales
Tamaño 1-5 μm3 105-106 μm3 105-106 μm3
Forma de crecimiento Células individuales Individuales o
adheridas a
superficies
En grupos
Tiempo de generación 1 hora 20horas >24 horas
Sensibilidad al esfuerzo
cortante
baja alta Alta
Requerimiento de oxígeno Hasta 180 mmol l-1h-1 0.7-1.0 mmol l-1 h-1 0.5-1.8 mmol l-1h-1
Requerimientos nutritivos simples complejos Simples
Población celular alcanzada
en cultivo líquido
1010 células ml-1 106 células .ml-1 106 células .ml-1
81. El cultivo de tejidos es base importante para la
biotecnología ya que al cultivar por ejemplo
tejidos , órganos, células in vitro y con las
características que se requieran se pueden
obtener diferentes productos de valor para el
hombre como los alimentos.
83. UNIDAD II
“TECNICAS DE CULTIVO”
MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACION
DOCENTE:ING IRMA CASTILLO
CARMONA.
ELABORO :ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA
ING. BIOQUIMICA
MISANTLA VER, A 27 DE MAYO DEL 2013
84. Un medio de cultivo es un material
alimenticio que se usa en el laboratorio
para el desarrollo de los
microorganismos. Una vez que ha sido
preparado, un medio de cultivo puede ser
inoculado (es decir, se le añaden
organismos) y a continuación incubado
en condiciones que favorezcan el
crecimiento microbiano. El crecimiento
de los microorganismos es el cultivo. Un
cultivo axénico o puro contiene un único
tipo de microorganismos.
85. *Los medios de cultivo deben contener los
nutrientes y factores de crecimiento
necesarios y deben estar exentos de
cualquier microorganismo contaminante.
*Los medios de cultivo contienen como
mínimo: carbono, nitrógeno, azufre, fósforo
y sales inorgánicas. En muchos casos serán
necesarias ciertas vitaminas y otras
sustancias inductoras del crecimiento.
También se añaden colorantes que actúan
como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formación de ácido o como
inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras.
86. La composición mineral se define en
forma precisa en cada uno de los
medios y está dada tanto por los
macronutrientes(N, P, K, S, Mg y
Ca) como por los micronutrientes
(B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I y
Fe). Estos nutrientes deben estar
en una concentración tal que
permita el adecuado crecimiento
celular.
87. Los requerimientos de nitrógeno son
generalmente provistos por una mezcla
de nitrato y amonio en concentraciones
variables entre 3 y 50 mM. Cuando
estas fuentes son suplementadas en
forma individual se afectan,
generalmente en forma negativa, tanto
el crecimiento del cultivo como la
producción de metabolitos .Pero, dado
que el uso de nitrato exige una mayor
demanda energética para la asimilación
del nitrógeno si se compara con el
amonio, algunos explantos crecen
mejor si se les suministra nitrógeno
reducido (Krikorian, 1991),
recomendándose en este caso la
adición de un ácido orgánico como el
succinato como agente bufferante.
88.
89. Muchas células vegetales son sensibles a los niveles de
fosfatos en el medio.
Precisamente, el mantenimiento de los niveles de fosfato
por debajo del óptimo para el crecimiento estimula
entre 3 y 4 veces la acumulación de cinamoil-
putrescina en cultivos de suspensiones de Nicotiana
tabacum e incrementa la síntesis de alcaloides en
Catharanthus roseus (Misawa, 1985).
Habitualmente, los fosfatos son almacenados en la
vacuola y adquiridos desde allí para el crecimiento.
90.
91. Generalmente se agrega calcio en mayores
concentraciones que en los medios microbianos,
variando entre 1 y 3 mM.
El hierro es esencial para el crecimiento celular y se
agrega al medio de cultivo en una concentración de
0,01 a 0,15 mM. Se aconseja la utilización del quelato
Fe-EDTA que aumenta la solubilidad del hierro.
La naturaleza y concentración de los micronutrientes
empleados en los medios de cultivo surgen
principalmente de resultados empíricos al evaluar la
capacidad de cada elemento de afectar el crecimiento
92. Puede ser necesario añadir al medio de
cultivo algunas vitaminas hasta que
los cultivos prosperen. Las vitaminas
favorecedoras del desarrollo de
cultivos in vitro y que se añaden
rutinariamente en la mayoría de los
medios de cultivo son: tiamina
(B1), piridoxina (B6) y ácido
nicotínico (Otras vitaminas que
suelen ser útiles son ácido
pantoténico, biotina, riboflavina
(B2), colina, cianocobalamina (B12) y
ácido fólico. El ácido ascórbico
(vitamina C) se considera benéfico en
algunos casos, pero probablemente
debido más a su capacidad reductora
que a su papel como vitamina.
93. El Medio de Cultivo MS (Murashige y Skoog, 1962) se
realiza con las siguientes sustancias:
94.
95.
96. *Todas las soluciones se preparan sobre un 70% de agua
del volumen final deseado, y sobre ella se van
añadiendo uno por uno todos los componentes hasta
su completa disolución. Posteriormente se ajusta el
volumen final con agua y se almacenan.
*Usar 100 ml de la solución stock de macronutrientes
para preparar 1 L de medio de cultivo MS.
97. Usar 100 ml de la solución stock de Ca para preparar 1 L
de medio de cultivo MS.
Usar 10 ml de la solución stock de micronutrientes para
preparar 1 L de medio de cultivo MS.
Usar 10 ml de la solución stock de hierro quelado para
preparar 1 L de medio de cultivo MS.
Usar 10 ml de la solución stock de vitaminas para
preparar 1 L de medio de cultivo MS.
98. En primer lugar hay que seleccionar material vegetal en
un adecuado estado de nutrición y libre de
enfermedades y plagas. Si en el material presentase
algún problema habría que descartarlo o realizar los
tratamientos adecuados.
99.
100. *El cultivo del meristemo
apical de un tallo se
emplea para la
obtención de plantas
libres de virus ya que
estos patógenos tienen
dificultades para
alcanzar esta zona
cuando la planta está
creciendo activamente
101. El microinjerto es una variante del cultivo de
meristemos que consiste en colocar el ápice caulinar
sobre una microplanta in vitro. El meristemo sería el
injerto y la microplanta el patrón.
102. El callo es una masa de células
indiferenciadas, coherente y
amorfa que se multiplica de
una manera desorganizada. Se
puede inducir in vitro
mediante la transferencia de
órganos vegetales establecidos
in vitro a medios de cultivo
adecuados, que
frecuentemente posen la
auxina 2,4 D.
103. Se pueden considerar dos situaciones dependiendo
que el explanto que se va a emplear esté protegido en el
interior de un órgano, como el embrión, o esté en
contacto con el exterior, como brotes y yemas.
Para los explantos en el interior de órganos hay que
realizar los siguientes pasos:
Lavar el explanto con agua y jabón
Lavar por 30min con cloro 10ml a 100mil de agua
Realizar una asepsia superficial del órgano con etanol
al 70 %.
Eliminar el tejido del órgano hasta alcanzar el
explanto.
Colocar el explanto en el medio de cultivo MS-O.
104. *Cortar segmentos nodales o apicales de crecimiento
activo y de un tamaño ligeramente superior al deseado.
Eliminar las hojas, si las hay, y colocarlos en un
recipiente con agua destilada.
*Lavar los explantos con abundante agua estéril y
depositarlos sobre papel de filtro para eliminar el
exceso de agua.
105. *Cortar una pequeña porción del extremo del explanto
(por donde se cortó inicialmente) y clavar
verticalmente la parte basal (inferior) en el medio de
cultivo.
*Colocar los explantos en una cámara de crecimiento en
oscuridad o a 25 ºC y 16 h de fotoperiodo.
112. El paso previo a la instalación in vitro
de un material vegetal es la asepsia
superficial. El protocolo de este
proceso dependerá de las
características del tejido empleado.
Para trabajar en condiciones
asépticas, es recomendable realizar
este proceso en una cámara de flujo
laminar y emplear material estéril. El
ambiente debe mantenerse limpio
con la superficie de trabajo
desinfectada con etanol al 70% antes
y después de usarla. Se debe usar bata
de laboratorio y lavarse bien las
manos.
113. Una cabina de flujo laminar, cámara de flujo laminar o
campana de flujo laminar es un recinto que emplea un
ventilador para forzar el paso de aire a través de un
filtro HEPA o ULPA y proporcionar aire limpio a la
zona de trabajo libre de partículas de hasta 0.1 micras.
Este tipo de equipos se fabrican en forma
generalmente prismática con una única cara libre (la
frontal) que da acceso al interior, donde se localiza la
superficie de trabajo, que normalmente permanece
limpia y estéril
114. *Dentro de estas cabinas o campanas se trabaja
con obleas de semiconductor, cultivos
celulares o cualquier otro sistema que deba
mantenerse limpio y deba evitarse la
contaminación con partículas minúsculas.
Estas cabinas están diseñadas para
proporcionar un aire limpio y constante a
una velocidad de paso de aire de 0.30 a 0.50
metros por segundo para así barrer la
superficie de la zona de trabajo y evitar la
suspensión de partículas así como una
posible contaminación de las muestras.
*El aire es inyectado a la zona de trabajo a
través de un filtro HEPA o ULPA e insuflado
en forma de un flujo laminar o flujo
unidireccional, muy suave, hacia el usuario.
La superficie de trabajo de la cabina se
construye generalmente de acero inoxidable
grado 304 o superior para facilitar su
limpieza y aumentar su durabilidad por el
uso, con acabados sanitarios, sin espacios o
juntas donde las esporas pueden llegar a
acumularse.
117. TÉCNICAS DE CULTIVO GENERAL
UNIDAD III
CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
DOCENTE: IRMA CASTILLO CARMONA
ELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA
MISANTLA VER, A 29DE MAYO DEL 2013
118. *La ciencia del cultivo de tejidos
vegetales debe su origen a la
investigación sobre hormonas
controlan el crecimiento y
desarrollo vegetal. Este
conocimiento se combinó con
las técnicas básicas de
microbiología por las cuales los
microorganismos se hacen
crecer en medios estériles para
la producción de
microorganismos e
identificación.
119.
120.
121. La estimulación de las yemas axilares o adventicias es el
proceso más común que se conoce para la micro
propagación de las plantas. Aquí, las citocininas causan
una generación continua de estas yemas en la base del
cultivo que prolifera. Cada yema desarrolla en un tallo
enanizado el cual a su vez puede producir más yemas en
su base. Esta proliferación de tallos y yemas continuará
siempre que sea mantenido un suministro adecuando de
citocinina junto con nutrientes y espacio físico por
subdivisión de los cultivos y transferencia de los mismos a
medio fresco cuando sea necesario.
122. *Técnica de propagación vegetativa
de plantas en condiciones in
vitro.
*Producción masiva a precios
competitivos.
*Cultivo aséptico de un explanto
en un medio de cultivo artificial y
en condiciones ambientales
controladas.
123.
124. Por brotación de yemas axilares.
Por brotación de yemas
adventicias:
•directa
•indirecta
125. *Elección y preparación de la planta madre (etapa 0).
*Establecimiento del cultivo y elección del medio de cultivo
(etapa 1).
*Multiplicación (etapa 2).
*Elongación y enraizamiento(etapa 3).
*Aclimatación (etapa 4).
126. Crecimiento en
condiciones de sanidad
controlada.
Tratamientos de
rejuvenecimiento.
Pre tratamientos con
reguladores de
crecimiento.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137. *Este método, teóricamente, es el más eficiente para la
producción masiva de plantas in vitro debido a la
naturaleza bipolar del embrión, la posibilidad de ser
automatizado todo el proceso productivo, los altos
coeficientes de multiplicación en cortos períodos de
tiempo, al poder aplicarse los principios de la cinética
microbiana y la posibilidad de encapsular estas
estructuras y obtener semillas artificiales
138. La embriogénesis somática es la formación de un
embrión a partir de una célula, sin la necesidad de la
fusión de gametos .Esto no es un fenómeno artificial y es
conocido en la naturaleza como una forma de apomixis
llamada embrionía adventicia, descrita por primera vez
por Strasburges en1878 aunque fueron Reinert (1958) y
Steward et al. (1958)quienes dieron crédito por primera
vez a la descripción de la embriogénesis somática en el
año 1958.
151. En las últimas décadas se han desarrollado diferentes
sistemas para los cultivos de protoplastos, células, tejidos
y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en
suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye
una forma para mantener y propagar células vegetales.
152. Las suspensiones celulares consisten en células libres y
agregados celulares distribuidos en un medio en
movimiento. Estas suspensiones pueden ser permanentes
mediante el suministro continuo de nutrimentos. Medios
de cultivo Para el cultivo de suspensiones celulares de
una gran variedad de plantas se ha utilizado el medio MS
desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el
cultivo de tejidos de tabaco, como también el medio B-5
de Gamborg et al. (1968).
153. Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante
la incubación de trozos de callos friables en medios líquidos
que, están en movimiento continuo. Comúnmente se
emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el
medio líquido con los trozos de callo dispersos en el, hasta
llenar aproximadamente 1/5 de la capacidad de tos frascos;
estos se ponen luego a incubar en un agitador giratorio a 80-
150 rpm, bajo luz continua y a 25 C de temperatura.
Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares
quedan establecidas después de varios días. Durante los
primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de
dilución baja (por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de
medio fresco por cada parte de suspensión celular.
Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más
alta, según el objetivo para el cual se haya establecido la
suspensión.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160. La propagación clonal o vegetativa de plantas es una
producción a partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidos
vegetales que conserven la potencialidad de multiplicación y
diferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces a
partir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos.
Este tipo de propagación tiene esencialmente tres
variantes, que son: 1) la micropropagación a partir de tejidos
vegetales en cultivo in vitro; 2) la propagación a partir de
bulbos, rizomas, estolones, tubérculos o segmentos (esquejes)
de las plantas que conserven la potencialidad de enraizar, y 3)
la propagación por injertos de segmentos de la planta sobre
tallos de plantas receptivas más resistentes.
161. La propagación clonal o vegetativa de plantas es una
producción a partir de partes vegetativas. Se utilizan tejidos
vegetales que conserven la potencialidad de multiplicación y
diferenciación celular para generar nuevos tallos y raíces a
partir de cúmulos celulares presentes en diversos órganos.
Este tipo de propagación tiene esencialmente tres variantes,
que son:
1) La micro-propagación a partir de tejidos vegetales en cultivo
in vitro;
2) La propagación a partir de bulbos, rizomas, estolones,
tubérculos o segmentos (esquejes) de las plantas que
conserven la potencialidad de enraizar, y
3) La propagación por injertos de segmentos de la planta sobre
tallos de plantas receptivas más resistentes.
164. *Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales
*Obtención de plantas libres de virus
*Mejoramiento genético
*Conservación del germoplasma
*Aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales en el país
ELABORO:ALEXANDER LOPEZ CARDEÑA
INGENIERIA BIOQUIMICA
165. Las primeras experiencias relacionadas con el
cultivo de tejidos vegetales se remontan a 1902,
pero recién en 1922 se logró el primer
experimento exitoso: la germinación in vitro de
semillas de orquídeas. Luego de la germinación,
las plántulas obtenidas se transfirieron a un
medio de cultivo en condiciones asépticas, y así
se mantuvieron protegidas del ataque de
patógenos (hongos, virus y bacterias).
Hoy esta técnica tiene numerosas aplicaciones,
algunas de ellas se ilustran en la
Figura 1:
166. Propagación masiva de plantas, especialmente para especies de
difícil propagación por otros métodos, o en vías de extinción.
Clonación de individuos de características agronómicas muy
deseables durante todo el año
Obtención de plantas libres de virus
Producción de semillas sintéticas
167. Obtención de metabolitos secundarios
Producción de nuevos híbridos
Mejora genética de plantas (incluyendo obtención de
plantas transgénicas)
Germinación de semillas.
Producción de haploides.
Estudios fisiológicos diversos.
168. Producción de material libre de virus endémicos de Ajo y
Papa para luego llevar la semilla libre de virus por el
programa de Hortalizas.
Producción de plantas madres de frutales de hoja caduca
para vivero.
Investigación y desarrollo de nuevos protocolos para la
introducción y cultivo in vitro de especies de interés
hortícola, frutícola, forestales y nativas.
169.
170. Cultivo de anteras en arroz y
rescate de embriones en trigo
para lograr un avance
generacional mediante la
producción de doble haploides
para los programas de
mejoramiento.
Inducción de variación
somaclonal en durazno para la
mejor tolerancia a bacteriosis.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
178.
179. Cultivo de anteras y mejoramiento de plantas
Eliminación de virus y propagación de clones
de yuca
Cultivos de tejidos de camote
Micropropagación de plátanos y bananas
Cultivos de tejidos de caña de azúcar
Cultivos de anteras en el arroz
Cultivos de tejidos en la caña de azúcar
Propagación in vitro de café
