Slides Microbiologia

1. Pseudomonas
http://www.youtube.com/watch?v=ghwoPwJm-D8
Famiglia Pseudomonadaceae
Pseudomonad significa letteralmente Falsa unità,
pseudo (falso) monad (singola unità)
Biofilm piuttosto che forma planctonica

2. Pseudomonas
•Bastoncelli diritti o debolmente ricurvi
•Dimensioni 0,5-1,0 x 1,5-5,0µm
•Gram negativi
•Aerobi obbligati
•non fermentanti
•Mobili (uno o più flagelli polari)
•Asporigeni
•Ossidasi e Catalasi positivi
•Temperature tra 4 e 42°C
•Colonie morfologia simile a un uovo fritto (larga, liscia e
con il centro rialzato).

3. Pseudomonas
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4. Pseudomonas

5. Pseudomonas

6. Pseudomonas
Più di 140 specie, molte delle quali sono saprofitiche
Più di 25 specie possono causare infezioni opportunistiche
Tra queste vi sono P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida,
P. cepacia,
P. stutzeri, P. maltophilia e P. putrefaciens
Circa l’80% delle Pseudomonas isolate da campioni clinici:
aeruginosa e maltophilia

7. Pseudomonas
Microrganismi ubiquitari, si trovano:
• suolo
• materiale organico in decomposizione
• vegetazione
• acqua
• fiori recisi
• lavandini
• toilette
• strofinacci da pavimento
• attrezzature per dialisi
• respiratori di terapia intensiva
• soluzioni disinfettanti a base di ammonio
quaternario

8. Pseudomonas
Difficile da debellare Prevalentmente un opportunista
Semplici esigenze di crescita:
degrada un’ampia gamma di composti difficilmente
metabolizzabili da altri microrganismi.
Cresce in presenza di elevate concentrazioni di sale, blandi
detergenti, coloranti, e in presenza degli antibiotici più
comunemente utilizzati.
Temperatura ottimale tra i 20°e i 30°C, ma replica (più
lentamente) anche tra 0° e 4°C (partecipa alla degradazione dei cibi
conservati in frigorifero)
Resistente ai detergenti
Forma biofilm che aderiscono a diversi tipi di materiali

9. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
Componenti strutturali
Adesine
Capsula polisaccaridica
Enzimi
Elastasi
Fosfolipasi C
Piocianina
Tossine
Endotossina
Esotossina A
Esoenzima S
La virulenza di P.aeruginosa è multifattoriale

10. COMPONENTI STRUTTURALI
ADESINE
L’adesione è mediata da pili e da adesine non piliari
Quasi tutti i ceppi presentano un solo flagello polare che conferisce
motilità, ma permette anche l’adesione a recettori presenti sulla
membrana plasmatica delle cellule eucariotiche.
La diffusione del batterio è facilitata dalla presenza di
PILI in grado di ritrarsi permettendo a P. aeruginosa di muoversi
(twitching) su superfici semisolide o leggermente idratate.
P.aeruginosa produce neuramminidasi che rimuove i residui
di acido sialico dai recettori dei PILI di adesione aumentando
l’adesione alle cellule epiteliali

11. Pseudomonas aeruginosa
COMPONENTI STRUTTURALI
CAPSULA POLISACCARIDICA Costistuita prevalentemente di
ALGINATO, un esopolisaccaride mucoide costituito da polimeri
ripetuti di acido mannuronico e guluronico.
Favorisce l’adesività alla superficie di protesi vascolari e formare
BIOFILM
Viene persa durante la crescita in vitro
In pazienti con fibrosi cistica il batterio sovra-produce alginato
che lo protegge dalla fagocitosi e dall’azione degli antibiotici.

12. Pseudomonas aeruginosa
Pigmenti diffusibili:
– fluoresceina (gialla)
– piorubina (fenilazina marrone-ruggine)
– piomelanina (nero)
– piocianina (blu)
– pioverdina (verde-giallo fluorescente)

13. Pseudomonas aeruginosa
Le PIOVERDINE (più di 40 strutturalmente differenti) sono i siderofori più
utilizzati dagli Pseudomonas fluorescenti.
Sono pigmenti giallo-verdi, fluorescenti, chelano Fe+3, (cofattore per
l’attività catalitica di molti enzimi).
La pioverdina secreta da P. aeruginosa regola la produzione di almeno 3
fattori di virulenza: Esotossina A, una endoproteasi e la pioverdina
stessa.
PIOCIANINA: metabolita secondario di colore blu, formazione di pus blu.
PIOCIANINA
In latino aeruginosa: verderame infatti il batterio presenta un colore
verde-blu.
Con azione antibiotica, su S. aureus o E. coli (antagonismo microbico).
Essendo uno zwitterione, penetra facilmente attraverso la membrana
plasmatica nelle cellule eucariotiche, ed è in grado di interrompere la
respirazione cellulare.

14. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
http://www.youtube.com/watch?v=5yGbxyOpZRk
Esotossina A formata da due frammenti A (Active) e B (Binding)
uniti da ponte S-S. Il frammento B si lega al recettore CD91 della
cellula ospite e permette l’ngresso del frammento A nella cellula.
Quest’ultimo, essendo una ADP-ribosil-transferasi va a inibire il
fattore di elongazione EF-2 e quindi la sintesi proteica con
conseguente morte della cellula ospite con azione simile alla
tossina difterica
Responsabile:
• della necrosi tissutale nelle ustioni
• dell’insufficienza respiratoria nelle infezioni polmonari

15. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
Elastasi
Elastasi B una zinco-proteasi secreta nello spazio extracellulare
dove distrugge l’elastina e altre proteine della matrice polmonare.
Elastasi A una proteasi serinica con una potente attività anti-
stafilococcica (competizione microbica), ma meno attiva nel
degradare l’elastina. Entrambe le elastasi contribuiscono alla
distruzione del tessuto polmonare, causando emorragie polmonari
associate a infezioni da P. aeruginosa.

16. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
SS3T tipico dei batteri patogeni gram-negativi,
considerato il fattore di virulenza principale di P. aeruginosa. Attivato dal
contatto con le cellule eucariotiche e da condizioni ambientali, come la
concentrazione calcio.
Formato da 3 componenti: l'apparato di secrezione, l'apparato di
traslocazione e le tossine:
ExoS e ExoT: riarrangiano la struttura del citoscheletro e inibiscono la
fagocitosi
ExoU: ha un'attività fosfolipasica nel giro di 1-2 ore, distrugge la membrana
plasmatica della cellula ospite inducendo la necrosi
ExoY: porta ad un riarrangiamento del citoscheletro actinico
Inibizione della fagocitosi e un aumento della permeabilità endoteliale.

17. Pseudomonas aeruginosa
Quasi tutti i ceppi di Pseudomonas producono le tossine ExoT ed ExoY,
ma non tutti codificano per una ExoY funzionale a causa della presenza
di mutazioni frame-shift.
ExoS ed ExoU non sono prodotte quasi mai dallo stesso ceppo. Sulla
base delle diverse tossine prodotte, i ceppi di P. aeruginosa vengono
suddivisi in due gruppi: i produttori di ExoS/ExoT ed i produttori di ExoU/
ExoT.
sia ExoS che ExoT si associano, transitoriamente, a regioni di
membrana ricche in colesterolo.
Le conseguenze della distruzione del citoscheletro a opera delle due
tossine sono varie, tra cui la formazione di cellule arrotondate con una
•diminuita aderenza cellula-cellula (che facilita la penetrazione di P.
aeruginosa attraverso la barriera epiteliale),
•inibizione della fagocitosi,
•blocco della migrazione cellulare (associata al ritardo nella guarigione
delle ferite)
•infine la morte cellulare.

18. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
Sistema di secrezione di tipo III tipico dei batteri patogeni gram-
negativi,
considerato il fattore di virulenza principale di P. aeruginosa. È
attivato dal contatto con le cellule eucariotiche e da condizioni
ambientali, come la concentrazione calcio.
Formato da 3 componenti: l'apparato di secrezione, l'apparato di
traslocazione e le tossine:
ExoS e ExoT: riarrangiano la struttura del citoscheletro e
inibiscono la fagocitosi [
ExoU: ha un'attività fosfolipasica
ExoY: porta ad un riarrangiamento del citoscheletro actinico

19. Pseudomonas aeruginosa
può muoversi con 3 diversi meccanismi:
• Swimming: avviene in una fase liquida tramite un unico flagello
polare.
• Twitching: forma di traslocazione batterica indipendente dal flagello
che avviene su superficie umide. Tramite l'estensione e l'accorciamento
dei pili di tipo IV, le cellule della colonia batterica si espando
concentricamente con velocità di 1 mm/h.
• Swarming (sciame): tipico di un gruppo di pesci, uccelli, insetti o
microorganismi che si muovono insieme nella stessa direzione
P. aeruginosa utilizza questo tipo di movimento su superfici semi-solide
in risposta ad una carenza di azoto e in presenza di alcuni amminoacidi.
Diversamente dallo swimming Il batterio esprime due flagelli ai rispettivi
poli della cellula inoltre sono necessari anche i pili di tipo IV. La colonia
assume delle forme caratteristiche.

20. Twitching Swarming
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Per lo swimming che per il twitching è stata dimostrata una
risposta chemiotattica ad un ampio spettro di composti.
Gli attrattori o repulsori sono riconosciuti da 26 diversi recettori chemiotattici

21. BIOFILM
Fattore di virulenza molto importante, e contribuisce
significativamente alla resistenza a molte delle terapie antibiotiche.
I biofilm sono comunemente definiti come una comunità ben
strutturata di batteri e cellule eucariotiche, racchiuse in una
matrice polimerica prodotta dalle cellule stesse, che cresce su
una superficie (biologica o inerte), in particolare all'interfaccia con
una fase liquida.
Sebbene la maggior parte dei biofilm siano eterogenei (composti
da diverse specie), P. aeruginosa generalmente forma un biofilm
monospecie, in particolare questo avviene durante le infezioni
croniche nella fibrosi cistica

22. Pseudomonas aeruginosa
Il processo di formazione di un biofilm può essere
schematizzato in 6 fasi:
• Forma planctonica
• Attacco reversibile
• Attacco irreversibile
• Formazione delle microcolonie
• Maturazione
• Dispersione

23. QuickTimeª e un
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24. BIOFILM
In laboratorio P. aeruginosa può formare due tipi di biofilm:
biofilm piatto e biofilm strutturato
In entrambi i casi i batteri, inizialmente, aderiscono reversibilmente
a una superficie, ma solo dopo che l’adesione diviene irreversibile
inizia la colonizzazione e la formazione del biofilm.
Nel caso del biofilm strutturato si formano complesse strutture
tridimensionali dette stalks (steli) e towers (torri).
I ceppi che sovra-producono alginato formano un biofilm con
un’architettura altamente strutturata, e sono molto più resistenti alla
tobramicina

26. Pseudomonas aeruginosa
FATTORI DI VIRULENZA
Quorum-sensing
L’espressione, la produzione e la secrezione di molti di
questi fattori di virulenza (codificati da circa 350 geni, cioè
circa il 6% del genoma di P. aeruginosa) è regolata da un
processo di comunicazione e densità cellulare,
denominato (QS). La comunicazione cellula-cellula avviene attraverso le
molecole segnale omoserina lattone che sono secrete, accumulate
nell’ambiente extracellulare e nel momento in cui raggiungono una
concentrazione elevata (che naturalmente, aumenta al’aumentare delle cellule
batteriche) sono adsorbite dai batteri nei quali regolano la trascrizione di diversi
geni i cui prodotti sono fattori di virulenza.

27. Pseudomonas aeruginosa
Crescere fino a 42°C
Aerobio obbligato,
alcuni ceppi crescono in anaerobiosi grazie alla denitrificazione.
P. aeruginosa può colonizzare qualsiasi tipo di tessuto dando
origine a infezioni opportunistiche (endocarditi, polmoniti,
infezioni delle vie urinarie, della pelle ecc.) che nel 50% dei casi
portano a morte.
L’80% dei pazienti con fibrosi cistica muore a causa di infezioni
polmonari, acute o croniche, provocate da P. aeruginosa, che
causa la distruzione del tessuto polmonare.
La diffusione avviene attraverso il contatto con aerosol o per
ingestione di cibo o acqua contaminati.

28. FIBROSI CISTICA
• Malattia genetica autosomica recessiva
• Perdita della regolazione trans-membranaria dei canali del
Ca++ sulla membrana apicale delle cellule epiteliali e
conseguente elevato contenuto salino nei fluidi di
superficie
• Il sale inibisce l’attività di AMP e di proteine coinvolte nel
meccanismo dell’immunità

29. MANIFESTAZIONI CLINICHE
E’ fondamentalmente patogeno nosocomiale, sostenendo
il 20-40% di tutte le infezioni contratte in tale sede,
mentre è responsabile solo del 3-6% delle infezioni
comunitarie.
infezioni polmonari
frequenti in soggetti compromessi e con alterazioni
anatomo-funzionali dei polmoni
sovrainfezioni in pazienti affetti da:
bronchiti acute
fibrosi cistica (la produzione di muco vischioso
facilita le infezioni ad opera di ceppi che
sintetizzano un glicocalice di arginato).

30. MANIFESTAZIONI CLINICHE
complicanza di ustioni
P. aeruginosa può contaminare le superfici
esposte con conseguente disseminazione
sistemica per via ematica
infezioni
ferite chirurgiche o ulcere da decubito
otiti esterne e otiti medie
fattore predisponente per l'otite esterna è la
presenza di acqua nel canale auricolare, pertanto
tale affezione è chiamata "otite del nuotatore"
setticemia
dovuta sovente a cateterizzazione, temibile in
pazienti immunodepressi, oncologici, chirurgici e
nei neonati prematuri

31. MANIFESTAZIONI CLINICHE
endocarditi
nei tossicodipendenti o a seguito di manovre chirurgiche
infezioni del SNC
(meningiti e ascessi cerebrali) per introduzione del
microrganismo in seguito a puntura lombare o operazioni
neurochirurgiche
infezioni oculari
caratteristica è" l'ulcera corneale" causata da eventi
abrasivi o interventi chirurgici
infezioni urinarie
in seguito a misure strumentali eseguite a scopo

32. TERAPIA
Diffusissimi i ceppi multiresistenti per la presenza di
plasmidi codificanti i caratteri di resistenza verso i farmaci.
La terapia è in continua evoluzione.
Infezioni comunitarie
fluorochinoloni
cefalosporine di terza generazione (ceftazidime,ceftriaxone
etc.)
infezioni nosocomiali
aztreonam o penicillina anti-Pseudomonas+
aminoglicoside (effetto battericida sinergico)
carbapenemici (imipenem, meropenem)
N.B. La scarsa sensibilità̀ di P. aeruginosa ai più̀ comuni
antibiotici fa sì che il suo sviluppo venga favorito da
qualsiasi trattamento antibatterico che riduca la
concorrenza della restante popolazione microbica

35. Pseudomonas aeruginosa
DIAGNOSI DI LABORATORIO
P. aeruginosa cresce nei comuni terreni di coltura formando
colonie grandi, sfrangiate, emananti un tipico odore di frutta
Utile l’utilizzo di terreni selettivi a base di cetrimide (lo
Pseudomonas cresce in presenza del disinfettante).

36. Pseudomonas

37. Gram negative
Grows in minimal nutrient media
Glowing blue-green colonies under UV