O documento descreve os princípios e componentes da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Explica que a HPLC envolve a separação de componentes de uma amostra líquida através da interação diferencial desses componentes com fases móvel e estacionária. Detalha os principais componentes de um cromatógrafo HPLC, incluindo a bomba, injetor, coluna e detectores, e discute os tipos comuns de fases estacionárias e modos de separação.
2. O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação
na qual os componentes a serem separados
de uma mistura migram entre duas fases
sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes
da mistura definem o grau de afinidade entre
as duas fases, acontecendo o fenômeno de
migração diferencial .
3. O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a Líquido
HPLC?HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a
fase móvel é um líquido e a fase
estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na
fase líquida , sendo que os componentes da
amostras devem estar dissolvidos.
9. Componentes de umComponentes de um
Cromatógrafo a Líquido HPLCCromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes
principais :
Injetor :
É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ;
Coluna cromatografia :
É o dispositivo que tem a função de separar os
componentes da amostra ;
Detector :
É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas
10. Componentes auxiliares deComponentes auxiliares de
um HPLCum HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o
fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a
um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão.
11. BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)
12.
13. Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de um
HPLCHPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca rápida de
solvente desviando o fluxo de solvente para o
dreno.
Misturador:
É o dispositivo que homogeneíza a mistura de
solventes quando operando com gradiente de
eluição .
15. Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
Sílica- C8
Sílica- C18
Sílica- C18 ( ODS)
Sílica- NH2
Sílica- Diol
Sílica
Troca Iônica
Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
É o uma pequena coluna instalada a montante
da coluna analítica .
Tem como objetivo reter sólidos e em muitos
casos reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.
16. SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica
- Variedade de forma, tamanho de partículas e
poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou
básicas
- Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS
18. Fase EstacionáriaFase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada
é composta de partículas
microporosas de sílica.
São permeáveis ao solvente e
possuem uma área superficial de
varias centenas de metros por
gramas.
Não deve ser utilizada em
sistemas com pH acima de 8,0.
21. POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento
22. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quantidade de grupos de silanóis
- Ultra-fast cromatografia
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH
24. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos
funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos
filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
• Poli(etileno)
• Poli(butadieno)
• Poli(estireno)
• Poli(dimetilsiloxano)
• Poli(metiloctilsiloxano)
• Poli(metiloctadecilsiloxano)
• Poliéteres
• Polissacarídeos
• Poliaminas
• Polinucleotídeos
• Poliamidas
• Proteínas
Sílica
Zircônia
Titânia
Alumina
25. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
29. Processo de EluiçãoProcesso de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na
fase estacionária.
Série eluotrópica
Ordena os solventes de acordo com suas habilidades
relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.
30. Força eluente:
É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente
menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente
polar e um solvente polar.
31. DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade
eluída de um analito
33. É mais comum, usado na
CLAE.
Porque muitos solutos
absorvem a luz ultravioleta.
São bons para a eluição
por gradiente com
solventes não-absorventes.
DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:
34. Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela
amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):
Água
MeOH
ACN
Acetona
Hexano
Clorofórmio
THF
190
210
200
330
200
245
215
λ nmSolvente
35. Princípio: Emissão de energia fluorescente de um
soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para
que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de
dansila
Fluorescência:
38. Princípio: Mede a diferença no índice de refração da
fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:
- Temperatura
- Pressão
- Fluxo
- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:
39. Princípio: Determinação da massa de solutos através da
ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:
42. MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino
43. MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO
44. Tempo de Retenção e
Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS)
forte
Interação
fraca
45. HidrofobicidadeHidrofobicidade
Se a amostra possui
CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica
: grupo aromático
Se a amostra possui
-COOH : grupo carboxílico
-NH2 : grupo amino
-OH : grupo hidróxi
A
hidrofobicidade
será forte
A
hidrofobicidade
será fraca
46. TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico
48. SeqüênciaSeqüência
Lavagem da coluna -MeOH por
30 minutos
Condicionamento da coluna com
fase móvel
Monitoramento da linha de base
Injeção das amostras
50. Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SINAL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)
51. A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.
53. Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – to
k =
to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna
54. t
r o
o
k =
t t
Se:
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8
61. FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento
de He ou automático)
- Purgar os solventes
62. MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da
corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
GRADIENTE:
- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo
da corrida.
- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)
63. Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico
a
b
c
d
a
b
c
d
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
a
b
c
d
[ MeOH/THF/H2O ]
64. 1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO
- LÍQUIDO-SÓLIDO
- SOXHLET
- FLUÍDO SUPER CRÍTICO
- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
66. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado
de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma
solução padrão do
analito suspeito
68. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá
áreas diferentes, em função da resposta ao detector.
69. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa
substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x
concentração) da substância padrão:
70. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no
cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração
dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com
concentrações próximas da concentração esperada na
amostra. Outro fator muito importante é que o volume
injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume
injetado de amostra. Por esta razão este tipo de
padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas
para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume
injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para
corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância
71. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente
com um padrão de massa conhecida. Esta
mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos
no cromatograma, compara-se a área corrigida
de cada componente que se deseja determinar
com a área corrigida do padrão adicionado, do
qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x
72. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que
possível, entre compostos semelhantes aos que
existem na amostra, não devendo coincidir com
nenhum composto da mesma, e estar próximo ou
entre os picos da amostra. Deve ser também uma
substância pura para que apresente apenas um pico
no cromatograma, e para que esse pico possa ser
relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de
apenas um dos componentes de uma mistura, sem
haver necessidade de conhecer os outros
componentes.
76. ReferênciasReferências
TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;
VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin.
Determinação de corantes marcadores do tipo azo e
antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida
com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010,
vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.
AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A
BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE
LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia
Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme
Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5,
Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins
Ribeiro6