1. Prácticas de Bioquímica Especial:
Introducción
Práctica 1
Práctica 2
Práctica 3
Práctica 4
Práctica 5
Práctica I
ACTIVIDAD LACTATO DESHIDROGENASA EN HIGADO DE RATA
Introducción Teórica: La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima NAD
dependiente que se encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales,
vegetales y en microorganismos.
Su peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un
tetrámero dispuesto tetraédricamente, en el que las subunidades van unidas
por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas.
Existen dos tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones
posibles dan lugar a cinco formas moleculares, con actividad lactato
deshidrogénica y con características cinéticas y fisicoquímicas diferentes, que se
han denominado isoenzimas.
Es una enzima citoplasmática que se encuentra en forma soluble o ligada a
membrana. Las diferentes isoenzimas se encuentran en distintas proporciones
en cada tejido, lo cual puede dar idea de la funcionalidad de cada isoenzima,
atendiendo a las funciones metabólicas en que intervienen;
Cataliza la siguiente reacción:
Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+
juega, por tanto, un papel importante en el metabolismo de glúcidos,
interviniendo en el último paso de la glucolisis anaerobia y en un primer paso
hacia la gluconeogénesis a partir de lactato. Además, aporta combustible al ciclo
de Krebs en tejidos consumidores de lactato como el músculo cardiaco. Es
específica para L-Lactato y utiliza únicamente NAD como coenzima.
2. Las diferentes isoenzimas presenta características cinéticas distintas, así la
isoenzima compuesta por 4 subunidades M (M4) tiene una Km relativamente
elevada para el piruvato, mientras que la isoenzima H4 tiene una Km
relativamente elevada para el piruvato. Parece ser que las isoenzimas híbridas
(M1H3, M2H2 y M3H1) presentan características intermedias a las de las
isoenzimas puras.
La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora, pero sí
regulada por la razón NADH / NAD+ y por la posibilidad de presentar formas
iscenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición
por sustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación
de un complejo NAD - piruvato que compite con el NADH por el centro activo
del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo
tricarboxílico: oxalacetato y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y
oxamato.
Objetivos experimentales:
A) Determinación de la actividad.
B) Determinación de las constantes cinéticas: Km y Vmax . Estimación de
la [S] óptima.
C) Determinación del tipo de inhibición. Estimar la Km (ap) y Vmax (ap)
en presencia de Oxamato.
D) Determinación de la Ki en presencia de oxamato.
Método:
La actividad se determinará espectrofotométricamente por la velocidad de
desaparición de NADH a 340 nm, pH 7,4 y 20 ªC (temperatura ambiente), en el
sentido de reducción del piruvato.
Como fuente de la enzima se utiliza hígado de rata homogenado en Sacarosa
0,25 M (1 g,1O ml), centrifugado a 30.000 por g (15.8OO RPM) durante 20 min
en una centrífugación Beckman refrigerada. El sobrenadante producto de la
centrifugación se utilizará diluido 1 / 50 en Sacarosa 0,25 M.
A) Determinación de la actividad. Preparar dos tubos conteniendo:
Blanco Prueba
3. Tampón Fosfato
pH 7,4 (ml)
2,8 2,6
NADH 3,5 mM
(ml)
0,1 0,1
Extracto (ml) 0,2
Se dispara la reacción con 0,1 ml de piruvato sódico (21 mM). Leer la
absorbancia ( DO ) a 340 nm cada 30 seg. durante 10 min. El ÆDO / min deberá
estar comprendido entre 0,05 y 0.1.
Resultados:
Representar DO frente a tiempo y calcular la Actividad Específica ( en mol /
min x g de tejido ).
Coeficiente de extinción del NADH = 6,22 10 3 cm-1 M -1.
A = c l
A = Absorbancia, medida espectrofotómetricamente.
= Coeficiente de extinción del NAD = 6,22 10 3 cm-1 M -1 = 6,22 cm-1 mM -1 .
c = Concentración
l = Longitud del paso óptico.
Desarrollo :
DEBIDO A LA COMPLEJIDAD DE PROGRAMAR LAS FORMULAS PARA
LOS NAVEGADORES LAS HE OBVIADO
50 = Factor de dilución
Milimolar = moles / ml
t / s D. O. D. O. -
Blanco
DO
0 0,835 -0,096 0,096
30 0,725 -0.246 0,246
60 0,610 -0,361 0,361
90 0,508 -0,463 0,463
5. A = 4, 47 mol/ min g
Valor referido a la actividad de la LDH
Valor control a:
pH: 7, 4
Temperatura: 37º
Práctica II
6. B)Determinación de las constantes cinéticas
Preparar diez tubos conteniendo:
Tubo Tampón
Fosfato
NADH
( 3.5
mM )
Piruvato
( 2.1 mM
)
Piruvato
( 21 mM
)
1
(blanco)
2,7 0,1
2 2,6 0,1 0,1
3 2,4 0,1 0,3
4 2,2 0,1 0,5
5 2.0 0,1 0,7
6 1,7 0,1 1,0
7 2,4 0,1 0,3
8 2,2 0,1 0,5
9 2,0 0,1 0,7
10 1,7 0,1 1,0
Una vez anadido el tampón, el NADH y el piruvato en todos los tubos, se
agitan y se lee la DO a 340 nm anotanto el valor que corresponderá a t=0.
Posteriormente se dispara la reacción con 0,2 ml de extracto, se agita y se lee
cada tubo a los 2 min de iniciada la reacción. Para los cálculos debe restarse el
ÆDO del tubo 1 (blanco) a todos los tubos.
Resultados:
Con los datos de los tubos 1-6:
- Representar V ( µM / min ) frente a [S] ( mM ): curva de Michaelis-Menten.
Con los datos de los tubos 1-10:
- Representar V frente a [S]. Estimar la [S] óptima.
- Representar 1 / V frente a 1/ [S]: representación de Lineweaver-Burk. Estimar
la Km y la Vmax.
Los tubos del 7 al 10 tienen exceso de piruvato, por tanto inhiben la enzima
LADH, es una de las formas de regulación. Inhibición por exceso de sustrato.
7. Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+
De la representación gráfica de esta ecuación se puede estimar la K m y vmax..
Con los datos de los tubos 1- 10 se representa v vs [S] y se estima la
concentración óptima de piruvato ( concentración a la que se alcanza la máxima
v ).
Inhibición competitiva:
Inhibición no competitiva:
Cálculos:
Se mide espectrofotométricamente la absorbancia de todos los tubos a t = 0 y a t
= 2 min de disparada la reacción.
Antes de disparar
8. D O0 - Blanco
Disparar con el sustrato
D O2 min- Blanco
V x C = V x C
3 ml x C = 0,1 ml x 2,1 m M
3 ml = 2,7 fosfato + 0,1 NADH + 0,2 ml estracto
C = 0, 07 m M
TUBO [S] 1 / [S] DO0 DO2
DO0 DO0 /
2
V 1 / V
2 0,07 14,29 0,174 0,175 0,001 0 0,06 16,7
3 0,21 4,76 -
0,058
-0,155 -0,097 -0,05 5,85 0,17
4 0,35 2,86 -
0,039
-0,16 -0,121 -0,06 7,29 0,14
5 0,49 2,04 -
0,043
-0,22 -0,177 -0,09 10,67 0,09
6 0,7 1,43 -
0,055
-0,235 -0,18 -0,09 10,85 0,09
7 2,1 0,48 -
0,012
-0,155 -0,143 -0,07 8,62 0,12
8 3,5 0,29 0,32 0,19 -0,13 -0,07 7,84 0,13
9 4,9 0,20 0,078 -0,055 -0,133 -0,07 8,02 0,12
10 7 0,14 0,367 0,262 -0,105 -0,05 6,33 0,16
C) Determinación del tipo de inhibición en presencia de Oxamato Preparar seis
tubos conteniendo:
Tubo Tampón
Fosfato
NADH
( 3.5
Piruvato
( 2.1
Oxamato
( 15 mM
9. mM ) mM ) )
1
(blanco)
2,6 0,1 0.1
2 2,5 0,1 0.1 0.1
3 2,3 0,1 0,3 0.1
4 2,1 0,1 0.5 0.1
5 1,9 0,1 0,7 0.1
6 1.6 0.1 1.0 0.1
Proceder de la misma manera que en el apartado B.
Resultados:
- Realizar la representación de Michaelis-Menten en la misma gráfica que la del
apartado B.
- Realizar la representación de Lineweaver-Burk en la misma grafica que la del
apartado B.
- Estimar la Km (ap) y a Vmax (ap) en presencia del inhibidor. Deducir el tipo
de inhibición (competitiva o no competitiva).
10. Para calcular la K m y Vmax utilizamos la representación de Lineweaver-Burk,
haciendo la regresión lineal, y despreciamos los puntos que se desvíen cuatro
veces el valor de la desviación típica muestral.
11. pte = 1 / vmax = 6,97 x 10-3
1
—— = 0,13
vmax
vmax = 7.69 mol / min ml
min ml
K m= 6,97x 10-3 x 7,69 = 0,053 mM
12. Estimación de la [ S ] óptima.
Según muestra la gráfica la concentración óptima de sustrato es la
correspondiente al tubo nº 5.
0,7 mM = [ S] óptima
D) Determinación de la Ki en presencia de Oxamato
Preparar once tubos conteniento:
Tubo Tampón
Fosfato
NADH
(3.5
mM)
Piruvato
(2.1
mM)
Oxamato
(1.5mM)
1(blanco
)
1.7 0,1 1,0
2 2.5 0,1 0.1 0,1
3 2,3 0,1 0.1 0,3
4 2,1 0,1 0,1 0,5
5 1,9 0.1 0.1 0,7
6 1,6 0,1 0.1 1,0
7 2,3 0,1 0.3 0,1
8 2,1 0.1 0.3 0,3
9 1,9 0,1 0,3 0,5
10 1,7 0,1 0.3 0,7
11 1,4 0,1 0,3 1,0
Proceder de la misma forma que en el apartado B.
Resultados:
- Representar 1/ V frente a [I] ( representación de Dixon ). Estimar la Ki (
extrapolando el punto de corte de las dos rectas en el eje de abcisas. Deducir el
tipo de inhibición.
13. Práctica III
ACTIVIDAD PIRUVATO CINASA EN HIGADO DE RATA
Introducción teórica: La piruvato cinasa ( PK ) pertenece al grupo de las
hidrolasas, ya que hidroliza el éster monofosfórico de fosfoenolpiruvato ( PEP ).
Cataliza el tercer paso irreversible de la glucolisis. En tejidos gluconeogénicos
como hígado y riñón, la PK muestra, en condiciones cercanas a las fisiológicas,
las siguientes propiedades alostéricas:
- cooperatividad en su cinética respecto a su sustrato ( PEP ). Cinética
sigmoidal.
- fuerte inhibición alostérica por Alanina y ATP
- fuerte activación por Fructosa 1-6 difosfato que transforrna la cinética
sigmoidal de la enzima en hiperbóIica,
Estas propiedades pueden alterarse con la temperatura.
La PK de rata presenta dos tipo bien definidos de isoenzimas: el tipo M
(predominante en nusculo) y el tipo L (predomiante en hígado y riñón). Un
tercer tipo, A, se ha descrito en tejido adiposo.
Podemos resumir las propiedades cinéticas de los dos tipos mas conocidos de
PK como sigue:
Tipo L Tipo M
Cinética para PEP Sigmoide Hiperbólica
Inhibición por ATP Alostérica No
alostérica
Inhibición por
Alanina
si no
Activación por
Fructosal-6
difosfato
si no
14. Objetivo experimental: estudio de la actividad de la PK de hígado de rata, sus
propiedades alostéricas y el efecto de dos moduladores: la Fructosa 1-6
difosfato y la Alanina.
Método:
Consiste en acoplar la reacción catalizada por la PK con la reacción de
reducción del Piruvato, a través de la actividad de la LDH, detectando
espectrofotométricamente la desaparición de NADH a 340 nm:
Fosfoenolpiruvato + ADP PK Piruvato + ATP
Piruvato + NADH + H+ LADH Lacatato + NAD+
Como fuente de la enzima se utiliza hígado de rata homogenado en Sacarosa
0,25 M (1 g /40 ml) centrifugado a 30.000 xg ( 15800 RPM ) en un centrífuga
Beckman refrigerada durante 20 min. El sobrenadante producto de la
centrifugación se utilizará diluido 1/6, en tampón imidazol, para todas las
determinaciones. Este proceso debe realizarse a temperatura ambiente. No
congelar ni guardar el sobrenadantede un dia para otro.
A) Actividad de la PK. Efecto de los moduladores Fructosa 1-6 difosfato y
Alanina.
Preparar 3 series de diez tubos, conteniendo la primera:
Tubo Coctel
Control
PEP
CB 2,6 0,1 (ml H2O )
C1 2,6 0,1 ( ml PEP 1 mM
)
C2 2,6 0,1 ( ml PEP 2 mM
)
C3 2,6 0,1 ( ml PEP 4 mM
)
C4 2,6 0,1 ( ml PEP 6 mM
)
C5 2,6 0,1 ( ml PEP 12
mM )
C6 2,6 0,1 ( ml PEP 18
mM )
15. C7 2,6 0,1 ( ml PEP 24
mM )
C8 2,6 0,1 ( ml PEP 30
mM )
La segunda serie ( FB - F8 ) se prepara igual que la anterior pero utilizando
Coctel Fructosa 1-6 difosfato. La tercera serie ( AB - AB ) se prepara igual pero
con Coctel Alanina.
Procedimiento:
1) Poner a incubar cada serie de tubos, la solución de ADP y la solución de
extrato a 37 ªC durante aproximadamente 5 min.
2) Añadir 0,2 ml de extrato a cada tubo. Mezclar y dejar en el bano durante 5
min más con objeto de que se consuma el ADP endógeno.
3) Leer la absorbancia ( DO ) de cada serie a 340 nm anotando el valor que
correspoderá a DO incial.
4) Disparar la reacción añadiendo 0,2 ml de ADP ( 1 mM ) a cada tubo de la
serie con un intervalo de separación de 30 seg entre tubo y tubo, anotando el
momento en el que se disparo el primer tubo.
5) Realizar la segunda lectura de absorbancia ( DO final ), exactamente a los 10
min de haber disparado la reacción en el primer tubo, respetando los intervalos
de 30 seg de un tubo a otro.
1Para los cálculos hay que restas a todos los tubos el valor de absorbancia ( DO
) del Blanco (CB o FB o AB, respetívamente ) ÆDO/10 mm = DO final - DO
inicial
Resultado:
- Representar, en la misma gráfica, V ( M / min ) frente a [S] ( mM ) de los tres
supuestos:
Control, en presencia de Fructosa 1-6 difosfato y en presencia de Alanina.
- Representar en gráficas individuales 1 / V frente a 1 / [S] con objeto de
estimar la Vmax de cada supuesto.
18. Cálculo de la vmax y K m a partir de la ecuación de Lineweaver - Burk
19. 1 K m 1 1
— = —— + —— + —
v vmax vmax [S]
FRUCTOSA
mol
vmax = 1 / 2,37 = 0,42 ———
min ml
K m
pte = —— = 1,75
vmax
K m = 0,735 mM
COCTEL CONTROL
mol
vmax = 1 / 1,946 = 0,51 ———
min ml
K m
20. pte = —— = 0,541
vmax
K m = 0,27 mM
ALANINA
mol
vmax = 1 / 3,39 = 0,29 ———
min ml
K m
pte = —— = 1,11
vmax
K m = 0,32 mM
Ponemos los tubos en el baño cinco minutos, medimos y disparamos. Después
los dejamos diez minutos en el baño
Reactivos:
Tampón Imidazol pH 7 (CI2Mg 5 mM, KCI 0,1 M; Imidazol 50 mM).
Coctel Control (Tampón imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 UI).
21. Coctel Fructosa 1-6 difosfato (Tampón Imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 UI,
Fruct 1-6 difosf 0,1 mM).
Coctel Alanina (Tampón Imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 Ul, Alanina 2 mM).
Práctica IV
ALGUNOS ASPECTOS DEL METAOBOLISMO EN RATAS AYUNADAS,
DIABETICAS
Introducción:
Una de las características fundamentales de los seres vivos es su capacidad de
adaptación al medio que les rodea. El mantenimiento de las funciones
especificas de las distintos órganos requiere un aparte energético continuo,
cuyas características vienen determinadas por el volumen y composición de le
ingesta y por la capacidad de almacenamiento y regulación de algunos tejidos.
El hígado juega un papel regulador esencial debido a la complejidad y
diversidad de su maquinaría metabólica. Es el órgano que recibe y procesa las
sustancias nutritivas procedentes de la ingesta y que, junto con el tejido
adiposo, es capaz de almacenar sustancias de reserva en forma de triglicéridos y
glucógeno. Por otro lado, el riñón se encarga de mantener la proporción de
agua y el balance ácido-base sanguíneo, así coma de la recuperación de
determinadas sustancias de desecho que son reutilizadas por otros tejidos y/o
por él mismo. La coordinación de las funciones de estas órganos se lleva a cabo
mediante finos sistemas de regulación horrnal. Todos estos mecanismos, en su
coniunto, permiten una adecuación del organismo a las distintas condiciones
metabólicas.
El obieto de esta segunda parte de las practicas es la determinación de algunos
parametros metabólicos característicos de cada una de las situaciones
anteriormente citadas. En este sentido, se deteminar:
1 ) Niveles plasmáticos do glucosa
22. 2 ) Niveles de glucógeno hepático.
3 ) Actividad de la fosfoenoipiruvato carbaxicinasa ( PEPCK ) hepática como
enzima clave de la vía gluconeogénica.
4 ) Capacidad gluconeogénica de la cortezta renal.
Tratamiento do los animales:
Se utilizarán ratas de la raza Wistar hembras ( 250 a 350 g ) que tienen en todo
momento libre acceso a la bebida. Estos animales se dividirán en cuatro grupos:
-CONTROLES: Disfrulan de libre cocesa a una dieta comercial estandar rica en
hidratos de carbono.
-AYUNADAS: 48 Horas antes del sacrificio se les retire el alimento.
-DIABETICAS: 3 ó 4 Días antes del sacrirícla se les inyecta, por vía
intraperitoneal, el antibiótico estreptozotccina a una dosis de 60 mg / Kg de
peso. Se les deja litare acceso al alimento, ( la estreptozotocina destruye
selectivamente las células del páncreas, encargadas de la producción de
insuilna ).
EXTRACCION DE SANGRE HIGADO Y RIÑONES.
1. Extracción de sangre.
Las ratas seran anestesiadas por los profesores con Nembutal sódico
administrado por vía lntraperitoneal a una dosis de 50 mg / kg de peso. Los
alumnos situarán la rata sobre la tabla de disección y la fijaran con esparadrapo
en la posición decúbito supino.
Con unas tijeras se retira la piel de la zona abdominal. A continuación se realiza
un corte a lo largo de la línea alba y se retira la capa muscular hacia los lados.
Separar la masa intestinal hada el lado derecho hasta dejar al descubierto la
vena cava y la arteria sorta. En este momento debe estar preparada una jerínga
de 5 ml ( sin aguja ) heparinízada.
Añadir 0,1 ml de heparina al 1% en solución salina en el lado izquierdo de la
cavidad abdominal.
Realizar con una lanceta estéril una incisión sobre la vena cava y la arteria aorta.
23. Recoger la sangre con la jeringa lentamente para evitar hemólisis, evitando
igualmente tomar restos de tejido y coágulos.
Pasar la sangre cuidadosamente a un tubo de centrífuga (rotulado) que contiene
0,1 ml de heparina al 1% en solución salina. Agitar suavemente según se va
añadiendo la sangre.
2. Extracción del hígado.
Con ayuda de unas pinzas y tijeras. extraer lo más rápidamente posible el
hígado completo y depositario en un vaso de precipitados ( rotulado ) que
contiene solución salina. Dejarlo en el barreño de híelo.
3. Extracción de los riñones.
Con ayuda de pinzas y tijeras, extraer lo más rápidamente posibie los dos
riñones y depositarIos en un vaso de precipilados ( rotulado ) que contiene
solución salina Continuar inmediatamente con el apartado 2.1.2.
4. Tratamiento de la sangre ( por el profesor ).
Centrifugar la sangre ( 1000 rpm / l0 min). Recoger el plasma con pipeta
Pasteur, realizar las diluciones indicadas en la practica 2.2 (para la
determinación de glucosa) y congelar todas estas alicuotas ( -20 ªC ).
5. Tratamiento del hígado ( por el profesor ).
-Distribuir el hígado en dos partes de 2,5 g cada una.
-Homogeneizar 2.5 g en 43 ml ( dil 1 / 5 ) de sacarosa 0,25 M ( vidrio - vidrio ).
Centrifugar a 47.800 g (20.000 rpm) / 30 min. Congelar ( -20 ºC ) el
sobrenadante en alícuotas de 0,5 ml para la realizadon de la práctca 2.3 ( PEPCK
).
-Homogenizar 2,5 g en 23 ml ( dil 1 / l0 ) de HCIO4 al 2% ( vinilo - vidrio ).
Guardar el homogenado en camara fría ( 4 ºC ) para permitir la extracción del
glucógeno ( práctica 2.2 ).
2.1.2. GLUCONEOGENESIS EN CORTES DE RIÑON.
24. La gluconeogénesis es sí proceso metabólico encargado de la síntesis de glucosa
y otras hexosas a partir de sustratos no glucídicos. Este proceso es
particularmente Importante en los mamíferos superiores en los que tanto la
glucogenolisis como la gluconeogénesis se inducen como mecanismos
reguladores de la glucemia durante los per lodos di IntermitencIa en la
Ingestión. La gluconeogénesis también es particularmente activa en el caso de
ejerddo muscular prolongado, cuando las reservas de glucógeno muscular han
sido agotadas y el lactato producido por la glucolisis anaerobia es transformado
por el hígado y riñón en glucosa para su reutilización.
No sólo el hígado es el responsable de la regulación de los niveles de glucosa en
sangre. El riñón. que en estados fisiológicos normales soporta un 10 % del
proceso gluconeog6níco total del animal en condiciones tales como acidosis
metabólica, ayuno o diabetes, aumenta su participación hasta cubrir caso un
50% de la síntesis total de glucosa.
Durante el ayuno. así corno por la ingestión de una dieta rica en proteínas y
pobre en glúcidos, se produce un mayor incremento de la capacidad
gluconeogénica renal que de la hepática, con lo que se consigue una mayor
rapidez en la excrección del amonio producido.
Los principales sustratos gluconeogénicos son el lactato, el gilcerol y los
aminoácidos. los cuales entran en la vía gluconeogénica en tres puntos:
piruvato. acetoglutarato y succinato.
Obietivo: Determinar la capacidad giuconeogénica de la corteza renal en
condiciones control, ayuno (de 48 h), diabetes ( por la administración de
estreptozotocina ).
Al poner un corte de riñón durante un cierto tiempo en un medio salino idóneo,
temperatura adecuada, suficiente oxigenación y los precursores
gluconeogónicos oportunos ( utilizaremos lactato y acetoglutarato ), el tejido
renal realiza su actividad gluconeogénica que se mide por la cantidad de
glucosa producida durante ese tiempo y cedida al medio.
Procedimiento:
-Limpiar uno de los riñones de toda materia grasa y depositarlo sobre un
soporte cubierto de papel de parafina y humedecido con NaCl al 0,9%.
-Sujetándolo con un portaobjetos se realizan tres cortes sagitales en la parte
exterior del riñón ( despreciando el primer corte y de forma que se obtenga
únicamente tejido de la corteza y no de médula ) de menos de 0.5 mm de grosor
mediante una cuchilla humedecida en solución salina.
25. -Depositar inmediatamente cada corte en un matraz de Erlenmeyer de 25 ml de
capacidad conteniendo 4 ml del medio de incubación correspondiente ( blanco,
lactato y -cetoglutarato.
BLANCO ( sin sustrato ): 4 ml de medio de incubación ( Krebs-Ringer-
Bicarbonato. M.l. )
LACTATO: 3.6 mide M.l. + 0.4 mide lactato 0.1 M.
- CETOGLUTARATO: 3,6 mide M.l. + 0,4 mide - cetoglutarato 0.1 M.
-Gasear con carbógeno ( 95% de O2 de C02 ) durante 30 segundos y tapar los
matraces inmediatamente con tapón de goma.
-Poner a Incubar a 39 ºC ( Tª fisiológica renal ) con agitación durante 60
minutos.
-Transcurridos los 60 minutos se retiran los matraces del baño.
-Recoger con pinzas los cortes y depositarios en la casilla correspondiente del
papel de aluminio suministrado por el profesor para su desecación en estufa a
70 ºC y posterior pesada.
-Cada medio de incubación se regoge en un tubo. se anota el volumen y se
añade
0.1 ml de HCIO4 del C0% por cada ml de medio de incubación. Este
tratamiento
tiene por objeto desnaturalizar y precipitar las proteínas del corte que hayan
quedado en solución y puedan interferir en la posterior determinación de la
glucosa.
-Añadir una gota de indicador universal y KOH al 20% gota a gota agitando
continuamente hasta alcanzar la neutralidad ( pH 7: color VERDE ). Anotar el
volumen final para calcular el factor de neutralización ( vol final / vol inicial).
-Guardar en carnare fría hasta el día siguiente, cuando se centrifugará a 1000
rpm / min antes de utilizar el sobrenadante para la determinación de glucosa.
Cálculos y resultados:
-Con la concentración de glucosa obtenida para medio de incubación
neutralizado ( se determinara en la práctica 2.2). Calcular los moles de glucosa
en el medio de incubación sin neutralizar (es decir multiplicando por FN y por 4
26. ml ). Referir esta cantidad a peso ( en g ) de tejido seco y al tiempo de
incubación ( es decir, expresar en mol de glucosa / h x g capacidad
gluconeogénica ). Tener en cuenta que para calcular la capacidad
gluconeogénica a partir de lactato o a partir de -cetoglutarato. hay que
restarle a estas la obtenida en los matraces blanco (Sin sustrato).
Reactivos ( 8 grupos de 4 alumnos )
-Lactato 0.1 M (112 mg + csp 10 ml agua).
- -Cetoglutarato 0.1 M ( 168.1 mg + csp 10 ml agua).
-Medio de Incubación Krebs - Ringer - Bicarbonato :
NaCI 1,43 g
KCI 46 mg
MgS04 29 mg
KH2PO4 11 mg
CaCl2 39 mg
NaHCO3 420 mg
+ csp 200 ml agua. Gasear con C02 10 min. Mantener en frío.
-Heparina al 1% ( 5 ml del 5% + 20 ml de sol. salina ).
-Pentobarbital sódico ( 125 mg en 5 ml de sol. salina: 0.5 ml / rata ).
-NH4CI 1,5% ( 7.5 g + 500 ml agua corriente ). Para bebida de las ratas 10 días
antes.
-Estreptozotocina ( 120 mg en 4.5 ml de sol. salina: 0,5 ml / rata ).
-Material necesario para para la disección y extracción de muestras (bisturí,
tijeras, pinzas, portaobjetos. tabla de disección, jeringa de 5 ml sin aguja, jeringa
de insulina, esparadrapo, tapón).
-Sacarosa 0,25 M, HCI04 60% y 2%. KOH 20%. NaCí 0.9%.
27. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION HEPATICA DE
GLUCOGENO
EN RATA. DETERMINACION DE GLUCOSA EN PLASMA.
El mantenimiento de los niveles plasmáticos de glucosa ( glucemia ) en los
organismos superiores es fundamental para el funcioramiento de todos los
órganos, al ser la glucosa su metabolito energético fundamental. Los procesos
metabólicos implicados en el cometido son dos: el metabolismo del glucógeno y
la gluconeogénesis.
La coordinación de estos mecanismos se lleva a cabo por la relación insulina /
glucagón.
En situaciones de escasez de glucosa se produce una disminución de la citada
relación, lo que provoca la estimulación de la glucogenolisis. así como de la
gluconeogénesis. mientras que después de la ingesta la relación hormonal se
invierte. estimulándose la glucogenosíntesis y la lipogénosis. El resultado final
es la amortiguación de las fluctuaciones de la glucemia.
El glucógeno es un polímero de glucosa. funcionando como reservorio de
energía en determinadas ocasiones. Existe en la mayoría de los tejidos. pero
principalmente en hígado y músculo. El tejido muscular degrada su glucógeno
en circunstancias de ayuno, estrés o ejercido para su utilización exclusiva,
debido a que carece de actividad glucosa - 6 - fosfatásica. Sin embargo, el
glucógeno hepático posee un papel esencial en el mantenimiento de la
glucemia. En situaciones de ayuno, las reservas glucídicas del hígado son
suficientes para mantener la concentración de glucosa en sangre durante las 12-
14 primeras horas.
El metabolismo del glucógeno es muy activo en animales de alimentación
intermitente. como el hombre y la rata. degradándose en los períodos de ayuno
y sintetizándose después de cada Ingesta.
Objetivo: En esta practica. el glucógeno se determinará midiendo la cantidad de
glucosa total hepática obtenida después de una hídrolisis con -
amilogiucosidasa. que degrada totalmente el glucógeno hasta convertirlo en
glucosa, y restando a esta medida el valor obtenido para la glucosa libre
hepática. Asimismo, se determinará la glucosa en plasma y en los medios de
incubación de gluconeogénesis renal.
- amiloglucosidasa
GLUCOGENO + H2O ( GLUCOSA ) n
28. pH 4,8
Método:
1. Obtención del hígado ( para realizar el día anterior ). Sacrificar una rata
adulta por dislocación cervical. Extraer el hígado completo y depositarlo en un
vaso que contenga NaCl al 0,9% en exceso y en baño de hielo. Pesar 5 g de
tejido e introducirlo en otro vaso que contenga 46 ml ( para que la dilución sea
de
1110 ) de HCIO4 al 2% también en hielo. Trozear finamente con unas tijeras y
homogenizar a mano con homogenizador vidrio-vidrio. Guardar el
homogenado en cámara fría (4 ºC ) durante 24 h con objeto de permitir la
extracción del glucógeno.
2. Hidrólisis del gIucógeno.
Encender la centrífuga a 20 ºC. Encender un baño de agua termostatizado a 40
ºC. Mezclar el homogenado e introducirlo en un tubo de centrífuga. Centrifugar
( rotor 20, 1000 rpm, 10 min ). Medir el Volumen de sobrenadante. Neutralizar
con KOH al 20% y al 2%. Medir Volumen final con objeto de conocer el factor
de neutralización ( FN ). Guardar unos 15 min en hielo. Centufugar nuevamente
( 1000 rpm ). De este sobrenadante. guardar unos 10 ml en la cámara fría para
determinar GLC LIBRE ).
Cada pareja: tomar 0,2 ml de sobrenadante y añadirle 3 ml de mezcla
enzimática - 1 ( M.E.-1, - amiloglucosidasa ), en un tubo de vidrio largo.
Dejar en baño termostatizado a 40 ºC, con agitación durante 1 hora. Detener la
reacción mediante la adición al tubo de 0.8 ml de HCIO4 al 2%. Extraer del
baño. Esta solución se empleará para la determinación de GLC TOTAL. (vol =
0,2 + 3 +0,8).
3. Determinación de glucosa.
Dilución de las muestras (a realizar por cada pareja en tubos cortos ):
Para Glc libre:
CONTROL AYUNADA DIABETICA
Dilución 1 / 20 1/ 10 1 / 10
Muestra ( ml
)
0,25 0,5 0,5
Agua 4,75 4,5 4,5
29. destilada
Para Glc total:
CONTROL AYUNADA DIABETICA
Dilución 1 / 10 1/ 5 1 / 5
Muestra ( ml
)
0,5 1,0 1,0
Agua
destilada
4,5 4,0 4,0
Para Plasma: (Estas diluciones las realizará el profesor )
CONTROL AYUNADA DIABETICA
Dilución 1 / 20 1 / 20 1 / 50
Muestra ( ml
)
0,1 0,1 0,05
Agua
destilada
1,9 1,9 2,45
Para Medio GNG:
CONTROL AYUNADA DIABETICA
Dilución SIN DILUIR SIN DILUIR SIN DILUIR
Fundamento del método:
Se realiza por un mátodo enzimático ("glucosa oxidasa-peroxidasa"), que
pesenta dos ventajas: especificidad y sensibilidad ( aunque un 36% de la
glucosa está en su forma -, la que reacciona es la forma -. que está en
equilibrio con la forma - "mutarrotación"- y, a medida que se consume la
forma - el equilibrio se desplaza hacia la forma -). La -D-glucosa. mediante
la glucosa oxidasa ( .D-glucosa-oxígeno oxidorreductasa. GOD ) y en
presencia de H2O y oxígeno molecular, se oxida dando ácido D-glucónico y
agua oxigenada :
GOD
.D.glucosa + H2O + O2 ácido - D -glucónico + H2O2
30. El peróxido de hidrógeno formado se descompone mediante la acción de la
peroxidasa ( POD ) y, el oxigeno liberado oxide a un agente cromógeno.
POD
H2O2 + DH2 ( Incoloro. leucobase ) 2 H2O + D (
coloreado, cromobase )
El contenido de D formado a partir de DH2 es una medida de la cantidad de
glucosa. siempre y cuando la cantidad de leucobase utilizada sea suficiente. El
espectro de absorción del compuesto D ( o-dianisidina, 3,3'-dimeloxibencidina )
llene un máximo de absorción a 440 nm. El coeficlente de extinción de esta
sustancia varía con las condiciones experimentales. por lo que las medidas han
de referirse siempre a las de un patrón de glucosa conocida.
Protocolo: Distribuir en tubos de vidrio largos lo que a continuación se indica (
tener en cuenta que las muestras deben estar ya diluidas convenientemente ):
TUBO Nº GLUCOSA
0,2
mM / ml
H2O Muestra
ml
1 ( blanco ) 1
2 ( 0.05 mol glu ) 0,25 0,75
3 ( 0.10 mol glu ) 0,5 0,5
4 ( 0.15 mol glu ) 0,75 0,25
5 ( 0.20 mol glu ) 1
6 ( GLC LIBRE ) 0,5 0,5
7 ( GLCTOTAL ) 0,5 0,5
8 ( GLC PLASMATICA ) 0,5 0,5
9 ( MEDIO GNG bl ) 1
10 ( MEDIO GNG Lac ) 1
11 ( MEDIO GNG -
KG )
1
Añadir e todos los tubos 5 ml de mezcla enzimática- II (M.E.- II ). Mezclar y leer
la absorbancia al cabo de les 60 minutos.
Cálculos:
31. Construir una curva patrón, representando absorbancia ( ordenadas ) frente a
mol de glucosa ( abcisas ). La relación debe ser lineal y pasar por el origen. La
absorbancla obtenda en las muestras se extrapola a la recta patrón y se deduce
así los mol de glucosa en la muestra utilizada. A partir de estos datos y,
teniendo en cuenta las diluciones, calcular:
a) Glucosa libre hepática en mol / de tejido.
b) Glucosa total hepática en mol / 1 g de tejido.
c) Glucógeno hepático en mol / g de tejido.
d) Glucemia (mM) ( mol / ml obtenido en gráfica ) x (1 / 0,5 ) x FD
e) [Glucosa en medio de incubación de GNG neutralizado ( mol / ml
obtenido en gráfica ).
Tener en cuenta:
Glc libre: ( mol / ml obtenido en gráfica ) x ( 1 / 0.5 ) FD ( FH ml / g) = mol /
g
Glc total: ( mol / ml obtenido en gráfica ) x ( 1 / 0,5 ) x ( 4 / 0,2 ) x FD x (FH ml
/ g ) = mol / g
Glucógeno = glc total - glc libre
TUBOSD.O. D.O. -
BLANCO
1 0,067 0
2 0,155 0,088
3 0,200 0,133
4 0,258 0,191
5 0,328 0,261
6 0,198 0,131
7 0,170 0,103
8 0,074 0,007
FD = Factor de dilución
32. FH = Factor de homogeneización, es común 25 ml / 2,5 g tej.
mol 4 ml 1 ml 25 ml mol
glc total = 0,37 ——— x ———— x ———— x 5 x ——— = 740 ———
ml 0,2 ml 0,5 ml 2, 5 g g tejido
mol 1 ml 25 ml mol
glc libre = 0,42 ——— x ———x 10 x ——— = 84 ———
ml 0,5 ml 2, 5 g g tejido
mol 1 ml mol
glucemia = 0,01 ——— x ——— x 50 = 1 ——— = 1 mM
ml 0,5 ml ml
Glucógeno = glc total - glc libre = 740 - 84 = 656 mol / g tejido
33. Reactivos :
- Mezcla enzimática - I : 170 mg de - amiloglucosidasa en 100 ml de tampón
acetato 0.1 M a pH 4,75 ( 0,82 g + cap 100 ml ).
- Mezcla enzimática - II :
Glucosa oxidasa 20,9 mg
Peroxídasa 14,3 mg
o-Dianisidina 5 ml ( 5 mg en 5 ml etanol 80 % )
Llevar todo a 1 L de tampón fosfato-NaH2 (78g )-tris (12.1 g ), pH 7,3.
-Solución patrón de glucosa 0,2 mM (18 mg + csp 500 ml agua ).
Práctica V
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA PEPCK EN HIGADO DE
RATA
EN DISTINTAS SITUACIONES METABOLICAS.
La enzima fosfoenolpíruvato carboxicinasa (PEPCK ) tiene una gran
importancia dentro del proceso de gluconeogénesis. La PEPCK cataliza in
"vivo" el paso de fosforilación y descarboxilación de oxalacelato (OAA ) a
fosfoenolpíruvato (PEP ).
GTP ( ITP ) GDP ( IDP )
OAA PEP
( Mn2+ ) CO2
34. La PEPCK tiene un peso molecular de unos 70 kda, aunque puede variar
dependiendo del origen. Contiene hierro en su molécuIa. Presenta un absoluto
requerimiento de metales divalentes ( Mg2+ , Mn2+ ) y puede funcionar con igual
actividad con GTP o ITP. Su mecanismo cinético es del tipo secuencial
ordenado.
Desde el punto de vista gluconeogénico es una enzima particularmente
importante en hígado y riñón. Su localización intracelular varía segun las
especies desde ser totalmente citoplasmática ( rata ) a ser tanto citoplasmática
como mitocondrial (humanos y cobayas ).
A nivel de metabolitos, se regula por la relación ATPIADP, que da lugar a
relaciones paralelas GTP / GDP e ITP / IDP. A nivel hornonal, la PEPCK está
regulada por el glucagon y las catecolaminas. que aumentan su actividad en
hígado pero no tenen efecto en la enzima renal. Los glucocorticoides estimulan
la síntesis de la enzima en ambos tejidos. La insulina inhibe la enzima hepática.
pero tiene que ir acompañada de un aumento de la concentración de glucosa.
Objetivo: Determinación de la actividad de la PEPCK en homogenado de
hígado de rata en distintas situaciones metabólicas ( ya obtenidos en la práctica
2.1.1 ). La actividad de la PEPCK es determina utilizando un sistema enzimático
acoplado con la enzima 1-malato deshidrogonasa (MDH):
PEPCK
PEP + IDP + HCO3- OAA + ITP
Mn2+
NADH ( H+ )
MDH
NADH
L - Malato
La mezcia de reacción, que se "dispara" con PEP. contiene IDP. HCO3- NADH y
MDH en exceso. de tal forma que la reacción tolal esta únicamente limitada por
35. la actividad de la PEPCK (presente en el extracto hepático ). La actividad se
determina en base a la velocidad de desaparición del NADH medida
espectrofotométricamente a 340 nm. La desaparición de cada molécula de
NADH corresponde a la transformación de una molécula de PEP a malato.
Protocolo:
TUBO MEZCLA DE
REACCION (
ml )
H2O
( ml )
EXTRACTO
HEPATICO (
ml )
BLANCO 3 0,2
CONTROL 3 0,2
AYUNADA 3 0,2
DIABETICA 3 0,2
-Leer y anotar la abeorbancia de las muestras (Abs Inicial ).
-Disparar la reacción ( en los tres tubos ) con 0.2 ml de PEP (16.5 mM) y poner
en marcha el cronómetro.
-Despu6s de disparar cada tubo, introducirlos en el baño a 37 ºC.
-Medir y anotar la absorbancia de cada tubo a los tiempos 2, 3, 4, 5 y 6 minutos (
midiendo altematívamente los tubos cada 30 segundos a partir del minuto 2 ).
Después de cada medida. devolver los tubos al baño.
Cálculos y Resultados :
Representar la absorbancia con respecto al tiempo
-Calcular la pendiente de la recta.
-Calcular la actividad en mol / min x g de tejido
mol / g = ( Abs / 6, 22 ) x ( 3, 4 / 0,2 ) x ( FH ml / g )
Muestra obtenida de una rata ayunada
36. La pendiente disminuye en el blanco porque el NADH se estropea a Tª
ambiente.
DO 0 DO 2 DO 3 DO 4 DO 5 DO 6
BLANCO 0,737 0,696 0,693 0,690 0,687 0,684
MUESTRA 1,209 0,953 0,924 0,896 0,880 0,865
Cálculos :
pte muestra = -2,2 x 10-2
pte blanco = -3 x 10-3
pte muestra - pte blanco = Abs / min = 0,02
A = ( Abs mol / 6, 22 min ml ) x ( 3 / 0,2 ) x ( 13 ml / 2,5 g tej ) = 0,24 mol
/min g
37. Reactivos :
-NaCl 0.9%; Sacarosa 0.25 M.
-PEP 16,5 mM (163 mg + csp 20 ml agua ).
-Tris - HCI 36 mM, pH 7,4 ( 436 mg tris + HCI hasta pH 7,4 + csp 100 ml agua).
-Mezcla de Reacción:
MnCl2 11,8 mg
NaHCO3 75 mg
Glutation Reducido 17 mg
IDP 27 mg
NADH 5 mg
MDH 20 l
+ csp 100 ml con el tanpón tris-HCI 36 mM, pH 7.4.
![Las diferentes isoenzimas presenta características cinéticas distintas, así la
isoenzima compuesta por 4 subunidades M (M4) tiene una Km relativamente
elevada para el piruvato, mientras que la isoenzima H4 tiene una Km
relativamente elevada para el piruvato. Parece ser que las isoenzimas híbridas
(M1H3, M2H2 y M3H1) presentan características intermedias a las de las
isoenzimas puras.
La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora, pero sí
regulada por la razón NADH / NAD+ y por la posibilidad de presentar formas
iscenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición
por sustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación
de un complejo NAD - piruvato que compite con el NADH por el centro activo
del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo
tricarboxílico: oxalacetato y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y
oxamato.
Objetivos experimentales:
A) Determinación de la actividad.
B) Determinación de las constantes cinéticas: Km y Vmax . Estimación de
la [S] óptima.
C) Determinación del tipo de inhibición. Estimar la Km (ap) y Vmax (ap)
en presencia de Oxamato.
D) Determinación de la Ki en presencia de oxamato.
Método:
La actividad se determinará espectrofotométricamente por la velocidad de
desaparición de NADH a 340 nm, pH 7,4 y 20 ªC (temperatura ambiente), en el
sentido de reducción del piruvato.
Como fuente de la enzima se utiliza hígado de rata homogenado en Sacarosa
0,25 M (1 g,1O ml), centrifugado a 30.000 por g (15.8OO RPM) durante 20 min
en una centrífugación Beckman refrigerada. El sobrenadante producto de la
centrifugación se utilizará diluido 1 / 50 en Sacarosa 0,25 M.
A) Determinación de la actividad. Preparar dos tubos conteniendo:
Blanco Prueba](data:image/gif;base64,R0lGODlhAQABAIAAAAAAAP///yH5BAEAAAAALAAAAAABAAEAAAIBRAA7)