1. MÉTHODE CINÉTIQUE
appliquée à la reconnaissance isomérique
T. Fouquet - groupe masse – méthode cinétique
1
10 juillet 2009

2. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
2
M H
+
MH
+
+ AP = -ΔHréaction
A H
+
H2
B iAH
+
B i +
k 1
HBi
+
A+
k 2
AH
+
B i +
HBi
+
A+
A H
+
H2
B i
∆ ε 0
A ≈ Bi
(Structure et interactions)
(voies uniques de fragmentation)
~ fonctions de partitions
 Méthode de mesure de propriétés et données
thermochimiques
 Cinétiques de dissociations compétitives d’un
cluster formé :
De l’analyte A
D’un composé de référence Bi
 Nécessité d’une fragmentation limitée
Liaisons faibles
Energie de collision faible
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

3. MÉTHODE CINÉTIQUE STANDARD
(2)
 Tracé (« kinetic method plot »)
 Différentes versions
Standard
Isentropique
 Erreur sur la variation d’entropie constante
 Conservation de la linéarité
Etendue
 Mesure de l’entropie pour chaque point
 Tracés modifiés pour éliminer les corrélations
 Nécessité de données sur les variations d’entropie des
références
3
ln(k2/k1)
AP(Bi)
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

4. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE
4
[MII
+ réf*2 + sucre – H]+
r é f *
M I I
s u c r e
r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

5. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (2)
 Dissociation du cluster primaire (trimérique)
5
r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
r é f *M I I
r é f *
- H
+
M I I
r é f * s u c r e
- H
+
k 2
k 1
R =
k 1
k 2
[ M I I
+ r é f * 2 - H ] +
[ M II
+ r é f + s u c r e - H ] +
=
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

6. MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
 Modélisation des cinétiques de dissociation par
l’abondance des ions fragments.
6
100 200 300 400 500
0.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6 [MnII
+ Asp2 + sucre – H]+
- réf*
- sucre
R =
[ M II
+ A s p 2 - H ] +
[ M II
+ A s p + f r u - H ] +
[MnII
+ Asp2 – H]+
[MnII
+ Asp + sucre – H]+
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

7. 0
2e+5
4e+5
6e+5
8e+5
1e+6
MÉTHODE CINÉTIQUE APPLIQUÉE
À LA DISTINCTION ISOMÉRIQUE (3)
 Par exemple
 D-gal et D-fru discriminés par Mn – L-Asp
7
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
0.0
2.0e+5
4.0e+5
6.0e+5
8.0e+5
1.0e+6
1.2e+6
1.4e+6
D-gal
R = 0,40
D-fru
R = 0,88

8. DANS NOTRE CAS
 Métal :
Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn
 Références
Acides aminés
 Similitudes structurales
 Interaction Pi
 Analytes
Monosaccharides : glucose, galactose et fructose
8
NH2
OH
O
O
OH
L - a c id e a s p a r t iq u e
A s p
NH2
OH
O
O
OH
L - a c id e g lu t a m iq u e
G lu
NH2
OH
O
O
NH2
L - g lu t a m in e
G ln
NH2
OH
O
O
NH2
L - a s p a r a g in e
A s n
NH2
OH
O
OH
L - t h r é o n in e
T h r
NH2
OH
O
OH
L - s e r in e
S e r
NH2
OH
O
L - p h é n y la la n in e
P h e
O
OH
H
H
H
OH
OH
H OH
H
OH
O
OH
H
H
OH
H
OH
H OH
H
OH
O
OH
OHH
H
OH
H
OH H
H
OH
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

9. QUELQUES SYSTÈMES
DISCRIMINANTS
métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
9
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

10. r é f *
s u c r e
M I I
r é f *
- H
+
EVOLUTIONS
 Trois problèmes :
Pas de formation du cluster trimérique
Pas de distinction isomérique, absolue ou partielle
Fragmentation secondaire forte (> ion fragment attendu)
 Utilisation d’un ligand fixe
10
r é f *
s u c r e
M II
L f ix e - H |+
u n it é f ix e
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

11. LIGAND FIXE
11
[Fe – Asn2 – glc – H]+[Fe – Asn2 – gal – H]+
[Fe – Asn2 – fru – H]+
– gal– fru– glc
– Asn
 Pour le déterminer
Par exemple : Asn pour Fe
Perte nulle ou faible de réf*  Lfixe
Perte nulle de Lfixe avec une autre réf*
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

12. métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
métal (II)
Ca Mn Fe Co Cu Zn
référence
L - Asp
gal 0,07 +/- 0,02 0,39 +/- 0,03 0,43 +/- 0,03
trimère quasi non formé
trimère peu formé 0,68 +/- 0,06
glc 0,66 +/- 0,06 2,3 +/- 0,5 2,6 +/- 0,2 fragmentation
secondaire forte
3,0 +/- 0,2
fru 0,16 +/- 0,02 0,88 +/- 0,05 2,0 +/- 0,2 3,3 +/- 0,3
L - Phe
gal perte de Phe unique,
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
perte de sucre quasi
unique --> ligand fixe
0,21 +/- 0,03
glc 5,9 +/- 0,9
fru 5,7 +/- 0,5
L - Asn
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal 1,7 +/- 0,1 R > 6 R > 10 R > 10 R > 30 R > 10
glc 11,3 +/- 0,9
fru 4,5 +/- 0,3 > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Ser
gal
fragmentation secondaire
forte
fragmentation secondaire
forte
fragmentation
secondaire forte
fragmentation
secondaire forte
2,32 +/- 0,04
fragmentation
secondaire forteglc 5,7 +/- 0,3
fru 20,8 +/- 0,2
L - Gln
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
perte de sucre exclusive
perte de sucre quasi
exclusive
gal R > 5 R > 10 R > 13 R > 10 R > 40 R > 8
> ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe > ligand fixe
L - Thr
gal
perte de réf* uniquement
0,04(2) +/- 0,006
non répétable
Pas de distinction glc/fru
0,12 +/- 0,01
pas de distinction, perte
de réf* uniquement
0,25 +/- 0,03
glc 0,52 +/- 0,03 1,14 +/- 0,02 2,5 +/- 0,3
fru 0,33 +/- 0,02 1,72 +/- 0,08 2,4 +/- 0,2
L - Glu
gal 0,12 +/- 0,02
peu répétable (chélate
faiblement formé)
peu répétable (chélate
faiblement formé)
protonation de glu seule, pas de chélateglc 1,12 +/- 0,05
fru 0,35 +/- 0,01
L - Arg
protonation de L- Arg seule
pas de formation de chélate
D - fucose chélate non formé
100 200 300 400 500
0.0
5.0e+5
1.0e+6
1.5e+6
2.0e+6
2.5e+6
 Formation du chélate
Réf* = D – fucose (déoxy – galactose)
Cu(Asn)fucose–sucre et Cu(Phe)fucose-sucre OK
 Diminution des fragmentations secondaires
 Renforcement des discriminations
Fe – Thr : pas de distinction fru / glc
 Rgal = 0,06
 Rfru = 1,2 / Rglc = 1
Fe(Asn)Thr : OK !
 Rgal = 0,17
 Rglc = 1,2
 Rfru = 4,0
 Inconvénient : faible abondance du cluster
100 200 300 400 500
0
1e+5
2e+5
3e+5
4e+5
5e+5
6e+5
[FeII
+ L-Thr2 + D-gal – H]+
[FeII
+ L-Asn + L-Thr + D-gal – H]+
LIGAND FIXE
12
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

13. QUANTIFICATION EN MÉLANGE
 D’après Cooks :
Méthode « intrinsèquement » linéaire
(si l’on respecte les limitations :
 Proximité structurale des composés
 Pas de barrière énergétique)
X et Y deux composés en mélange
Rx et Ry facteurs de reconnaissance
 Possibilité de quantifier N composés en mélange
si N – 1 systèmes discriminants
13
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

14. QUANTIFICATION – QUELQUES
PROBLÈMES
 Déviations
Positives
Négatives
Inflexion ?
 Variable avec les sucres et les systèmes
14
Cu – Ser – gal/fru
Cu – Ser – gal/glc
Co – Thr – gal/fru
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

15. QUANTIFICATION ?
 Trois conditions nécessaires et suffisantes
Système discriminant
Trimère « suffisamment » formé
 erreur absolue
Facteurs « suffisamment » différents
 Erreur relative, ou incidence de l’erreur absolue
15
Co – Thr – glc/fru
Rglc = 1,34
Rfru = 1,80
Rfru = 23,3
Rgal = 2,38
Cu – Ser – gal/fru
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

16. NON LINÉARITÉ DE LA MÉTHODE
 Trois causes possibles (pour le moment)
Entropie négligée
 Interactions intramoléculaires (liaison H)
 Dissemblance réf* / analyte
 Pb : impossibilité de correction « formelle » sans références
 (interaction « métallique » et « moléculaire »)
Modification ou différence de rendement de
formation du trimère en mélange selon l’analyte
 Exaltation ou diminution « artificielle » du ratio
Modification de R en présence d’un autre sucre
 Utilisation de sucres marqués 13
C
16
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

17. VARIATION DE RSUCRE ?
17
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
Ln(Rfru marqué)
Ln(Rgal)
xgal
xgal
 Utilisation d’un sucre marqué : 13
C – fructose
 Mélange gal – 13
C-fru
 Clusters en m/Z et m/Z + 1
 Fragmentation m/Z  Rgal
 Fragmentation m/Z + 1  R13C-fru et R13C, 15N, 2D-gal
 Corrections :
 Isotopes naturels de gal
 R13C – fru / Rfru
Exemple (le seul ) : Cu – L-Ser

18. VARIATION DE RSUCRE (2)
18
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique
ln Rmélange – Cu-Ser
xgal
Modélisation grossière
par une parabole
Correction R13C – fru / Rfru
Abondance naturelle
a = -0.04
b = 0.908
a’ = -1.93
b’ = 3.14
~ 1.9 ~ -4.2 ~ 3.1

19. A PRÉCISER RIGOUREUSEMENT
 Contrairement à ce qui a été fait ici…
R13C – sucre / Rsucre ?
 Simple rapport dans le cas précédent…
Abondance naturelle des isotopes de réf*, Lfixe et sucre
non marqué
(Soit les deux corrections apportées !)
Et travailler avec d’autres systèmes et d’autres
sucres…
19
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique

20. MERCI DE VOTRE ATTENTION !
20
T.Fouquet-Méthodecinétiqueappliquéeàladistinctionisomérique