Lipase – katalysierte Veresterung von
Sonnenblumenöl - Fettsäure und Glycerin im
Blasensäulenreaktor
Veselina Uzunova
Bach...
Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die
angegebenen Quellen...
Danksagung
Die vorliegende Diplomarbeit entstand am Institut für Technische Biokatalyse der Technischen
Universität Hambur...
Inhaltsverzeichnis
Symbolverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnes
1. Einleitung.................................
3.2.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor.........................................................22
3.2.3. Säurezahlbesti...
Symbolverzeichnis
Abkürzungen: Bedeutung
3D dreidimensional
Abb. Abbildung
Acetyl-CoA Acetyl Coenzym A
Ala Alanin
ATP Aden...
Formelzeichen: Bedeutung
C Konzentration [mol/l]
Cth theoretische Konzentration [g/mol]
relativer Phasenanteil [-]
g Gravi...
Index Bedeutung
G Gasphase
F Fluoreszenz
K Katalysator
L Flüssigphase
P Partikel
R Reaktor
S Festphase
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1.1 Hydrolyse und Estersynthese mit Lipase[Schmid, R.D,1998]..............................[2]
A...
Abb. 3.3 Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen und
chiralen Thiolverbingungen [Baek, G., 1999...
AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o
C, Begasungsrate 1,20 l/min N2,
BC.....................................................
Abb. 4.17 Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe
von Novozym 435. Reaktionsbedingungen:...
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2.1 Enzymklassifizierungen nach dem Reaktionsprinzip [Lit.Voet et al.2002]..........[4]
Tabell...
1
Kapitel 1
1. Einleitung
1.1. Motivation
Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emu...
2
Die Lipasen dienen zur Gewinnung von Spezialitäten aus Fetten und Ölen, und durch Variation
der Reaktionsbedingungen sin...
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1.2. Ziel der Bachelorarbeit
Ziel dieser Bachelorarbeit ist Bestimmung der Enzym - Stabilität und des Enzym - Verlustes ...
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Kapitel 2
2. Theoretische Grundlagen
Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emulga...
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Funktion und Effektivität von Stoffwechselreaktionen in nahezu allen Organismen hängen in
erster Linie von biologischen ...
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2.1.1. Wirkungsmechanismus von Enzymen
Das katalytische Zentrum besitzt eine spezifische Konformation und befindet sich ...
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2.1.2. Lipasen (EC 3.1.1.3)
Lipasen (EC 3.1.1.3)1
, auch Triacylglycerinester-Hydrolasen, gehören zur Familie der Serin-...
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Abb.2.3. (A) 3D-Struktur der CALB mit Van-der-Waals-Oberfläche, Vergrößerung des aktiven
Zentrums mit Butylpropionat und...
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2.1.3. Novozym 435
Viele Lipasen sind kommerziell zu niedrigen Preisen als unverarbeitetes, oft mit anderen
Proteinen ve...
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Abb. 2.5: Grenzflächenaktivierung - Lipaseaktivität in Abhängigkeit der Substratkonzentration;
cmc = kritische Mizellbi...
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2.3. Glycerine
Abb. 2.6. Struktur von Glycerin.
Glycerin (von gr. glykerós = süß, nach IUPAC Glycerol, auch Glyzerin) i...
12
Weiter kann die Klassifikation von Reaktoren mit einer dispergierten Gasphase bezüglich der Art
des Energieeintragen er...
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Abb. 2.8: Schematische Darstellung der vier an der Umsetzung beteiligten Phasen: Novozym
435 (S), Fettsäure (L1), Glyce...
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Er variiert als Funktion des Volumenstroms der Gasphase und muss in die Überlegungen zum
Energieeintrag P mit einbezoge...
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Abb. 2.10: Strömungsbereiche in Blasensäulen [Ewert et al.,2009]
Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass die Blasengr...
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2.4.3. Rührkesselreaktor
Die Systemcharakterisierung und die Charakterisierung der Biokatalysator haben gezeigt, dass
s...
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Kapitel 3
3. Materialien und Methoden
In diesem Kapitel sollen die theoretischen Grundlagen zur Auswertung und Bewertun...
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 Nouracid®HE 456
Reaktivität: Das Sonnenblumenöl ist stabil unter Normalbedingungen.
Tabelle 3.2. Mehrfach ungesättigt...
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 Glycerine 4833 – Glycerine 1.262
Tabelle 3.4. Produktidentifikator - Glycerine4833 – Glycerine 1.262.[Oleon,2011]
Han...
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3.1.2. Geräte
Tabelle 3.2: Verwendete Materialien
Gerät Typ Hersteller
Analysenwaage BL210S, max 210g, d = 0,1mg Starto...
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Methoden
3.1.3. Rührkesselreaktor
Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Rührkesselreaktor aus Glas verwendet...
22
3.1.4. Veresterung im Blasensäulenreaktor
Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Blasensäurenreaktor aus Glas...
23
3.1.5. Säurezahlbestimmung durch Titration
Die Bestimmung der Fettsäure durch Titration mit einer ethanolischen Kalilau...
24
Mithilfe der Säurezahl wurde der Umsatz berechnet:
X = .100 = .100 = .100 = .100 (4)
mit:
X = Umsatz [%]
c = Konzentrat...
25
Ortho-Phthaldialdehyd (OPA) kondensiert mit Aminosäuren unter reduzierenden und alkalischen
Bedingungen zu fluoresziere...
26
Kapitel 4
Dieses Kapitel soll die in der Bachelorarbeit durchgeführten Experimente illustrieren.
4. Experimentelle Erge...
27
Verwendet wurde immobilisierte Lipase B von Candida antarctica als Novozym 435. Enzyme
besitzen ein Temperaturmaximum, ...
28
Innerhalb der ersten 24 Stunde konnten bei 60o
C etwa 40-42% Umsatz erzielt werden. Die
Säurezahl wurde 112 mg KOH/g Pr...
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4.2.1. Repetitive Batch
Die Reaktion wurde wiederholt, bis ausreichende Daten zum Kalkulieren der Enzym-Stabilität
und ...
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Abb. 4.7: Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin
mit Sonnenblumenöl mit Hilfe...
31
Abb. 4.9: Umsatzkurven der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von
Novozym 435. Reaktionsbedingungen:...
32
Bei Repetitive Batch 1-5 innerhalb vom ersten 1 Stunde konnten bei 60o
C etwa 42-50% Umsatz
erzielt werden. Die Säureza...
33
Die Halbwertszeit und die Wirtschaftlichkeitsberechnung:
Abb. 4.11: Die Aktivität des Novozym 435 pro Zeiteinheit. Reak...
34
 Die Halbwertszeit
Die Halbwertszeit ist die Zeit, in der die Aktivität halbiert definiert:
V1 = Vo. (6)
V2 = Vo. (7)
...
35
Tabelle 4.3: Die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor
V2 V3 V4 V5 V5 V7 V8 V9 V10 V11 V12
E...
36
4.2.2. Einfluss der Enzymmenge
Bei einer Reaktion ohne Massentransportlimitierungen sollte zwischen der Aktivität eines...
37
Abb. 4.13: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und
3% (w/wS) Novozym 435. Reakt...
38
4.2.3. Einfluss der Begasungsrate
Die Rektion wurde mit Stickstoffbegasung durchgeführt, damit keine Oxidation der Fett...
39
Abb. 4.15: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit
Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 43...
40
4.2.4. Einfluss der Tempetatur
Innerhalb dieses Abschnitts wurde die Reaktionsgeschwindigkeit der Veresterung von Glyce...
41
Abb. 4.18: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit
Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 43...
42
4.3. Vergleich des Rührkesselreaktor mit dem Blasensäulenreaktor
Beim Vergleich der Reaktionsverläufe des Rührkesselrea...
43
Abb. 4.20: Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im
Rührkesselreaktor und im Bl...
44
Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o
C und einer
Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im ...
45
Kapitel 5
5. Diskussion und Ausblick
Im Rahmen dieses Versuchs wurden der enzymatischen Veresterung von Glycerin und
Fe...
46
Kapitel 6
6. Zusammenfassung
Innerhalb der vorliegenden Bachelorarbeit wurde ein Prozess für die enzymatische Veresteru...
47
Enzymbeladung kommt. Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine
Enzymmenge von 3% (w/wS) Novozym...
48
Literaturverzeichnis
Baek, G., (1999): Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten
Lebensmitteln mitt...
49
Hills G. (2003): Industrial use of lipases to produce fatty acid esters. In: European Journal of
Lipid Science and Tech...
50
Sarda, L. (1957), G. Marchis-Mouren und P. Desnuelle. Sur les interactions de la lipase
pancreatique avec les triglycer...
51
Trodler P.(2008) Untersuchung von Lipasen - Elektrostatik, Selektivität und Einfluss von
Lösungsmitteln auf Struktur un...
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  1. 1. Lipase – katalysierte Veresterung von Sonnenblumenöl - Fettsäure und Glycerin im Blasensäulenreaktor Veselina Uzunova Bachelorarbeit Institut für Technische Biokatalyse August, 2011 Prüfer: Prof.Dr.rer.nat.Andreas Liese Betreuer: Dipl.-Ing.Britta Lämmerhirt
  2. 2. Erklärung Hiermit versichere ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet habe. Wörtlich oder dem Sinn nach aus anderen Werken entnommene Stellen sind unter Angabe der Quellen kenntlich gemacht. Hamburg, August 2011 Veselina Uzunova
  3. 3. Danksagung Die vorliegende Diplomarbeit entstand am Institut für Technische Biokatalyse der Technischen Universität Hamburg Harburg. An dieser Stelle möchte ich allen meinen herzlichen Dank aussprechen, die mich bei dieser Arbeit gefördert und unterstützt haben. Mein besonderer Dank gilt zunächst Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas Liese für die Überlassung des interessanten Themas meiner Bachelorarbeit sowie für seine menschliche, optimistische und fachliche Unterstützung während der gesamten Arbeit. Seine stete Bereitschaft zur Diskussion und seine Geduld haben zum Fortgang der Arbeit entscheidend beigetragen. Mein Dank gilt Lutz Hilterhaus und Britta Lämmerhirt für die hervorragende Betreuung, die Unterstützung und die Durchsicht dieser Arbeit. Ihre Hilfsbereitschaft sowie ihre praxisbezogenen Hinweise waren entscheidend für eine erfolgreiche Erarbeitung meiner Arbeit. Danke! Und nicht zuletzt gilt mein Dank von ganzen Herzen meiner Familie und meinen Freunden für die immerwährende Unterstützung.
  4. 4. Inhaltsverzeichnis Symbolverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnes 1. Einleitung............................................................................................................................1 1.1. Motivation................................................................................................................1 1.2. Ziel der Bachelorarbeit............................................................................................3 2. Theoretische Grundlagen..................................................................................................4 2.1. Biokatalyse...............................................................................................................4 2.1.1. Wirkungsmechanismus von Enzymen.........................................................6 2.1.2. Lipasen (EC 3.1.1.3)....................................................................................7 2.1.3. Novozym 435...............................................................................................9 2.1.4. Grenzflächenaktivierung von Lipasen.........................................................9 2.2. Fetten und Fettsäuren.............................................................................................10 2.3. Glycerine 4833 – Glycerine 1.262.........................................................................11 2.4. Reaktorkonzepte zur Veresterung..........................................................................11 2.4.1. Mehrphasige Reaktorkonzepte...................................................................11 2.4.2. Lösungsmittelfreier Betrieb.......................................................................12 2.4.3. Rührkesselreaktor......................................................................................16 2.4.4. Blasensäulenreaktor...................................................................................16 3. Materialien und Methoden..............................................................................................17 3.1. Materialien.............................................................................................................17 3.1.1. Chemikalien...............................................................................................17 3.1.2. Geräte.........................................................................................................20 3.2. Methoden...............................................................................................................21 3.2.1. Veresterung im Rührkesselreaktor.............................................................21
  5. 5. 3.2.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor.........................................................22 3.2.3. Säurezahlbestimmung durch Titration.......................................................23 3.2.4. Aminosäureanalyse…………………………............................................24 4. Experimentelle Ergebnisse und Diskussion...................................................................26 4.1. Veresterung im Rührkesselreaktor.........................................................................26 4.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor.....................................................................28 4.2.1. Repetiven Batches......................................................................................29 4.2.2. Einfluss der Enzymmenge.........................................................................36 4.2.3. Einfluss der Begasungsrate........................................................................38 4.2.4. Einfluss der Temperatur.............................................................................40 4.3. Vergleich des Rührkesselreaktor mit dem Blasensäulenreaktor............................42 5. Diskussion und Ausblick.................................................................................................45 6. Zusammenfassung...........................................................................................................46 Literaturverzeichnis....................................................................................................................48
  6. 6. Symbolverzeichnis Abkürzungen: Bedeutung 3D dreidimensional Abb. Abbildung Acetyl-CoA Acetyl Coenzym A Ala Alanin ATP Adenosin triphosphat AS Aminosäure Asp. Asparagin BA Biogene Amine BC Blasensäulenreaktor (Bubble column) CALB Candida antarctica Lipase B cmc Kritische Mizellbindungskonzentration EC Enzymklasse (enzyme class) His. Histidin IC Ionen-Chromatographie KBH4 Kaliumborhydrid LDH Lactatdehydrogenase Leu Leucin ME 2-Mercaptoethanol MPA 3-Mercaptopropionsäure OPA ortho-Phthaldialdehyd Ser. Serin STR Rährkesselreaktor (stirred tank reactor) Thr Threonin tRNA Transfer-RNA Val Valin
  7. 7. Formelzeichen: Bedeutung C Konzentration [mol/l] Cth theoretische Konzentration [g/mol] relativer Phasenanteil [-] g Gravitation [m/s2 ] KL Stoffübergangskoeffiziente [s-1 ] Kdeakt Deaktivierungsrate [1/h] L Länge des Reaktors [m] m Masse [g] mth theoretische Masse [g] M Molare Masse [g/mol] n Menge [mol] nth theoretische Menge [mol] P Energieeintrag Dichte [kg/m3 ] SZ Säurezahl [-] SZth theoretische Säurezahl [-] T Temperatur [ ] oder [K] t1/2 Halbwertszeit [h] to Zeit zu Beginn der Messung [h] t1 Zeit zu am Ende der Messung [h] V Volumen [ml] Volumenstrom [L.min-1 ] Vo Enzymaktivität zu Beginn der Messung [U] V1 Enzymaktivität am Ende der Messung [U] X Umsatz [-]
  8. 8. Index Bedeutung G Gasphase F Fluoreszenz K Katalysator L Flüssigphase P Partikel R Reaktor S Festphase
  9. 9. Abbildungsverzeichnis Abb. 1.1 Hydrolyse und Estersynthese mit Lipase[Schmid, R.D,1998]..............................[2] Abb. 2.1 Energiediagramm einer enzymkatalysierten (- - -) im Vergleich zu einer unkatalysierten (—) Reaktion [Karlson et.al,1994]...............................................[5] Abb. 2.2 Reaktionsschema der Lipase-katalysierten Reaktion: Hydrolyse und Synthese von Triglyceriden (R1 − R3 entsprechen den Fettsäureresten) [Biochemie,Nova Print AD, 2006]..............................................................................................................[7] Abb. 2.3 (A) 3D-Struktur der CALB mit Van-der-Waals-Oberfläche, Vergrößerung des aktiven Zentrums mit Butylpropionat und den Aminosauren der katalytischen Triade, erstellt mit Pymol (Version 0.98 Delano- Scientific); (B) Reaktionsschema der lipasenkatalysierten Hydrolyse [Buthe, A. (2006)].........................................[8] Abb. 2.4 Kristallstrukturanalyse von Lipase B aus Candida antarctica [Jena Bioscience, 2009]......................................................................................................................[9] Abb. 2.5 Grenzflächenaktivierung - Lipaseaktivität in Abhängigkeit der Substratkonzentration; cmc = kritische Mizellbildungskonzentration................[10] Abb. 2.6 Struktur von Glycerin..........................................................................................[11] Abb. 2.7 Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BS) und Rührkesselreaktor (STR)...................................................................................................................[12] Abb. 2.8 Schematische Darstellung der vier an der Umsetzung beteiligten Phasen: Novozym 435 (S), Fettsäure (L1), Glycerin (L2) und Gas (G) [Hilterhaus, L.,2008]...............................................................................................................[13] Abb. 2.9 Schematische Darstellung der möglichen Strömungsformen in Blasensäulen [Kantarci et al., 2005]..........................................................................................[14] Abb. 2.10 Strömungsbereiche in Blasensäulen [Ewert et al.,2009].....................................[15] Abb. 3.1 Schematische Darstellung von Rührkesselreaktor (STR):1-STR mit Rührer; 2- Thermostat; 3-Vakuumpumpe.............................................................................[21] Abb. 3.2 Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BC):1-BC; 2-Thermostat; 3- Sollwertgeber FWE.............................................................................................[22]
  10. 10. Abb. 3.3 Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen und chiralen Thiolverbingungen [Baek, G., 1999].....................................................[24] Abb. 4.1 Thermostatisierter Rührkesselreaktor (STR) mit Evaporation des Reaktionswassers, Auffangen des Wassers im Kondensatsammler und Druckmessung zur Veresterung von Glycerin mit Fettsäuren (Sonnenblumenöl) mit Hilfe von Novozym 435................................................................................[26] Abb. 4.2 Säurezahlkurve bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, 65 rpm..................................................................[27] Abb. 4.3 Umsatzkurven bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, 65 rpm..................................................................[27] Abb. 4.4 Thermostatisierter Blasensäulenreaktor (BS) ohne bewegliche Einbauten mit Gaseintrag durch Bodenplatte, Regelung des Gasstromes und Entfernung des Reaktionswassers mithilfe von Stickstoff zur Novozym 435 katalysierten Veresterung von Glyzerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl...........................[28] Abb. 4.5 Säurezahlkurven (RepBatch 1-5) und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC.................[29] Abb. 4.6 Säurezahlkurven (RepBatch 6-11) und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC.................[29] Abb. 4.7 Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC..................[30] Abb. 4.8 Umsatzkurven bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure
  11. 11. AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC........................................................................................................................[30] Abb. 4.9 Umsatzkurven der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC........................................................................................................................[31] Abb. 4.10 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.......................................................................[31] Abb. 4.11 Die Aktivität des Novozym 435 pro Zeiteinheit. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.......................................................................[33] Abb. 4.12 Umsatzkurve bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC...........................................[36] Abb. 4.13 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.............[37] Abb. 4.14 Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2, BC...........................................................................[38] Abb. 4.15 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2 , BC..................[39] Abb. 4.16 Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o C, 60o C und 65o C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC..............[40]
  12. 12. Abb. 4.17 Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o C, 60o C und 65o C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC.......................................................................[40] Abb. 4.18 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o C, 60o C und 65o C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC...................................[41] Abb. 4.19 Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Novozym 435, STR: 65rpm und Vakuum, BS: 1,20 l/min N2..............................................................[42] Abb. 4.20 Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 11g Glycerin, 105g Fettsäure AN456N, 60o C, 3% (w/ws) Novozym 435, STR 65rpm und Vakuum, BS:1,20 l/min N2...........................................................................[43] Abb. 4.21 Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure aus Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, STR 65rpm und Vakuum, BC: 1,20 l/min N2..............................................................[43]
  13. 13. Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1 Enzymklassifizierungen nach dem Reaktionsprinzip [Lit.Voet et al.2002]..........[4] Tabelle 2.2 Begrenzende Faktoren der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl katalysiert durch Novozym 435..........................................................................[13] Tabelle 3.1 Verwendete Chemikalien....................................................................................[17] Tabelle 3.2 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (konjugierte Formen)2 ...................................[18] Tabelle 3.3 Produktidentifikator - [Oleon,2011]....................................................................[18] Tabelle 3.4 Produktidentifikator - Glycerine4833 – Glycerine 1.262.[Oleon,2011].............[19] Tabelle 3.5 Verwendete Materialien......................................................................................[20] Tabelle 3.6 Die Mengeneinsatz Verhältnisse.........................................................................[22] Tabelle 3.7 Die Bedingungen der Ionenaustausch-Chromatographie....................................[25] Tabelle 3.8 Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA)..............................................[25] Tabelle 4.1 Aminosäure-Verlustes.........................................................................................[35] Tabelle 4.2 Das Enzym-Verlustes..........................................................................................[35] Tabelle 4.3 Die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor...........[36] Tabelle 5.1 Charakteristika und unterschiedlichen Reaktortypen..........................................[45]
  14. 14. 1 Kapitel 1 1. Einleitung 1.1. Motivation Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emulgatoren eingesetzt werden. Sie werden in groβen Mengen aus Alkoholen und Fettsäuren produziert, wobei letztere in vielen Fällen auf nachwachsenden Rohstoffen basieren. Als ökologischen und ökonomischen Gründen soll die Synthese der Esteröle mittels Enzymkatalyse in lösungsmittelfreier Umgebung durchgeführt werden. Im Zuge der zunehmenden Knappheit an fossilen Rohstoffquellen steigert sich in den letzten Jahrzehnten der Bedarf bei der Produktion vermehrt nachwachsende Rohstoffquellen einzusetzen. Zur Zeit beträgt der Anteil von nachwachsenden Rohstoffen in der chemischen Industrie in den USA und Deutschland etwa 10% [Winkler, 2009]. Hierzu gehören vorallem natürliche Fette, Öle, Holzbestandteile, Kohlenhydrate und Proteine. Enzymatisch katalysierte Reaktionen zeichnen sich durch einen geringen Energieverbrauch und hoher Substrat- wie Produktselektivität aus. Oftmals können mehrere chemische Reaktionsschritte durch nur einen enzymatischen Schritt ersetzt werden [Andreas Liese et al. 2006]. Bei biokatalytischen Prozessen nehmen dabei die Enzymkosten den größten Stellenwert ein. Um diese so gering wie möglich zu halten, sind umfangreiche Kenntnisse zu den optimalen Betriebsbedingungen der Biokatalysatoren notwendig. Auf die Praxis bezogen ergibt sich die Wirtschaftlichkeit eines biokatalytischen Prozesses aus der benötigten Enzymkonzentration und den damit verbundenen Enzymkosten, den (physikalischen) Betriebsbedingungen und dem erzielbaren Umsatzgrad [Fullbrook,1983]. Die Veresterung von Ölen und Fetten (Triglyceride) ist ein Beispiel, bei dem die Produkte neben dem technisch etablierten Verfahren, alternativ biokatalytisch herstellbar sind. Fettsäuren und Glycerin sind wichtige Grundstoffe chemischer Prozesse und finden besonders in der pharmazeutischen sowie der Lebens- und Waschmittelindustrie zahlreiche Verwendung [Sharma, R., 2001].
  15. 15. 2 Die Lipasen dienen zur Gewinnung von Spezialitäten aus Fetten und Ölen, und durch Variation der Reaktionsbedingungen sind sie ebenso für Hydrolysereaktionen wie für Estersynthesen geeignet (Abb. 1.1) Abb. 1.1: Hydrolyse und Estersynthese mit Lipase [Schmid, R.D, 1998]. Auch für die organische Chemie sind Lipasen von großem Wert, da sie im Unterschied zu den meisten anderen Enzymen in organischen Lösungsmitteln erstaunlich stabil sind und zudem eine ungewöhnlich breite Substratspezifizität aufweisen: Sie setzen eine große Zahl aliphatischer, alicyclischer, bicyclischer, aromatischer und metallorganischer Ester um und weisen gegenüber racemischen Estern oder Verbindungen mit mehreren Hydroxyfunktionen meist eine hohe Enantio- bzw. Regioselektivität auf. Das bei der Lipase-Katalyse intermediär gebildete Acylenzym kann seine Acylgruppe aber nicht nur auf Hydroxyverbindungen übertragen, sondern auch auf andere Nucleophile, wie auf die Thiogruppe eines Thioesters oder auf aktivierte Amine. Als Folge des großen Synthesepotentials von Lipasen gibt es über ihren Einsatz in der organischen Synthese umfangreiche Literatur, die auch deshalb weiter zunimmt, weil Lipasen in wachsender Zahl als Handelsprodukte und in ―Test-Kits‖ angeboten werden [Schmid, R.D, 1998].
  16. 16. 3 1.2. Ziel der Bachelorarbeit Ziel dieser Bachelorarbeit ist Bestimmung der Enzym - Stabilität und des Enzym - Verlustes bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure im Blasensäulenreaktor. Anhand der erhaltenen Daten wird die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des gesamten Prozesses im Blasensäulenreaktor bestimmt. Die Aufgaben lassen sich in zwei Gebiete einteilen: - Der erste Versuch dient dazu, den komplete Reaktionsverlauf innerhalb von 24 Stunden detailliert aufzunehmen, damit der Reaktionsverlauf im Blasensäulenreaktor vorliegt. - Im zweiten Versuch sollten die Langzeitstabilität des Enzymes und die Ermittlung des Enzym-Verlustes unter Prozessbedingungen untersucht werden. Die Reaktion wird so oft wiederholt (mit Wiedernutzung des Enzymes), bis ausreichende Daten zum Kalkulieren der Enzym-Stabilität und das Enzym-Verlustes vorliegen. Die Anzahl des repetiven Batches hängt sehr stark davon ab, wie stabil Enzym im Blasensäulenreaktor ist. Zuerst sollen die Versuche im Rührkesselreaktor sattfinden, um einen Vergleich mit dem Blasensäulenreaktor machen zu können. Im Blasensäulenreaktor wird das Enzym immer wieder verwendet, um zu ermitteln, nach der wievielten Wiederholung die Aktivität des Enzyms nachlässt. Dann werden die Temperatur von 55-65o C und die Enzym-Menge von 1-3% variiert. Die Rektion muss mit Stickstoffbegasung durchgeführt werden, damit keine Oxidation mit Fettsäure stattfinden. Die Begasungsrate wird ebenfalls variiert.
  17. 17. 4 Kapitel 2 2. Theoretische Grundlagen Esteröle sind oberflächenaktive Substanzen, die in Körperpflegeprodukten als Emulgatoren eingesetzt werden. Sie werden in groβer Mengen aus Alkoholen und Fettsäuren produziert, wobei letztere in vielen Fällen auf nachwachsenden Rohstoffen basieren. Als ökologischen und ökonomischen Gründen soll die Synthese mittels Enzymkatalyse und lösungsmittelfreier Umgebung durchgeführt werden. 2.1. Biokatalyse Die biologischen Katalysatoren oder Enzyme (von griechisch „en―: in und „zyme―: Sauerteig/Hefe) sind essentiell für das Leben auf der Erde. Der Metabolismus aller Organismen wird durch Enzyme katalysiert. Enzyme werden entsprechend, der von ihnen katalysierten Reaktion in sechs Enzymklassen eingeteilt: Tabelle 2.1. Enzymklassifizierungen nach dem Reaktionsprinzip [Lit.Voet et al.2002] Einteilung Art der katalzsierten Reaktion Beispil 1.Oxidoreduktasen Oxidations-Reduktions-Reaktionen LDH* (reduziert Pzruvat zu Lactat) 2.Transferasen Übertragung funktioneller Gruppen Hexokinase 3.Hydrolasen Hydrolasereaktionen (spalten hydrolytisch) Triglyceridlipase (spaltet Neutralfette) 4.Lyasen Eliminierung von Gruppen unter Ausbildung von Doppelbindungen Cytoplasmatische Citrat-Lyase (spaltet Citrat in Acetyl-CoA und Oxalacetat) 5.Isomerasen Isomerisierung Glucosophosphat-Isomerase (isomerisiert Glucoso-6-phosphat zu Fructoso-6-phosphat) 6.Ligasen oder Synthetasen Mit ATP-Hydrolyse gekoppelte Knüpfung von Bindungen Aminosäure-tRNA-Ligasen verknüpfen Aminosäuren mit der zugehörigen tRNA *LDH- Lactatdehydrogenase (reduziert Pyrovat zu Lactat)
  18. 18. 5 Funktion und Effektivität von Stoffwechselreaktionen in nahezu allen Organismen hängen in erster Linie von biologischen Katalysatoren (Enzymen) ab. Damit eine Reaktion ablaufen kann, muss zunächst eine spezifische Menge an Energie aufgebracht werden, welche als Aktivierungsenergie bezeichnet wird. Ist die zur Verfügung stehende Energiemenge ausreichend groß, damit die nötige Aktivierungsenergie überwunden werden kann, befinden sich die Substratmoleküle in einem Übergangszustand. Bei ausreichender Anzahl reagieren diese dann zu den energetisch niedrigeren Produkten weiter. Enzyme senken die erforderliche Aktivierungsenergie ab, so dass sich bei gleicher Temperatur mehr Moleküle im Übergangszustand befinden als ohne Katalysator [Segel, I. H, 1975]. Biologische Katalysatoren beschleunigen Reaktionen um das 108 - bis 1010 - fache [Karlson et al, 1994] (Abb. 2.1). Enzyme bewirken eine stärkere Herabsetzung der Aktivierungsenergie als anorganische Katalysatoren, weshalb enzymkatalysierte Reaktionen im Allgemeinen schon bei milden Reaktionsbedingungen ablaufen [Hartmeier,W, 1986], dieses ist zum Beispiel am menschlichen Stoff- wechselprozess ersichtlich. Sie verschieben dabei jedoch weder das thermodynamische Reaktionsgleichgewicht, noch gehen sie in das Produkt ein. Abb. 2.1: Energiediagramm einer enzymkatalysierten (- - -) im Vergleich zu einer unkatalysierten (—) Reaktion [Karlson et al,1994]
  19. 19. 6 2.1.1. Wirkungsmechanismus von Enzymen Das katalytische Zentrum besitzt eine spezifische Konformation und befindet sich entweder auf der Oberfläche oder im Inneren des Proteins. Das Substrat muss entsprechende sterische Merkmale aufweisen, um mit dem katalytischen Zentrum interagieren zu können. Neben dieser sogenannten Substratspezifität weisen Enzyme auch eine Wirkungsspezifität auf. Sie katalysieren nur einen bestimmten Reaktionstypus. Existieren in einem Substratmolekül mehrere Bindungen des gleichen Typs, dann verhalten sich Enzyme regiospezifisch oder stereoselektiv, d.h., sie spalten Bindungen an oder in bestimmten Positionen auf. Der gesamte Reaktionsmechanismus am Enzym kann grob in folgende Schritte gegliedert werden:  Substratbindung  Katalytische Reaktion  Produktfreisetzung Bei dem Vorgang der Substratbindung kommt es zu reversiblen Konformationsänderungen des Enzyms. Dadurch wird das Enzym so ausgerichtet, dass sich zum einen Wasserstoffbrücken, ionische Bindungen und hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Enzym und Substrat zur Substratbindung ausbilden. Zum anderen können die für die katalytische Funktion verantwortlichen Aminosäuren lokal umpositioniert werden. Dies geschieht durch eine strukturinterne Ladungsverschiebung. Um die Konformationsänderung des katalytischen Zentrums zu realisieren, muss in anderen Enzymbereichen ebenfalls eine räumliche Strukturänderung erfolgen, ohne dabei jedoch die globale Enzymstruktur zu zerstören. Dieses erklärt den komplexen und aus vielen Aminosäuren bestehenden Aufbau des Gesamtenzyms. Hervorgerufen durch die substratbindenden Kräfte erfolgt neben der enzymseitigen Konformationsänderung ebenfalls eine strukturelle Substratänderung. DurchWechselwirkungen zwischen Substrat und katalytischem Zentrum kommt es zu Ladungsverschiebungen im Substrat. Dies führt zu einem aktivierten Übergangszustand des Substrats [Karlson et al,1994]. Die Folge ist eine Verminderung der Aktivierungsenergie. Im Anschluss an die Reaktion erfolgt die Freisetzung des entstandenen Produktes an die Umgebung. Das Enzym besitzt danach seine ursprüngliche Konformation [Pistiyski et al,2006].
  20. 20. 7 2.1.2. Lipasen (EC 3.1.1.3) Lipasen (EC 3.1.1.3)1 , auch Triacylglycerinester-Hydrolasen, gehören zur Familie der Serin- Hydrolasen und entsprechen einer weitverbreiteten Gruppe von Enzymen in der Natur. Sie kommen sowohl im Menschen, in Tieren und Pflanzen als auch in Mikroorganismen vor. Ihre natürliche Funktion besteht in dem hydrolytischen Abbau von wasserunlöslichen Triglyceriden zu freien Fettsäuren und Glycerin (Abb.2.2). Bei dieser biokatalytischen Gleichgewichtsreaktion entstehen, wie beim konventionellen thermischen Verfahren, Partialglyceride als Zwischenprodukt der Gesamtreaktion. Die Lage des Reaktionsgleichgewichtes wird durch den Wassergehalt des Gesamtsystems bestimmt. Je nach Wassergehalt ist ebenso die Rückreaktion (Veresterung) möglich [Pistiyski et al, 2006]. Abb.2.2: Reaktionsschema der Lipase-katalysierten Reaktion: Hydrolyse und Synthese von Triglyceriden (R1 − R3 entsprechen den Fettsäureresten) [Biochemie,Nova Print AD, 2006]. Unter Regiospezifität versteht man das Vermögen der Lipasen die Esterbindungen an bestimmten Positionen zu hydrolysieren und den Vorzug, längere oder kürzere bzw. gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren abzuspalten [Brockerhoff,1974]. Lipasen zeigen im Allgemeinen eine hohe Chemo-, Regio- und Enantioselektivität. Sie haben eine relativ einheitliche 3D-Struktur und Reaktionssequenz, die katalytische Triade gennant wird. Der Reaktionsmechanismus wird in Abbildung 2.3 am Beispiel der Lipase B aus Candida antarctica (CALB) veranschaulicht. Hydrolasen die dem Strukturtyp der α/β-Hydrolase Faltung angehören. Besitzen drei katalytisch essentielle Aminosäuren, Ser, His und Asp. Das Substrat wird im aktiven Zentrum durch die drei Aminosäuren der katalytischen Triade katalytisch umgesetzt[Hilterhaus,2008]. 1 Die EC-Nummern bilden ein Klassifikationssystem für Enzyme. Als Kriterium für die Kategorisierung wird die vom Enzym katalysierte Reaktion verwendet.
  21. 21. 8 Abb.2.3. (A) 3D-Struktur der CALB mit Van-der-Waals-Oberfläche, Vergrößerung des aktiven Zentrums mit Butylpropionat und den Aminosauren der katalytischen Triade, erstellt mit Pymol (Version 0.98 Delano- Scientific); (B) Reaktionsschema der lipasenkatalysierten Hydrolyse [Buthe, A. (2006)].
  22. 22. 9 2.1.3. Novozym 435 Viele Lipasen sind kommerziell zu niedrigen Preisen als unverarbeitetes, oft mit anderen Proteinen verunreinigtes, Produkt erhältlich [Jena Bioscience, 2009]. CALB (Abb. 2.4) wird immobilisiert auf verschiedenen Trägern oder lyophilisiert verkauft (Chirazyme L-2, Roche und Novozyme 435, Novozymes). Das kommerziell verfügbare Novozym 435, ein Präparat mit bemerkenswert hoher Aktivitat [Bourg-Garros et al.,1998], wird bereits großtechnisch eingesetzt [Hills, 2003; Thum, 2004]. Abb.2.4. Kristallstrukturanalyse von Lipase B aus Candida antarctica.[Jena Bioscience,2009] 2.1.4. Grenzflächenaktivierung von Lipasen Während die Substrate für lipasekatalysierte Reaktionen hydrophob sind, sind Lipasen selbst von hydrophiler Natur. Sarda und Desnuelle beschrieben, dass Lipasen gegenüber gelösten Substraten nur eine geringe Aktivität aufweisen. Sobald allerdings die Substrate ihre kritische Micellkonzentration erreichen, steigt die Aktivität steil an (Abb.2.5). Es müssen also in der Reaktionslösung sogenannte „Supersubstrate― oder einfacher eine zweite organische Phase (Emulsion) vorliegen [L. Sarda,1957]. Dieses Phänomen der Grenzflächenaktivierung beruht auf der Lipasestruktur. Durch Röntgenstrukturanalysen zeigte sich, dass die meisten Lipasen ein amphiphiles Peptidsegment besitzen, welches wie ein Deckel das aktive Zentrum des Enzyms bedeckt. Bei Bindung an eine hydrophobe Oberfläche, wie z.B. an einen Öltropfen, öffnet sich der Deckel durch eine Konformationsänderung und die katalytische Aktivität der Lipase erhöht sich [R. D. Schmid,1998].
  23. 23. 10 Abb. 2.5: Grenzflächenaktivierung - Lipaseaktivität in Abhängigkeit der Substratkonzentration; cmc = kritische Mizellbildungskonzentration [L. Sarda] 2.2. Fette und Fettsäuren Fettsäuren unterscheiden sich durch die Anzahl der C-Atome (Kettenlänge) sowie der möglichen Anwesenheit, Anzahl und Position von Doppelbindungen. Man kann Fettsäuren aufgrund ihrer Kettenlängen in niedere (bis sieben C-Atome), mittlere (acht bis zwölf C-Atome) und höhere (mehr als zwölf C-Atome) Fettsäuren einteilen. Die historische Namensgebung als Fettsäure suggeriert, dass eine individuelle Verbindung einmal eine Komponente eines Fettes gewesen sein muss, um eine Fettsäure zu sein. Dies ist aber nicht zwangsläufig der Fall. Unter diesem Begriff werden heute Verbindungen chemischer Ähnlichkeit gesammelt. Natürliche Fettsäuren bestehen in der Regel aus einer geraden Zahl von Kohlenstoffatomen und sind unverzweigt [Pistiyski,2006]. Der Rohstoff für die Herstellung von Fettsäuren sind natürliche pflanzliche oder tierische Fette und Öle. Öle und Fette bestehen hauptsächlich aus Triglyceriden (für gewöhnlich ≥ 95%) und zum Rest aus Monoglyceriden, Diglyceriden, freie Fettsäuren, Phospholipiden und weiteren Begleitstoffen [Pistiyski, 2006].
  24. 24. 11 2.3. Glycerine Abb. 2.6. Struktur von Glycerin. Glycerin (von gr. glykerós = süß, nach IUPAC Glycerol, auch Glyzerin) ist der Trivialname und die gebräuchliche Bezeichnung von Propan-1,2,3-triol. Glycerin ist der einfachste dreiwertige Alkohol (Triol). Der Name Glycerol wurde eingeführt, da er die korrekte Endung -ol für einen Alkohol besitzt. Glycerin ist in allen natürlichen Fetten und Ölen als Fettsäuereester vorhanden und spielt eine zentrale Rolle als Zwischenprodukt in verschiedenen Stoffwechselprozessen. Als Lebensmittelzusatzstoff trägt es das Kürzel E 422.[Breitmaier,E.,2005] 2.4. Reaktorkonzepte zur Veresterung 2.4.1. Mehrphasige Reaktorkonzepte Die große Gruppe der mehrphasigen Reaktoren umfasst Fluid-Feststoff-, Fluid-Fluid-Systeme sowie Systeme mit drei und mehr Phasen [Zehner und Kraume,2005] [Henkel,2005]. Fluid- Feststoff-Systeme sind Systeme in denen ein Feststoff in einer flüssigen oder gasförmigen Phase dispergiert ist. Reaktoren, die diese Systeme prozessieren sind unter anderen der Festbettreaktor und der Wirbelschichtreaktor. Beim Betrieb von Fluid-Fluid-Reaktoren, also der Umsetzung zweier flüssiger beyiehungsweise einer flüssigen und einer gasförmigen Phase, ist die chemische Reaktion an einen Absorptionsschritt gekoppelt [Henkel,2005]. Die Unterscheidung der Fluid- Fluid-Reaktoren ist anhand Methodik mit der die unterschiedlichen Phasen in Kontakt gebracht werden, möglich: - Dispersion des Gases in der Flüssigkeit (Blasensäule, Rührkessel, Bodenkolonne) - Dispersion der Flüssigkeit im Gas (Sprühturm, Strahlwäscher) - Dünner Film der Flüssigkeit (Rieselkolonne, Fallfilmverdampfer)
  25. 25. 12 Weiter kann die Klassifikation von Reaktoren mit einer dispergierten Gasphase bezüglich der Art des Energieeintragen erfolgen [Kastanek,1993]. So sind für Reaktoren mit gas/flüssig- Grenzfläche folgende Arten des Energieeintrages zu unterscheiden [Schügel,1980]: - Energieeintrag durch die Gasphase (Gaseintrage durch Platten, Schläuche, Ringe) - Energieeintrag durch die Flüssigphase (Pumpen, externe Zirkulation) - Energieeintrag durch interne, mechanische Elemente (verschiedene Rührertypen) Im Falle einer lösungsmittelfreier Umsetzung eines heterogenen Katalysators ist der Blasensäulenreaktor ein möglicher Reaktortyp (Abb. 2.7). Er stellt eine einfache, kostengünstige Konstruktion dar und ist sehr anpassungsfähig [Deckwer, 1992]. Abb. 2.7: Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BS) und Rührkesselreaktor (STR). 2.4.2. Lösungsmittelfreier Betrieb In Mehrphasensystemen existieren verschiedene Stofftransport-Schritte, die sich limitierend auf den Gesamtprozess auswirken können. Diese können der eigentlichen Reaktion vor- oder nachgeschaltet sein. Daher ist es notwendig hohe Stofftransportraten im Reaktor zu etablieren, was durch die Bildung großer Phasengrenzflächen möglich ist. Die verwendten Ausgangsmaterialien Glycerin und Fettsäure bilden ein Zweiphasensystem aus. Ihre Veresterung wird heterogen durch Novozym 435 katalysiert und das gebildet Reaktionswasser wird mit Hilfe eines Druckluftstorms durch den Reaktor entfernt (Abb. 2.8). Mögliche limitierende Faktoren sind in Tabelle 2.2 zusammengefasst [Hilterhaus, L., 2008].
  26. 26. 13 Abb. 2.8: Schematische Darstellung der vier an der Umsetzung beteiligten Phasen: Novozym 435 (S), Fettsäure (L1), Glycerin (L2) und Gas (G) [Hilterhaus, L.,2008]. Tabelle 2.2: Begrenzende Faktoren der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl katalysiert durch Novozym 435. Anforderung Sofftransport Begrenzender Faktor Emulgieren der Reaktanden Flüssig/flüssig Energieeintrag pro Volumen: P/VR Suspendieren von Novozym 435 Fest/flüssig Energieeintrag pro Volumen: P/VR Reaktion Diffusion Filmdiffusion: D Porosität des Trägers: D. Entfernen des Reaktionswassers Flüssig/gasstörmig Aktivität des Enzyms Grenzfläche flüssig/gasförmig: kL.a In Blasensäulenreaktor entspricht der Energieeintrag P dem Produkt aus Gasflussrate und Druckabfall: P = . ρL. g. . L (1) - Volumenstrom der Gasphase [L.min-1 ] L- Länge des Reaktors [m] ρL- Dichte der flüssigen Phasen [kg.L-1 ] g- die Gravitation; g = 9,81 [m/s2 ] - Flüssigkeitsanteil + =1
  27. 27. 14 Er variiert als Funktion des Volumenstroms der Gasphase und muss in die Überlegungen zum Energieeintrag P mit einbezogen werden. Der Gasgehalt nimmt mit steigendem Volumenstrom der Gasphase zu und bei erhöhter Viskosität und Feststoffkonzentration ab [Kantarci et al., 2005]. Die Berechnung des hydrodinamischen Parameters sowie des Soffübergangskoeffizienten kL und der spezifischen Phasengrenzfläche a ist sehr komplex. Diese Parameter hängen von Substanzeigenschaften, wie Viskosität [Ruzicka et al., 2003], Oberflächenspannung und Dichte der Flüssigkeit sowie der Dichte des Gases ab [Kulkarni & Joshi, 2005]. Die Art des Gaseintrages, die geometrischen Abmessungen des Reaktors sowie Prozessbedingungen sind ebenfalls entschedend [Deckwer, 1992]. Die Modellierung der Blasenrelativgeschwindigkeit in Gas/Flüssigkeitssystemen unter Berücksichtigung dieser Wechselwirkungen zeigt jedoch, dass drei Bereiche im Fall der Zweiphasenströmung in Abhängigkeit vom Gasgehalt unterschieden werden können: - Aufstieg der Einzelblasen auf einer spiralförmigen Bahn ohne gegenseitige Beeinflussung ( < 0,5%) - Schwarminduzierte Turbulenze bewirken erhöhten radialen Impulsaustausch und führen zu einer Abnahme der radialen und Zunahme der axialen Blasenrelativgeschwindigkeit (0,5 < < 4,8%) - Dominanz von Reynolds-Turbulenzen führt zur Abnahme der Blasenrelativgeschwindigkeit (4,8%< ) [Hilterhaus,2008][Snabre et al, 1998] Abb. 2.9: Schematische Darstellung der möglichen Strömungsformen in Blasensäulen [Kantarci et al., 2005].
  28. 28. 15 Abb. 2.10: Strömungsbereiche in Blasensäulen [Ewert et al.,2009] Zusammenfassend bleibt festzuhalten, dass die Blasengröße prinzipiell mit steigender Gasgeschwindigkeit, Feststoffkonzentration und Viskosität der Flüssigkeit zunimmt, wobei der Gasgehalt bei großen Blasen nicht, der von kleinen Blasen jedoch von der Feststoffkonzentration abhängt [Kantarci et al., 2005]. Der Stoffübergangskoeffizient kL und die spezifische Phasengrenzfläche a sind von besonderer Bedeutung hinsichtlich der Entfernung des entstehenden Reaktionswassers. Die Begasung von hochviskosen Flüssigkeiten hat gezeigt, dass es neben dem Aufsteigen von großen Blasen zu einer Akkumulation von kleinen Blasen (d < 1 mm) in Blasensäulenreaktoren kommt [Buchholz et al.,1981]. Der Beitrag dieser kleinen Gasblasen zum gas/flüssig Massentranspotr liegt bei bis zu 50% und ihre Bildung wird durch Tenside gefördert [Muller & Davidson, 1995]. Mit steigender Begasungsrate wird auch der Anteil dieser kleinen Gasblasen gesteigert, wobei ihre Akkumulation zeitabhängig ist. Kawalec-Pietrenko et al. konnten zeigen, dass der Stoffübergangskoeffizient gas/flüssig in dieser kleinen Gasblasen um eine Größenordnung höher ist, als bei großen Glasblasen, und sie somit entscheidend zum Stoffübergang in hochviskosen Flüssigkeiten in der Blasensäule beitragen [Kawalec-Pietrenko & Pietrenko, 1999]. Im Allgemeinen nimmt jedoch der volumetrische Massentransportkoeffizient kL.a mit steigendem Feststoffgehalt und bei Erhöhung der Viskosität des Mediums ab. Er vergößert sich mit steigender Gasgeschwindigkeit. Beim Vorhandensein von Tensiden werden kleine Blasen stabilisiert, was für einen effektiven Stoffübergang von großer Bedeutung ist [Kantarci et al., 2005].
  29. 29. 16 2.4.3. Rührkesselreaktor Die Systemcharakterisierung und die Charakterisierung der Biokatalysator haben gezeigt, dass sich die Anforderungen die enzymatische lösungsmittelfreie Umsetzung von Glycerin und Sonnenblumenöl wie folgt zusammenfassen lassen: - Emulgieren der Reaktanden Glycerin und Fettsäure - Syspendieren des heterogenen Katalysators Novozym 435 - Entfernen des entstehenden Reaktionswasser Versuche im Rührkesselreaktor haben gezeigt, dass die enzymatische, lösungsmittelfreie Umsetzung von Glycerol und Fettsäure möglich ist, wenn die Durchmischung von Reaktanden und dem heterogenen Biokatalysator sichergestellt ist [Hilterhaus, 2008]. Im Folgenden wird nun die lösungsmittel freie Umsetzung im Rührkesselreaktor (VR = 250 ml) untersucht, wobei der Einfluss verschiedener Parameter wie z.B. Rührdrehzahl und Temperatur [Zlokarnik, 1999] [Zlokarnik, 2006]. 2.4.4. Blasensäulenreaktor Der Blasensäurenreaktor findet ursprünglich in der Abwasserbehandlung Anwendung. Die Besonderheit dieses Reaktors ist, dass keine mechanischen Teile, die verschleißen könnten, enthalten sind. Die Durchmischung findet durch einen Gasstrom vom Boden des Reaktors zur Flüssigkeitsoberfläche statt. Der Blasensäulenreaktor eignet sich gut für enzymatische Veresterungen, da das Enzym nicht durch mechanische Teile zerstört werden kann und sich frei im Reaktor bewegt, was Viskositätslimitierungen verhindert, die im Festbett entstehen. Zudem wird mit Hilfe des Gases das Reaktionswasser der Veresterung abtransportiert und die Reaktion so auf die Seite der Produkte verschoben. Die enzymatische Veresterung zu den Fettsäureester in einem Blasensäulenreaktor ist schneller als in einem Rührkesselreaktor [Hilterhaus,2008].
  30. 30. 17 Kapitel 3 3. Materialien und Methoden In diesem Kapitel sollen die theoretischen Grundlagen zur Auswertung und Bewertung der experimentellen Ergebnisse in Kapitel 4 gezeigt werden. Dabei wird der Schwerpunkt auf die Analysemethoden, sowie die einzelnen Versuchsaufbauten gelegt. 3.1. Materialien 3.1.1. Chemikalien Tabelle 3.1: Verwendete Chemikalien Chemikalien Hersteller Lipasepräparat:  Lipase B (Novozym 435) aus Candida antarctica Novozymes, A/S: Novozym 435 Product Data Sheet, Denmark Glycerine 4833 – Glycerine 1.262 Oleon GmbH, Emmerich am Rhein Sonnenblumenöl:  Nouracid®HE 456 Oleon GmbH, Emmerich am Rhein Alle weiteren Chemikalien wurden von Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe) und Sigma Aldrich GmbH (Seelze) bezogen.
  31. 31. 18  Nouracid®HE 456 Reaktivität: Das Sonnenblumenöl ist stabil unter Normalbedingungen. Tabelle 3.2. Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (konjugierte Formen)2 . Tabelle 3.3. Produktidentifikator - [Oleon,2011] Handelsname Nouracid®HE 456 Name Fettsäure, Sonnenblumenöl Aggregatzustand (20o C) Flüssig Farbe Gelb bis dunkel gelb pH < 7 Schmelzpunkt 10o C Siedepunkt >200o C Dichte ca.900 kg/m3 (20o C) Vislosität ca.80 mPa.s (60-100), (20o C) 2 Fatty Acids and Ggycerin, Surface Chemistry, Akzo Nobel X ≡ Nouracid®HE 456 rot gelb Andere min max min max min max min max min max min max min max min max min max max min max min max X Sonnenblume 1 10 196 204 135 155 20 30 3 10 58 63 1 2 10 2 FettsäuretypProdukt mg KOH/g Säurezahl Farbe 51/4" cell Lovibond Jodzahl g 12/100g C16 C18 C18:1 < = C18 >= C20 Fettsäurezusammensetzung in % C18:2 C18 konjugierte C18:3
  32. 32. 19  Glycerine 4833 – Glycerine 1.262 Tabelle 3.4. Produktidentifikator - Glycerine4833 – Glycerine 1.262.[Oleon,2011] Handelsname Glycerine4833 – Glycerine 1.262 Name Glycerol Aggregatzastand (20o C) Flüssig Farbe Farblos bis klar gelb Schmelzpunkt 18o C Siedepunkt 290o C Dichte ca.1262,4 kg/m3 (20o C) Viskosität ca.1400 mPa.s (20o C) Reaktivität Er zersetzt sich bei Temperaturanstieg unter Bildung giftiger/ätzender/brennbarer Gase. Glycerin kann bei Temperaturansieg polymerisieren. Er reagiert mit (starken) Oxidationsmitteln und auch mit (manchen) Säuren. Glycerin ist löslich in Wasser, Ethanol, Aceton, Ethylacetat und unlöslich in Ölen/Fetten.
  33. 33. 20 3.1.2. Geräte Tabelle 3.2: Verwendete Materialien Gerät Typ Hersteller Analysenwaage BL210S, max 210g, d = 0,1mg Startorius Dispensette Digital 2-10ml Brand GmbH Rührwerk RW20 IKA Bürette Titrette® , Class A precision, 25ml Eppendorf AG, Hamburg Rührer KPG-Rührer IKA Magnetrührer RCT IKA Thermostat E100 Lauda Membranpumpe: Öl/Membranwechsel ME2C Deutschland Vacuumpumpe ME 4C NT +2AK Vacuumbrand,GmbH+CoKG, Wertheim, Deutschland Mass flow meter / controller, Durchflussregler EL-FLOW Holland Darüber hinaus wurden ausschließlich Standardlaborgeräte verwendet.
  34. 34. 21 Methoden 3.1.3. Rührkesselreaktor Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Rührkesselreaktor aus Glas verwendet (Abb. 3.1). Der Reaktor war mit einem KPG-Rührer, einer Temperierung und Vakuumpumpe ausgestattet. Der Rührer wurde mit 65 rpm betrieben. Die KPG-Hülse als Welleneintritt des Reaktors ermöglicht das Anlegen eines Vakuums von 20-200 mbar am Reaktor zur Entfernung von Wasser. Die Reaktion wird nach folgendem Ablauf durchgeführt: der Rührkesselreaktor wird thermostatisiert und mit Glycerin und Fettsäure befüllt (Tabelle 3.6). Die Reaktionsmischung wird thermostatisiert. Nach Erreichen der entsprechenden Temperatur wird der Rührer eingeschaltet und die Reaktanden für 15-20 Minuten emulgiert. In dieser Zeit ist der Anschluss für die Probenentnahmen verschlosen und am Reaktor liegt Vakuum an. Dann wird der Reaktor belüftet und die erste Probe entnommen, anschließend wird der Biokatalysator zugegeben, der Anschluss für die Probennahme verschlossen und unter Vakuum gerührt. Weitere Probennahmen geschehen analog. Abb. 3.1: Schematische Darstellung von Rührkesselreaktor (STR):1-STR mit Rührer; 2- Thermostat;3-Vakuumpumpe.
  35. 35. 22 3.1.4. Veresterung im Blasensäulenreaktor Für die Systemcharakterisierung wurde ein 250 ml-Blasensäurenreaktor aus Glas verwendet (Abb. 3.2). Der Reaktor war mit einem Sieb am Boden (50μm), einer Temperierung und einem Durchflussregler für das eingetragene Gas ausgestattet. Die Probennahme erfolgt von oben. Jede Reaktion wurde nach folgendem Ablauf durchgeführt: der Blasensäulenreaktor wurde thermostatisiert. Der Reaktor wurde mit Glycerin und Fettsäure befüllt (Tabelle 3.6) und die Reaktionsmischung bei gleichzeitiger Begasung thermostatisiert. Nach Erreichen der entsprechenden Temperatur werden die Reaktanden für weitere 15-20 Minuten emulgiert. Nach dieser Zeit erfolgt die erste Probenentnahme. Dann wird der Biokatalysator zugegeben und weitere Probennahmen erfolgen zu definierten Zeitpunkten. Abb. 3.2: Schematische Darstellung von Blasensäulenreaktor (BC):1-BC; 2-Thermostat; 3- Sollwertgeber FWE Tabelle 3.6. Die Mengeneinsatz Verhältnisse. Tabelle mit 5% FA-Überschuss Menge Fettsäure [in g] 105 Menge Fettsäure [in Mol] 0,38 Menge Glycerin [in g] 11 Menge Glycerin [in Mol] 0,12 Menge Enzym [in g] 3,5 Menge Enzym [in %] 3
  36. 36. 23 3.1.5. Säurezahlbestimmung durch Titration Die Bestimmung der Fettsäure durch Titration mit einer ethanolischen Kalilauge entspricht einer Neutralisationsreaktion: R-COOH + KOH → R-COOK + H2O (2) Es wird davon ausgegangen, dass die Base und die Säure im stöchiometrischen Verhältnis reagieren. Proben aus dem Rührkesselreaktor oder der Blasensäule mit einem Gewicht von ca. 1 g wurden unter Wärmezufuhr und Rühren in 20 mL Ethanol vollständig gelöst und mit einem Magnetrührer vermischt. Die Proben wurden nach der Zugabe von 20 μL 1 %iger ethanolischer Phenolphthalein-Lösung3 bis zum Farbumschlag (von farblos zu Magenta) mit 0,01 M ethanolischer Kaliumhydroxid-Lösung titriert. Die Verwendung des Ethanols diente einer verbesserten Löslichkeit der öligen Probe in der Kalilauge. Aus dem Gewicht der Probe und der zur Neutralisation benötigten Kaliumhydroxid-Lösung wurde die Säurezahl bestimmt. Dabei gibt die Säurezahl an, wie viel Milligramm Kaliumhydroxid zur Neutralisation von einem Gramm Probe notwendig ist. SZ= = (3) mit: SZ = Säurezahl [-] mKOH = Masse Kaliumhydroxid [mg] mProbe = Masse der Probe [g] VKOH = Volumen der Kaliumhydroxidlösung [mL] CKOH = Konzentration der Kaliumhydroxidlösung; 0,5 [mol/L] MKOH = Molare Masse von Kaliumhydroxid; 56,1 [g/mol] 3 1g Phenolphthalein wurde in 100 ml Ethanol gelöst
  37. 37. 24 Mithilfe der Säurezahl wurde der Umsatz berechnet: X = .100 = .100 = .100 = .100 (4) mit: X = Umsatz [%] c = Konzentration [mol/l] cth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Konzentration [g/mol] n = Menge [mol] nth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Menge [mol] m = Masse [g] mth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Masse [g] SZ = Säurezahl [-] SZth = aus den Einwaagen berechnete theoretische Säurezahl [-] 3.1.6. Aminosäureanalyse  Ionenaustausch-Chromatographie: Um höhere Nachweisempfindlichkeiten zu erhalten wies ROTH auf die Bildung von fluoreszierenden AS-Derivaten bei Umsetzung von AS mit o-Diacetylbenzol oder o- Phthaldialdehyd (OPA) in Gegenwart reduzierender Agentien wie KBH4 oder Thiolen wie z.B. 2-Mercaptoethanol (ME) oder 3-Mercaptopropionsäure (MPA) in alkalischer Lösung hin [ROTH, M.,1971]. Abb. 3.3: Reaktionsschema der primären AS mit OPA in Gegenwart von achiralen und chiralen Thiolverbingungen [Baek, G., 1999].
  38. 38. 25 Ortho-Phthaldialdehyd (OPA) kondensiert mit Aminosäuren unter reduzierenden und alkalischen Bedingungen zu fluoreszierenden Derivaten (Abb. 3.3), welche sehr empfindlich detektiert werden können. Darüber hinaus ist eine nicht-fluorenszenzspektroskopische Detektion bei einer Wellenlänge von 340 nm möglich, die allerdings wesentlich unempfindlicher ist. Tabelle 3.7: Die Bedingungen der Ionenaustausch-Chromatographie Bedingungen: Citratpuffer pH = 2 Stufengradient mit steigender Ionenstärke und ansteigendem pH Nachweisgrenze ca. 50 pmol Tabelle 3.8: Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA): ortho-Phthaldialdehyd (OPA): - reagiert nur mit primären Aldehyden - fluoreszierendes Isoindol-Derivat - Anregung 330 nm, Emission 460 nm, UV-Absorption bei 230 nm - Raumtemperatur; pH 9,5; Reaktionszeit: wenige Minuten - Sekundäre Amine reagieren nicht - Nachweisgrenze 50 pmol (Fluoreszenz)
  39. 39. 26 Kapitel 4 Dieses Kapitel soll die in der Bachelorarbeit durchgeführten Experimente illustrieren. 4. Experimentelle Ergebnisse und Diskussion 4.1. Veresterung im Rührkesselreaktor Der Einfluss verschiedener Parameter auf den Umsatz und die Aktivität der biokatalytischen Veresterung von Glycerin mit einer Fettsäure (Sonnenblumenöl) wurden in einem Rührkessel (VR = 250 mL) untersucht (Abb. 4.1). Abb. 4.1: Thermostatisierter Rührkesselreaktor (STR) mit Evaporation des Reaktionswassers, Auffangen des Wassers im Kondensatsammler und Druckmessung zur Veresterung von Glycerin mit Fettsäuren (Sonnenblumenöl) mit Hilfe von Novozym 435 OH OH OH + CH3 COOH m Novozym 435 -H2O OH OH O CH3 O m
  40. 40. 27 Verwendet wurde immobilisierte Lipase B von Candida antarctica als Novozym 435. Enzyme besitzen ein Temperaturmaximum, bei welchem sie eine Reaktion mit der maximalen Reaktionsgeschwindigkeit katalysieren. Reaktion mit CALB bei Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl im STR ist sehr langsam (Abb. 4.2 und Abb. 4.3). Abb. 4.2: Säurezahlkurve bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, 65 rpm Abb. 4.3: Umsatzkurven bei der Veresterung im Rührkesselreaktor mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, 65 rpm
  41. 41. 28 Innerhalb der ersten 24 Stunde konnten bei 60o C etwa 40-42% Umsatz erzielt werden. Die Säurezahl wurde 112 mg KOH/g Probe. Reaktion mit Novozym 435 bei Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl im STR war sehr langsam. 4.2. Veresterung im Blasensäulenreaktor Ein großes Problem bei der Verwendung von immobilisierten Enzymen in Rührkesselreaktoren besteht allerdings darin, dass die Immobilisate durch den Eintrag von mechanischer Energie zerstört werden. Der in dieser Arbeit verwendete Blasensäulenreaktor bot die Möglichkeit, das Reaktionssystem ohne Energieeintrag durch mechanische Komponenten zu durchmischen (Abb. 4.4). Der dafür verwendete Stickstoff Strom ermöglichte es zudem, das Reaktionswasser ohne die Verwendung von Vakuum auszutragen. Abb.4.4: Thermostatisierter Blasensäulenreaktor (BS) ohne bewegliche Einbauten mit Gaseintrag durch Bodenplatte, Regelung des Gasstromes und Entfernung des Reaktionswassers mithilfe von Stickstoff zur Novozym 435 katalysierten Veresterung von Glyzerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl. OH OH OH + CH3 COOH m Novozym 435 -H2O OH OH O CH3 O m
  42. 42. 29 4.2.1. Repetitive Batch Die Reaktion wurde wiederholt, bis ausreichende Daten zum Kalkulieren der Enzym-Stabilität und des Enzym-Verlustes vorliegen. Die Ergebnisse wurden im folgenden Diagrammen zusammen gefaßt. Abb. 4.5: Säurezahlkurven (RepBatch 1-5) und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC Abb. 4.6: Säurezahlkurven (RepBatch 6-11) und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC
  43. 43. 30 Abb. 4.7: Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Sonnenblumenöl AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC Abb. 4.8: Umsatzkurven bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC
  44. 44. 31 Abb. 4.9: Umsatzkurven der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate 1,20 l/min N2, BC Abb. 4.10: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC
  45. 45. 32 Bei Repetitive Batch 1-5 innerhalb vom ersten 1 Stunde konnten bei 60o C etwa 42-50% Umsatz erzielt werden. Die Säurezahl wurse von 95 bis 109 mg KOH/g Probe (siehe Abb. 4.5 und Abb. 4.7). Bei Repetitive Batch 6-11 innerhalb vom ersten 1 Stunde konnten bei 60o C etwa 35-42% Umsatz erzielt werden. Die Säurezahl wurse von 108 bis 121 mg KOH/g Probe (siehe Abb. 4.6 und Abb. 4.8). Für die Aktivitätsberechnung (Abb. 4.10) wurde jeweils der erste Wert (nach etwa 1h) des Experiments mit dem Nullwert: U = . 106 (5)
  46. 46. 33 Die Halbwertszeit und die Wirtschaftlichkeitsberechnung: Abb. 4.11: Die Aktivität des Novozym 435 pro Zeiteinheit. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC  Deaktivierungsrate: Die Deaktivierung ist definiert als der Verlust der Aktivität des Katalysators pro Zeiteinheit definiert: V1 = Vo. (5) mit: Kdeakt = Deaktivierungsrate [1/h] Vo= Enzymaktivität zu Beginn der Messung [U] V1 = Enzymaktivität am Ende der Messung [U] to = Zeit zu Beginn der Messung [h] t1 = Zeit am Ende der Messung [h] Die Deaktivierung Rate bringt die Stabilität eines Katalysators. In diesem Experiment Kdeakt ist: Kdeakt = 7,5.10-4 [1/h] mit einem Feler von 3,7.10-5
  47. 47. 34  Die Halbwertszeit Die Halbwertszeit ist die Zeit, in der die Aktivität halbiert definiert: V1 = Vo. (6) V2 = Vo. (7) V1 = V2 (8) t1/2 = (9) mit: t1/2 = Halbwertszeit [h] Die Halbwertszeit bringt die Stabilität eines Katalysators. Die Aktivität in der Regel zeigt einen typischen exponentiellen Abfall. Die Halbwertszeit gibt das Ausmaß der Deaktivierung des Katalysators unabhängig von betrachteten Zeitunterschieden. In diesem Experiment t1/2 = 9-16 [h]  Aminosäureanalyse o Ionenaustausch-Chromatographie: Mit Ergebnissen von diesem Methode wurde der Enzym-Verlustes und die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor bestimmt. Tabelle 4.1: Aminosäure-Verluste Asp Ser Thr Ala Val Leu AS [mg/mg Enzym] 2421 2088 2175 3018 2158 3526 AS in Novozym 435 LC 200232[mg/kg] 6640 4510 6000 6080 4650 7400 AS im Träger [%] 36.46 46.29 36.26 49.63 46.41 47.65 Tabelle 4.2:Gesamter Enzym-Verluste AS in der Probe [mg/kg Enzym] AS in Novozym 435 LC 200232[mg/kg] Verlust [%] 23307,02 58670 60
  48. 48. 35 Tabelle 4.3: Die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor V2 V3 V4 V5 V5 V7 V8 V9 V10 V11 V12 Einwaage Fettsäure AN456N [g] 104.25 105.92 104.83 106.66 106.56 105.17 105.26 104.87 105.23 105.24 105.426 Fettsäure AN456N [in Mol] 0.378 0.384 0.380 0.386 0.386 0.381 0.381 0.380 0.381 0.381 0.382 Umsatz [-] 0.955 0.986 0.979 0.995 0.994 0.977 0.987 0.983 0.983 0.978 0.976 Produkt: Triglyceride [in Mol] 0.361 0.378 0.372 0.385 0.384 0.372 0.376 0.374 0.375 0.373 0.373 Produkt: Triglyceride [g/Mol] 866 866 866 866 866 866 866 866 866 866 866 Produkt: Triglyceride [g] 312.383 327.714 322.026 332.995 332.349 322.427 326.002 323.476 324.566 322.970 322.856 0.0035kg Novozym 435x1400€/kg = 4.90€ für 312.383g Produkt Zusammenfassung:  In diesem Experiment Kdeakt ist: o Kdeakt = 7,565.10-4 [1/h] o Feler: 3,7115.10-5  In diesem Experiment t1/2 = 916,2884 [h]  Enzym-Verluste: 60%  Enzym-Kosten: 4.90€ für 312.383g Produkt
  49. 49. 36 4.2.2. Einfluss der Enzymmenge Bei einer Reaktion ohne Massentransportlimitierungen sollte zwischen der Aktivität eines Enzyms und seiner eingesetzten Menge ein linearer Zusammenhang bestehen. Um diesen Zusammenhang für das vorliegende Reaktionssystem zu ermitteln, wurden der Umsatz und die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Halbierung der Enzymmenge untersucht. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4.12 und in Abbildung 4.13 dargestellt. Der Einsatz von 1 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von 17,1 % innerhalb vom ersten 1 Stunde, wohingegen mit 2 % (w/wS) ein Umsatz von 33,1 % innerhalb vom ersten 1 Stunde erreicht werden konnte. Der Einsatz von 3 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von ca.50 % innerhalb vom ersten 1 Stund. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 1 % (w/wS) Novozym 435 1072 U, während mit 2 % (w/wS) eine Aktivität von 2078 U erzielt werden konnte. Bei 3% (w/wS) Novozym 435 der Aktivität ist 3044 U. Abb. 4.12: Umsatzkurve bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC
  50. 50. 37 Abb. 4.13: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Verwendung von 1% (w/wS), 2% (w/wS) und 3% (w/wS) Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 60o C, Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC Die beobachteten Anfangsreaktionsgeschwindigkeit liegen im Bereich von 1-3 % (w/wS) Novozym 435 zwischen 1072-3044 U bei 60o C. Die Variation der Enzymbeladung zeigt, dass es zu einem linearen Anstieg der Aktivität mit steigender Enzymbeladung kommt (Abb.4.13). Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine Enzymmenge von 3% (w/wS) Novozym 435 verwendet. Zusammenfassung:  Maximale Reaktionsgeschwindigkeit wird bei der Verwendung von 3% Novozym 435 erreicht. Bei dieser Konzentration der Umsatz vom ersten 1 Stunde ist 50%.  Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine Enzymmenge von 3% (w/wS) Novozym 435 verwendet.
  51. 51. 38 4.2.3. Einfluss der Begasungsrate Die Rektion wurde mit Stickstoffbegasung durchgeführt, damit keine Oxidation der Fettsäuren stattfand. Bei den hiezu durchgeführten Experimenten betrug der minimale Volumenstrom = 0,6 L.min-1 N2. Die Ergebnisse dieses Versuchs sind in Abbildung 4.14 und in Abbildung 4.15 dargestellt. Eine Begasungsrate von = 0,6 L.min-1 N2 führte zu einem Umsatz von 35,5 % innerhalb vom ersten 1 Stunde, wohingegen mit = 1,20 L.min-1 N2 ein Umsatz von ca. 50 % innerhalb vom ersten 1 Stunde erreicht werden konnte. Die Begasung von = 1,80 L.min-1 N2 führte zu einem Umsatz von 34 % innerhalb vom ersten 1 Stunde. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 0,6 L.min-1 N2 2241 U, während mit 1,20 L.min-1 eine Aktivität von 3044 U erzielt werden konnte. Bei 1,80 L.min-1 N2 its die Aktivität 2147 U. Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl ist = 1,20 L.min-1 N2. Abb. 4.14: Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2, BC
  52. 52. 39 Abb. 4.15: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, Begasungsrate: 0,6 l/min N2, 1,20 l/min N2 und 1,80 l/min N2 , BC Zusammenfassung:  Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit ist bei 1,80 L.min-1 N2. Bei diser Begasungsrate der Umsatz vom ersten 1 Stund ist 34%. Aber Aktivität von 2147 U ist geringer als Aktivität bei einer Begasungsrate von 1,20 L.min-1 N2  Die maximale Aktivität von 3044 U Novozym 435 wurde bei = 1,20 L.min-1 N2 beobachtet.  Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl ist = 1,20 L.min-1 N2
  53. 53. 40 4.2.4. Einfluss der Tempetatur Innerhalb dieses Abschnitts wurde die Reaktionsgeschwindigkeit der Veresterung von Glycerin und Fettsäuren aus Sonnenblumenöl als Funktion der Temperatur analysiert. Abb. 4.16: Säurezahlkurven und Linien des Abbruchkriterium bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure bei verschiedenen Temperaturen: 55o C, 60o C und 65o C. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC Abb. 4.17: Umsatzkurve bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o C, 60o C und 65o C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC
  54. 54. 41 Abb. 4.18: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, Temperatur: 55o C, 60o C und 65o C; Begasungsrate: 1,20 l/min N2, BC Die maximale Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65°C erreicht und betrug die Aktivität von 3307 U. Bei einer Temperatur von 60°C hatte das Enzym eine Aktivität von 3044 U, während bei 55°C Reaktionstemperatur nur noch eine Anfangsreaktionsgeschwindigkeit von 2381 U bestimmt werden konnte. Innerhalb vom ersten 1 Stund konnten bei 55°C - 38 % Umsatz erzielt werden, während bei 60°C ca.50 %. Bei 65°C betrug der Umsatz vom ersten 1 Stund 53 %. Zusammenfassung:  Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65o C erreicht. Bei dieser Temperatur war der Umsatz innerhalb der ersten 1 Stunde 53%.  Die geeignete Reaktionstemperatur für Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl ist 65o C.
  55. 55. 42 4.3. Vergleich des Rührkesselreaktor mit dem Blasensäulenreaktor Beim Vergleich der Reaktionsverläufe des Rührkesselreaktor und des Blasensäulenreaktor ist zu erkennen, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit im Blasensäulenreaktor höher ist als im Rührkesselreaktor (Abb.4.19). Abb. 4.19: Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Novozym 435, STR: 65 rpm und Vakuum, BS: 1,20 l/min N2 Der Vergleich der Umsatzverläufe der Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl mittels Novozym 435 im Rührkesselreaktor und Blasensäulenreaktor in Abbildung 4.20 zeigt die Reaktion im Rührkesselreaktor wesentlich langsamer ist als in der Blasensäule.
  56. 56. 43 Abb. 4.20: Vergleich der Reaktionsverläufe von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl im Rührkesselreaktor und im Blasensäulenreaktor. Reaktionsbedingungen: 11g Glycerin, 105g Fettsäure AN456N, 60o C, 3% (w/ws) Novozym 435, STR 65rpm und Vakuum, BS:1,20 l/min N2 Der Vergleich der Aktivität der Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl mittels Novozym 435 im Rührkesselreaktor und Blasensäulenreaktor in Abbildung 4.21 zeigt, dass in der Veresterung im Rührkesselreaktor wesentlich weniger Aktivität ermittelt wurde. Abb. 4.21: Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei der Veresterung von Glycerin mit Fettsäure aus Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozym 435. Reaktionsbedingungen: 0,12 mol Glycerin, 0,38 mol Fettsäure AN456N, 3% (w/wS) Biokatalysator, 60o C, STR 65rpm und Vakuum, BC: 1,20 l/min N2
  57. 57. 44 Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o C und einer Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044 U beträgt. Dieses ist mit dem unterschiedlichen Energieeintrag in die beiden Reaktortypen zu begründen. Zusammenfassung:  Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o C und einer Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044 U beträgt.  Die Blasensäule ist daher der geeignete Reaktor für die Versterung von Glycerin und Fettsäuren aus Sonnenblumenöl mittels Novozym 435.
  58. 58. 45 Kapitel 5 5. Diskussion und Ausblick Im Rahmen dieses Versuchs wurden der enzymatischen Veresterung von Glycerin und Fettsäuren aus Sonnenblumenöl mit Hilfe von Novozyme 435 im Blasensäulenreaktor und die Wirtschaftlichkeit des Prozesses Veresterung bestimmt. Das Reaktorkonzepte basiert auf einer Blasensäule, die mit Sticksoff durchströmt wird, wobei das eingetragene Gas zum Einen die Aufgabe hat die Reaktanden zu mischen beziehungsweise zu emulgieren und zum Anderen dazu dient, das entstehende Reaktionswasser auszutragen. Als Katalysator wird Novozym 435, ein kovalent gebundener Biokatalysator auf Basis von CALB im Blasensäulenreaktor verwendet. Die Unterschiede und Charakteristika der verschiedenen in dieser Arbeit verwendeten Reaktoren sind in Tabelle 5.1 zusammengefasst. Tabelle 5.1: Charakteristika und unterschiedlichen Reaktortypen Reaktor Energieeintrag Wasserabtrennung STR KPG-Rührer Vakuum BC Gasblasen Begasung Auf Grund der Heterogenität vom Biokatalysator und der Viskosität der Reaktanden kann es zu verschiedenen Massentransportlimitierungen bei der lösungsmittelfreien Veresterung kommen. Diese Limitierungen können unter anderem in der Durchmischung und Dispersion der Reaktanden und des Katalysators oder aber in der Diffusion in porösen Träger des Katalysators liegen. Die Deaktivierung und die Halbwertszeit bringt die Stabilität eines Katalysators. In diesem Experiment sie sind: Kdeakt = 7,5.10-4 [1/h] mit einem Feler von 3,7.10-5 und t1/2 = 9-16 [h]. Mit Ergebnissen von der Aminosäureanalyse wurde der Enzym-Verlustes und die Wirtschaftlichkeit (Enzym-Kosten) des Prozesses im Blasenreaktor bestimmt (Tab. 4.1 und 4.2): Enzym-Kosten: 4.90€ für 312.383g Produkt.
  59. 59. 46 Kapitel 6 6. Zusammenfassung Innerhalb der vorliegenden Bachelorarbeit wurde ein Prozess für die enzymatische Veresterung von Glycerin mit Fettsäuren aus Sonnenblumenöl ohne die Verwendung von organischen Lösungsmitteln untersucht. Die hergestellten Produkte sind Fettsäureester von Glycerin. Verwendet wurde immobilisierte Lipase B von Candida antarctica als Novozym 435. Die Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl im STR mit Novozym 435 ist sehr langsam. Innerhalb der ersten 24 Stunden konnten bei 60o C etwa 40-42% Umsatz erzielt werden. Die Säurezahl betrug dabei 112 mg KOH/g Probe. Ein großes Problem bei der Verwendung von immobilisierten Enzymen in Rührkesselreaktoren besteht allerdings darin, dass die Immobilisate durch den Eintrag von mechanischer Energie zerstört werden. Der in dieser Arbeit verwendete Blasensäulenreaktor bot die Möglichkeit, das Reaktionssystem ohne Energieeintrag durch mechanische Komponenten zu durchmischen. Der dafür verwendete Stickstoffstrom ermöglichte es zudem, das Reaktionswasser ohne die Verwendung von Vakuum auszutragen. Bei einer Reaktion ohne Massentransportlimitierungen sollte zwischen der Aktivität eines Enzyms und seiner eingesetzten Menge ein linearer Zusammenhang bestehen. Um diesen Zusammenhang für das vorliegende Reaktionssystem zu ermitteln, wurden der Umsatz und die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Halbierung der Enzymmenge untersucht. Der Einsatz von 1 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von 17,1 % innerhalb der ersten Stunde, wohingegen mit 2 % (w/wS) ein Umsatz von 33,1 % innerhalb der ersten Stunde erreicht werden konnte. Der Einsatz von 3 % (w/wS) Novozym 435 führte zu einem Umsatz von ca.50 % innerhalb der ersten Stunde. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit betrug bei 1 % (w/wS) Novozym 435 1072 U, während mit 2 % (w/wS) eine Aktivität von 2078 U erzielt werden konnte. Bei 3% (w/wS) Novozym 435 war der Aktivität 3044 U. Die Variation der Enzymbeladung zeigt, dass es zu einem linearen Anstieg der Aktivität mit steigender
  60. 60. 47 Enzymbeladung kommt. Um eine ausreichend kurze Reaktionszeit zu ermöglichen, wird eine Enzymmenge von 3% (w/wS) Novozym 435 verwendet. Die maximale Reaktionsgeschwindigkeit wurde bei 1,80 L.min-1 N2 erreicht. Bei dieser Begasungsrate wurde ein Umsatz von 34% innerhalb der ersten Stunde erzielt. Aber die Aktivität von 2147 U ist bei einer Begasungsrate von 1,80 L.min-1 N2 geringer als Aktivität bei einer Begasungsrate von 1,20 L.min-1 N2. Die maximale Aktivität von 3044 U Novozym 435 wurde bei = 1,20 L.min-1 N2 beobachtet. Die geeignete Begasungsrate für Veresterung von Glycerin und Fettsäure aus Sonnenblumenöl ist = 1,20 L.min-1 N2. Die maximale Anfangsreaktionsgeschwindigkeit wurde bei einer Temperatur von 65°C erreicht und betrug die Aktivität von 3307 U. Bei einer Temperatur von 60°C hatte das Enzym eine Aktivität von 3044 U, während bei 55°C Reaktionstemperatur nur noch eine Anfangsreaktionsgeschwindigkeit von 2381 U bestimmt werden konnte. Die geeignete Reaktionstemperatur für Veresterung von Glycerin und Sonnenblumenöl ist 65°C. Beim Vergleich der Reaktionsverläufe des Rührkesselreaktor und des Blasensäulenreaktor ist zu erkennen, dass die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit im Blasensäulenreaktor höher ist als im Rührkesselreaktor. Die Anfangsreaktionsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 60o C und einer Enzymkonzentration von 3% (w/wS) liegt im STR bei 476 U wohingegen sie im BC 3044 U beträgt. Dieses ist mit dem unterschiedlichen Energieeintrag in die beiden Reaktortypen zu begründen.
  61. 61. 48 Literaturverzeichnis Baek, G., (1999): Analytik von Aminosäuren und biogenen Aminen in fermentierten Lebensmitteln mittels HPLC und GC. Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades, Gießen Brockerhoff, H. (1974), Brockerhoff, H und R. G. Jensen: Lipolytic enzymes. Academic Press, New York Breitmaier, E. (2005), Breitmaier, E und Jung Grünther: Organische Chemie. Thieme Buchholz, R. (1981); Zarkzewski, W.; Schügerl, K.: Techniques for Determining the Properties of Bubbles in Bubble Column. In: International Chemical Engineering 21, S.180-187 Buthe A. (2006), Charakterisierung und rationale Immobilisierung von Lipasen in biphasischen Reaktionssystemen, Diplom Biologe Christine Winkler (2009). Rohstoffbasis der chemischen Industrie. http://www.vci.de Deckwer, W.-D (1992); Deckwer, W.-D. (Hrsg.); R.W., Field. (Hrsg.): Bubble column reactors. John Wiley & Sons Inc., Chichester, UK Duwensee J. (2008): Lipasen-katalysierte Polykondensation in wasserhaltigen Reaktionssystemen. Fullbrook, P. D. (1983): Practical applied Kinetics. In: Industrial enzymology: the application of enzymes in industry, S. 8–40. Nature Press, New York Henkel, K.D. (2005): Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry. Kap. Reactor types and their industrial applications, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weincheim,
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