Caracterización de polifenoloxidasa extraída de perafds

1. Caracterizaciónde PolifenoloxidasaExtraídade Pera(cv.Packam´s Triumph) yManzana (cv. Red
Delicious)
Characterizationof PolyphenyloxidaseExtractedfromPears(cv.Packam´sTriumph) andApples(cv
. RedDelicious)
EstelaGasull y DanielaBecerra
Cátedrade FisicoquímicaAplicada(Ing.enAlimentos),Áreade QuímicaFísica,Facultadde
Química,Bioquímicay Farmacia,
UniversidadNacional de SanLuis,Ejércitode losAndes950 2° Piso,5700 San Luis-Argentina(e-
mail:esgasu@unsl.edu.ar)
Resumen
Se estudiaronlascaracterísticasde polifenoloxidasa(PFO) extraídade perasPackam´sTriumphy
manzanasRedDelicious.El pHóptimoy latemperaturaóptimafueron6,5 y 25°C para pera,7 y
30°C para manzana,utilizando50mM de catecol en bufferfosfato comosustrato.Losvalores
obtenidosparaKMfueron13,24 mM (pera) y232,80 mM (manzana),mientrasque losvalores
obtenidosparaVmax fueron1590 U/mL E (pera) y 5464 U/mL E (manzana),utilizando50 mMde
catecol como sustrato.En este estudiose probarontresinhibidoresdel PFO,resultandoserel más
efectivoel ácidoascórbico.Estudioscinéticosdemostraronque lainactivacióntérmicade PFO
nactivacióntérmicade PFO(pera) fueron15309 J/Mol y -102 J/KMol
-196 J/K Mol.
Palabrasclave:polifenoloxidasa,cinéticaenzimática,pera,manzana,inactivacióntérmica
Abstract
A studywasmade of the propertiesof polyphenyloxidase (PPO) extractedfromPackam´sTriumph
pearsand RedDeliciousapples.OptimumpHandtemperature were 6.5and 25°C for pears,pH 7

2. and 30°C forapples,with50 mM catechol inphosphate bufferassubstrate.KMvalueswere 13.24
mM forpearsand 232.80 mM for apples,whereasVmax valueswere 1590 U/mL E forpears,and
5464 U/mL E forapples,using50 mM catechol as a substrate.Three PPOinhibitorswere testedin
thisstudywiththe most effective inhibitor beingascorbicacid.Kineticstudiesshowedthatthe
thermal inactivationof PPOfollowedfirst-orderkinetics.The activationenthalpy(H #) and
activationentropy(S #) forPPOheatinactivationinpearswas15309 J/Mol and -102 J/KMol
respectively.In applesthe H# was 11582 while the S# was-196 J/K Mol.
Keywords:polyphenyloxidase,enzymatickinetics,pears,apples,thermal inactivation
INTRODUCCIÓN
Las polifenoloxidasas(PFO)que se encuentranenlasplantassonlasresponsablesde las
reaccionesde pardeamientoenzimático que ocurrendurante el almacenamiento,manipulacióny
procesamientode frutasyvegetales.Laspolifenoloxidasas,tambiénconocidascomotirosinasas,
fenoloxidasasas,monofenoloxidasasocresolasas,catalizanlahidroxilaciónde monofenolesa
ortodifenoles,posteriormenteoxidadosaortoquinonas,lascualesse polimerizan dandolugara
pigmentosque presentancolormarrón,rojoo negro,dependiendode loscomponentesnaturales
presentesenlostejidosvegetales.Estasreaccionesmodificanlascaracterísticas organolépticasy
nutricionales del alimento,depreciandosucalidad. (McEvilyetal.,1992; Friedman,1996; Matheis
& Whitaker,1984; Sanchez-Ferreretal.,1995). Ocasionalmente,este cambiode coloresdeseado.
La actividadde lasenzimaspolifenoloxidasaspresentesenfrutasyvegetales puede serinhibida
por calentamientooporremociónde algunode sus componentesnecesarios:O2,enzima,Cu2+o
sustrato(Guerrero-Beltránetal.,2005). Agentesreductores,antioxidantese inhibidores
enzimáticosprevienenel pardeamientoreduciendoquímicamentelasortoquinonasadifenoles
coloreados,inhibiendolaactividadde laenzimapordisminucióndel pH,oquelandoel Cu2+en el
alimento.
En este trabajo,se aislóy caracterizóla polifenoloxidasade pera(cv Packam´sTriumph) y de
manzana(cv. RedDelicious),cosechadasenArgentina,entérminosde activaciónyestabilidad
térmica,pH óptimoyestabilidad,inhibidoresyparámetroscinéticosy termodinámicos, conel
objetivode ayudarapredecirel comportamientode laenzimapresente enlasmencionadas
variedades.

3. MATERIALES Y MÉTODOS
Preparacióndel extractoenzimático
Las frutas fueronadquiridasenmercadoscomunitariosyconservadasa4°C por 24 horas. La
extracciónde laenzimapara peray manzana se llevóacabo siguiendoel procedimientode
GauillardyRichard-Forget (1997) con algunasmodificaciones. Se homogeneizarona4°C, 100
gramos de la frutapor 5 minutosenbufferfosfato50mM, pH=6,5 conteniendoácidoascórbico20
mM, etilenglicol 2% y Tritón X-100, 1%. La mezclafue agitadaa 4°C durante 12 horas. La
suspensión fue centrifugadaa4000 rpm durante 15 minutos.Luegode separarel sólido, el
líquidocolectado se centrifugónuevamente (15minutos, 14000 rpm) enuna centrífuga
refrigeradaBeckmanJ2-HS y el sobrenadante recolectadoconstituyóel extractode laenzima
utilizadopararealizarlosensayos.
Actividadde polifenoloxidasa
La actividadde PFOfue determinadaaplicando el métodopropuestoporEspinetal.,(1995)
utilizandounespectrofotómetroShimadzuUV 160-A,de doble haz,concontrol de temperatura,
equipadoconceldasde cuarzode 1 cm de caminoóptico.Se determinóexperimentalmente la
longitudde ondacorrespondiente alamáximaabsorciónparaambospigmentos,formadosporla
oxidaciónde catecol por PFOde peray manzana.Estos valoresestánde acuerdocon el rangode
máximaabsorción(390-480 nm) para quinonasreportadoporStauffer(1989).
De estamanera,se determinólaactividadde laenzima midiendoel aumentode absorbanciaa
420 nm(pera) y a 400 nm(manzana).La velocidadinicial fue calculadaapartir de la pendiente de
la curva absorbanciaversustiempo. Se definióunaunidadde actividadde PFOcomoel aumento
de 0,001 unidadesde absorbanciaporminutoypor mL de enzima.Paralos distintosensayosse
utilizaron3mL de soluciónbufferalosque se adicionócatecol,de maneratal que la
concentracióndel mismoenlamezclafue 50 mM, y 200 mL (pera) ó 25 mL (manzana) del
extractode la enzima.Se realizaronmedidasde absorbanciaalarespectivalongitudde ondade
máximaabsorbancia,cada10 segundos,durante 10 minutos,a25°C.
EstabilidadypH óptimo

4. Se determinóenprimerlugarel pHóptimopara la polifenoloxidasade perayde manzana
analizadas enel rango de pH 4-5,5 en50 mM de bufferacetato,6,5-7,5 en 50 mMde buffer
fosfatoy7,5-9,5 en 50 mMde Tris-HCl.El sustratofue 50 mM de catecol,y se utilizaron200 mL
(pera) y25 mL (manzana).Latemperaturade trabajofue 25°C.
Para determinarel pHde estabilidadde laenzima,se incubóel extractocrudo de la mismaen3
mL de soluciónbuffer(pHentre 4 y 9,5) durante 24 horasa 4°C. La actividadresidual de laPFOfue
determinadacomoporcentaje respectode laactividadal pHóptimo,utilizando50 mMde catecol
como sustrato.
Actividadyestabilidadtérmica
La actividadde PFOde pera y manzanafue obtenidaadistintastemperaturascomprendidasentre
14 y 48°C al pH óptimode cada una de ellas.Lamezclade bufferysustratofue incubadapor 15
minutoshastalograr latemperaturadeseada.Laactividadde PFOa la temperaturaespecíficafue
determinadaespectrofotométricamente poradicióndel extractode laenzimaalamezclatan
rápidamente comofue posible.
A losefectosde determinarlaestabilidadtérmicade PFO,se incubóalastemperaturas30, 40, 50,
60 y 70°C la soluciónde laenzimaen50 mMde bufferfosfatoal pH óptimode lasenzimas
analizadasdurante 5,10, 20 y 30 minutos.Luegolamezclafue enfriadaenbañode hielo,yuna
vezalcanzadala temperaturaambiente,se agregóel sustratoyfinalmentese determinóla
actividadleyendoabsorbanciaa25°C.
Los datosobtenidosapartir de losperfilesde actividadtérmicase utilizaronparaanalizar
parámetrostermodinámicosrelacionadosconlasreaccionesde pardeamiento.Losdatospara la
inactivacióntérmicade laenzimafueroncalculadoscomparandoloscambiosenlaactividadluego
del calentamientoalasdistintastemperaturasrespectode laenzimasincalentar.
Cinéticaenzimática

5. Los datoscinéticosfueronrepresentadoscomolainversade laactividadversuslainversade la
concentracióndel sustrato,de acuerdoal métodode LineweaveryBurk(LineweaveryBurk,
1934). Utilizandocatecol comosustrato,trabajandoa la temperaturade 25°C, y al pH óptimode
cada enzima,se determinaronlosparámetroscinéticos:laconstante de Michaelis-Menten(KM) y
la velocidadmáxima(Vmáx), variandolasconcentracionesdelmismoenlamezclade lareacción
entre 10-90 mM para peray 21-350 mM para manzana.
Efectode los inhibidores
Se analizóel efectoinhibitoriode ácidoascórbico(0,03-0,17 mM para pera y 0,03-0,31 mM
para manzana),ácidobenzoico(0,21-0,82 mM para peray 0.20-0.80 mM para manzana) y cloruro
de sodio(0,32-10,00 mMpara pera y 0,32-2,20 mMpara manzana) sobre la actividadde PFOde
peray manzana,frente a catecol como sustrato.Para tal fin,se realizaronexperienciasutilizando
3mL de buffer pH óptimo,el extractoenzimático(200mL - 25 mL) y catecol 50 mMcomo
sustrato,enpresencia de lasdistintas concentracionesde cadaunode losinhibidores,a25°C.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
EstabilidadypH óptimo
En la figura1 se muestrael perfil de pHversusactividad parael extractoenzimáticode las
muestrasanalizadas.Lascurvas obtenidasmuestran que laactividadde PFOde peraPackam´s
Triumphesmáximaa pH 6,5, mientrasque PFOde manzanaRedDelicious presentasumáxima
actividada pH 7. De acuerdocon losvaloresinformadosporlaliteratura,el rangode pH mas usual
para la actividadóptimade PFOde ambas frutas es entre 5 y 7 (Rochay Morais, 2001; Weemaes
et al.,1998). Se observatambiénque,apH muyalcalinos,mayoresque 8,5,la actividadde la
enzimapresente en ambasfrutasanalizadasesprácticamentenula.
En la figura2 se presentael perfil de actividadrespectodel pHde incubaciónde laenzima.Los
resultadosestánexpresadoscomoactividadresidualrespectode laactividadque poseelaenzima
al pH óptimo.Comose observaen la gráfica, el pH de máximaestabilidadde laenzimaes 6,5
para PFO de peray el intervalo6,5-7,5 para PFOde manzana.

6. Efectode la temperaturasobre laactividadde PFO
En la figura3 se muestrael comportamientoenzimáticorespectode latemperatura.Losdatosse
representancomoactividadresidual porcentual respectode laactividada la temperatura
óptimade laenzimapara ambosextractos.Comose puede apreciar,latemperaturaóptimapara
la actividadde PFOde peraes 25°C, mientrasque para manzana,la enzimamuestraunaactividad
máximaa 30°C, perola mismadesciendebruscamente alos35°C, y a los 40°C, permanece
prácticamente inactiva.Se hanreportado temperaturasóptimasde durazno(JenyKahler,1974),
uva (Cash,etal.,1976), ciruela(Siddiqetal.,1992) y níspero(Dinceret al., 2002) en20, 25, 37 y
35 °C respectivamente.
Fig.1: Actividadde PFOde peray manzanaen funcióndel pH.Condicionesdel ensayo:50mM de
catecol,25°C. Pera, Manzana
Fig.2: Incubaciónde PFOa distintospH.Condicionesdel ensayo:50 mM de catecol,25°C.
Pera Manzana
Se obtuvieronademáslosparámetrosde activaciónparapera:H#= 15309 J/Mol,S#= -102 J/KMol,
G#298= 45705 J/Mol,mientrasque paramanzana losvaloresobtenidosfueron:H#= 11582 J/Mol,
S#= -196 J/KMol, G#298= 69990 J/Mol.En general,se considera H#como una medidadel número
de enlacesnocovalentesdestruidosparaformarel estadode transiciónque conduce ala
inactivaciónde laenzima,y S# está relacionadoconel cambioque acompañala formación del
estadode transiciónentre laenzimanetayel desordendel solvente.
La figura4 presentalaactividadde PFOde pera como funciónde latemperaturade incubación,
para distintostiemposde calentamiento.Se observaque lainactivacióntérmicade laenzimasigue
una cinéticade primerorden.De la gráfica se desprende que incubandolaenzimadurante 30
minutosa 30°C, la mismapermanece inalterada,peroal calentar la enzimadurante 20 minutos

7. a 50°C, la actividadde lamismadisminuye un40%, y se encuentra prácticamente inactivada
calentandodurante 10 minutosa 70°C.
Fig.3: Temperaturaóptimade PFOde peray manzana.Condiciones del ensayo:50 mMde buffer
fosfato(pHóptimo),50 mMde catecol.
Pera Manzana
Fig.4: Incubaciónde PFOde pera.Condicionesdel ensayo:50mMde bufferfosfato pH6,5, 50
mM de catecol.T=30, 40, 50, 60 y 70°C.
En cuanto a la PFOde manzana,enla figura5 se observaque laenzimaesestable a30°C,
disminuye un40%calentandodurante 20 minutosa 50°C, pero,a diferenciade loocurridoconla
PFOde pera,la inactivaciónprácticamente total se produce calentando30 minutosa70°C.
CinéticaEnzimática
Los parámetroscinéticosobtenidosson:KM=13.27 mM y Vmáx=1590 U/mL E para peraPakam´s
Triumph;KM= 232.80 mM y Vmáx=5464 U/mL E para manzanaRed Delicious.Este últimodato
coincide conel valorKM= 230 mM, informadoporRocha yMorais (2001) para otra variedadde
manzana,utilizandocatecol comosustrato.
Fig.5: Incubaciónde PFOde manzana.Condicionesdel ensayo:50mM de bufferfosfatopH6,5, 50
mM de catecol.T=30, 40, 50, 60 y 70°C.

8. Los valoresdeterminadospara KM indicanque PFOde peratiene mayorafinidadporcatecol que
PFOde manzana.Además,si tenemosen cuentaque larelaciónVmáx/KMmide laeficienciade la
enzimafrente aundeterminadosustrato, losresultadosobtenidosnospermitenafirmarque, en
nuestrocaso,PFO de pera(Vmáx/KM=119,8) presentómayorcapacidadde pardeamientoque
PFOde manzana(Vmáx/KM=23,5).
Efectode los inhibidoressobre laactividadde PFO
El análisisde losdatosobtenidosal determinarel efectoinhibitorio,muestraque el inhibidormás
potente paraPFO de las frutasanalizadas es ácido ascórbico,que presenta unI50% de 0.319
mM para peray 0.500 mM para manzana,mientrasque ácidobenzoicoyClNanomostraron
efectoinhibitorioenel rangode concentracionesutilizadas.El ácidoascórbicoactúa más como un
antioxidanteque comouninhibidor enzimáticoporqueel mismoreduce laquinonaformada
inicialmente porlaenzimaal difenoloriginal,antesque se produzcanlasreaccionessecundarias,
lascualesdan lugara laformaciónde lospigmentos.El ácidoascórbicotambiénhasidoreportado
como causa irreversiblede inhibiciónenzimática(Golanetal.,1984).
CONCLUSIONES
Las modificacionesrealizadasalatécnicade extracciónutilizadaporGauillardyRichard-Forget
(1997), fundamentalmente el agregadode tritónX-100,permitieronobtenerunmejor
rendimiento enlaextracciónPFOde lasfrutasanalizadas.Losparámetroscinéticos obtenidos
demuestranque PFOde manzanapresentaunamenorcapacidadde pardeamientofrentea
catecol que PFOde pera,mientrasque losparámetrostermodinámicosparalasreaccionesde
pardeamientoresultaronserdel mismoorden. Estosdatos,al igual que losvaloresde pH óptimo
y estabilidad,comoasítambiénlosde estabilidadyactividadtérmica,contribuyenapredecirel
comportamientode laenzimapresente enambasfrutas.
AGRADECIMIENTOS
El presente trabajose realizóconlosaportesde laSecretaríade CienciayTécnicade la
Universidadnacional de SanLuis,SanLuis,RepúblicaArgentina.

9. REFERENCIAS
Cash,J.N.,W.A.SistrunkyC.A Stutte,Characteristicsof Concordgrape polyphenoloxidase involved
injuice colorloss,Journal of FoodScience,41, 1398-1402 (1976). [ Links]
Dincer,B.,A.Colak,N.Aydin,A.Kadioglu, S.Guner,Characterizationof polyphenoloxidase from
medlarfruits(MespilusgermanicaL.,Rosaceae), Food Chemistry,77,1-7 (2002). [ Links]
Espin,J.C.,M. Morales,R. Varon, J. Tudela,y F. García-Casanovas, A continuous
spectrophotometricmethodfordeterminingthe monophenolase anddiphenolase activitiesof
apple polyphenoloxidase,Analytical Biochemistry,43,2807-2812 (1995). [ Links]
Friedman,M.,FoodBrowningandits prevention:anoverview.Journal of Agriculture andFood
Chemistry,45,1091-1096 (1996). [ Links]
Gauillard,F.y F.Richard-Forget,Polyphenoloxidase fromWilliamsPear(Pyruscommunis L.,Cv
Williams):activation,purificationandsome properties,Journal of FoodScience,74,49-56 (1997).
[ Links]
Golan,A., A. GoldhirshyJ.R Whitaker, Effectof ascorbic acid, sodiumbisulfite and thiol
compoundsonmushroompolyphenoloxidase,Journalof Agricultural FoodChemistry,32,1003-
1009 (1984). [ Links]
Guerrero-Beltrán,J.A.,B.G.SwansonyG.V.Barbosa-Cánovas,Inhibition of polyphenoloxidasein
mangopuree with4-hexylresorsinol,cysteineandascorbicacid,LWT, 38, 625-639 (2005). [
Links]
Jen,J.J.,yK.R. Kahler, Characterizationof polyphenoloxidase inpeachesgrowninthe Southeast,
Hortscience,9,590-591 (1974). [ Links]
Lineweaver,H.y D. Burk,The determinationof enzyme dissociationconstant,Journal of American
Chemist´sSociety,56,658-661 (1934). [ Links]
Matheis,G., y J.R.Whitaker,Modificationof proteinsbypolyphenoloxidase andperoxidaseand
theirproducts,Journal of FoodBiochemistry,8,137-162 (1984). [ Links]
McEvily, A.,R. Iyengar,yS. Otwell,Inhibitionof EnzymaticBrowninginFoodsandBeverages.
Critical ReviewinFoodScience andNutrition,32(3),253-273 (1992). [ Links]
Rocha, A.M.C.N. y A.M.M.B.Morais, Characterizationof polyphenoloxidase(PPO) extracted
from“Jonagored” apple,FoodControl 12, 85-90 (2001). [ Links]
Sanchez-Ferrer,A.,J.N.Rodríguez-Lopez,F.García-CasanovasyF.García-Carmona, Tyrosinase:a
comprensive review of itsmechanism, Biochim. Biophys. Acta,1247, 1-11 (1995). [ Links]

10. Siddiq,M.,K.Sinhay J.N.Cash,Characterizationof polyphenol oxidasefromStanleyplums.Journal
of FoodScience, 57, 1177-1179 (1992). [ Links]
Stauffer,C.E. “Oxidoreductases” In:Enzyme assaysforFoodScientistsby R. Van Nostrand,pp
202-205 (Ed), NewYork:AVIbook,(1989). [ Links]
Weemaes,C.A.,L.R.Ludikhuyze,I.VandenBroeck,M.E. Hendrickx,yP.P.Tobback,Activity,
ElectrophoreticCharacteristics and Heat Inactivationof Polyphenoloxidase fromApples,
Avocados,Grapes,PearsandPlums,Lebensm-Wissu.-Technol,31,44-49 (1998). [ Links]