1. MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE

2. I- MICROBIOLOGIE QUANTITATIVE
Microorganismes =
- combien? Quel taux?
- distribution?
- diversité?
- rôle fonctionnel?
- contrôles?
Méthodes de mesure
standardisées, précises, répétables, sensibles

3. 1- Echantillonnage
Eau Sédiment
Accès direct, éloigné éloigné
Echantillonnage filet, bouteille, filtre pelle, carottier
Traitement dilution, concentration dilution
- stériliser ou rincer
- fixation (glutaraldéhyde, formaldéhyde)
- stockage (4 ou - 20 ou - 80°C)
- faire les analyses le + vite possible!!!!

4. Filet à plancton
(algues et protozoaires)
Bouteille de Niskin

5. Pelle à sédiment
Carottier

6. 2. Activité enzymatique
enzyme
Substrat produit
Disparition du substrat
Apparition du produit
- Activité réelle
dynamique
- Activité potentielle
Traceurs et marquage
- fluorescent, coloré
- isotopique stable ou radioactif

7. 2.1- Dynamique AUTOCLAVED
150
Fe(II)
Quantifier substrats et produits 100
Fe (II) uM
Au cours du temps
50
Réduction de Fe (III) 0
0 200 400 600 800
time (h)
Inhibiteurs ou compétiteurs
nitrapyrine NH4+ oxidase
chlorate NO2- oxidase
C2H2 N2O réductases

8. 2.2- Traceurs et marqueurs
Ajout de substrat devenir?
- chromogène ou fluorogène
- marquage isotopique
Attention!!!
Activité potentielle
- Microcosmes (radioactifs, chromogène, fluorogène)
- Nature (isotopes stables)

9. Substrat chromogène ou fluorogène
Colorimétrie
Microplaque Biolog
INT
respiration
INT-formazan
Fluorimétrie
Methylumbellyferone
Amino-methylcoumarine

10. Marquage isotopique
Même élément = différentes masses
Carbon-12 Carbon-13 Carbon-14
electrons
neutrons
protons
(6P + 6N) (6P + 7N) (6P + 8N)
Isotopes stables Isotopes radioactifs

11. Isotopes radioactifs
3H [3H]-CH3 Oxydation du méthane
14C [14C]-CaCO3 photosynthèse
35S [35S]-SO42- Réduction des sulfates
Particules β
Excitation
Cocktail scintillant = solvant
3H
Solvant + émulsifiant + fluor
cpm fluor

12. Isotopes stables Fractionnement
Soufre 32S, 33S, 34S, 35S
Isotope + léger réagit + vite
Desulfovibrio spp.
SO42- H2S enrichi en 32S
Desulfatomaculum spp.
Rapport isotopique
34S/32S – 34S/32Sstandard
échantillon
δ34Sechantillon = x 1000
34S/32S
standard

13. Spectromètre de masse + GC
Séparation et identification Rapport masse/charge
des isotopes
• 13C/12C = 0.011225
ions
• 13C/12C = 0.011071
• 13C/12C = 0.010918
Bombardement e-
Masse molaire

14. 3- Biomasse
Densité = nb de cellule par volume ou par surface
Biomasse = mg de C par volume ou par surface
fg C Cell-1
culture
Escherichia coli 109-323
bacterioplancton
Antarctique 7-13

15. 2 Stratégies:
Comptage direct
DIRECT
Biomarqueurs
Quantité?
INDIRECT culture

16. 2.1. CULTURE EN MILIEU SOLIDE
COMPTAGE des UFC

17. 2.2. CULTURE LIQUIDE Estimation statistique
Nombre le plus probable (NPP)
1 ml dans 9 ml
Table de Mac Grady (extrait)
NPP
10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
3 2 0 9
+ + + - -
+ - - - - 3 2 1 15
+ + - - - 3 2 2 21
3 2 1 0 0
Bactéries/ml = 15/10-2 = 1500

18. 2.3. COMPTAGE DIRECT
Hémocytomètre Microscope Eucaryotes
photonique
Electrolyte Compteur de particules
= cytomètre de flux
Fluorescence
Microscope à
épifluorescence

19. Hémocytomètre
Algues,
champignons,
protozoaires

20. Microscope à épifluorescence
Occulaire
Filtre
em.
Filtre
exc.
objectif
excitation emission
Acridine orange, DAPI, Syber green

21. Hybridation
FISH
Populations, groupes taxonomiques

22. Cytomètre de flux
SSC = granularité
Flux Détecteur de
d’échantillon lumière
FSC = taille
SSC
Laser
FSC
488nm
Dispersion et émission

23. 2.4. BIOMARQUEURS
ADN, ATP, chla, lipides, acide muramique….
DNA 1.6-5.7 fg / bactérie
ATP 1 fg / bactérie
Problèmes = état physiologique, tous les organismes vivants

24. LIPIDES Membranes cytoplasmiques
Acides gras
phospholipidiques Acides gras
FAME = Fatty acid methyl ester
PLFA = Phospholipid linked fatty acids
1- Extraction avec des solvants
2- Esterification
3- chromatographie gazeuse

25. Groupes fonctionnels
Champignons18:2w6
Bactéries 18:1w7c
cy19:0
i15:0
a15:0 Actinomycètes 10Me 18:0
i14:0
Biomarqueurs = diversité + biomasse

26. ACIDES NUCLEIQUES -
ARNm =
ADN
gènes fonctionnels
ARNr 23S
ARNr 16S
ARNr 5S
Extraction= +
1- lyse (physique, chimique, enzymatique)
2- extraction (phenol/chloroforme)
3- purification
4- précipitation (éthanol, iso-propanol)
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/index.htm
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

27. PCR = Polymerase Chain Reaction
Température ºC
dénaturation 94-96
1er cycle
amorces 50-60
hybridation
+ dNTPs polymérase élongation
72
94-96
2e cycle

28. PCR en temps réel
Sonde TaqMan
mesurer à chaque cycle d’amplification la quantité
d’ADN par marquage fluorescent
log[ADN]=a(nombre de cycle)+b
[ADN]
Nb de cycles

29. 4- Diversité génétique = Acides nucléiques
ARNm = diversité phénotypique
ADN = diversité génotypique
- Population
- Groupes fonctionnels
- Communauté
PROFIL = code barre de l’espèce ou de la communauté
SEQUENCE = succession de paires de base

30. Quel gène amplifier?
- ARN ribosomal genres et espèces
16S ITS 23S
- Eléments répétés espèces
- DNA gyrase (gyrA et gyrB) espèces
- Gènes fonctionnels groupes fonctionnels
Ex. Nir K et Nir S codent des nitrites réductases
dénitrification

31. Séparation par la TAILLE
Fragments de taille variable
ITS, éléments répétés, microsatellites
Paires de bases
- 1000
Électrophorèse
500
en cuve ou en
capillaire
+ 200
Gel d’agarose ou d’acrylamide
par LC (pair d’ions)

32. Fragments de même taille ARNr 16S, gènes fonctionnels
Couper avec une enzyme de restriction
POPULATION
A B
Souche
RFLP
(restriction fragment
length polymorphism)

33. COMMUNAUTE Trop de bandes
*
Espèce A
amorce fluorescente* *
Espèce B
A B A+B A+B
*
Gel d’acrylamide
(electrophorèse *
capillaire) RFLP tRFLP

34. Séparation par la COMPOSITION
% bases G+C DENATURATION
Électrophorèse sur gel d’acrylamide
GC clamp Amplicon
Gradient dénaturant chimique (DGGE)
ou
thermique (TGGE, TTGE)
Élution à 65 ºC
dHPLC
pair d’ions

35. CONFORMATION = SSCP
Single strand conformation polymorphism
Électrophorèse d’acrylamide
(gel ou capillaire)
ARNr 16S, gènes fonctionnels Dans le gel à 20°C les simples
brins se replient sur eux-mêmes
A+B
Dénaturation (98°C-5 min)
2 simples brins

36. Analyse du profil = Diversité et structure
Richesse: nombre de phylotypes
chaque bande = 1 phylotype ou OTU
Structure: profil de bandes
Similarité entre 2 communautés = similarité entre 2
profils
Composition? Quelles espèces?

37. Identification = séquençage
Analyse phylogénétique
Électrophorèse
ou dHPLC
Séquençage
séparation des Identification
phylotypes

38. Séparer sans électrophorèse= clonage
restriction Plasmides 2 kb
β-galactosidase
Fosmides 40kb
vecteur
Cosmides 40kb
Résistance
BAC 300 kb
ADN environnement
YAC >300 kb
vecteur
ligation sélection

39. Maxima cloaca (genoscope- Evry)

40. séquençage ATGGCCTTAAAAGC
ATGGCCTTAAAAGC
ATGGCCTTAAAAG
ATGGCCTTAAAA
PCR
ATGGCCTTAAA
ATGGCCTTAA
Électrophorèse ATGGCCTTA
capillaire ATGGCCTT
ATGGCCT dNTPs
ATGGCC fluorescents
ATGGC
ATGG STOP!
ATG
AT
A

41. Hybridation
Puces à ADN
ARNr 16S ou gènes fonctionnels

42. Attention!!!
Choix de la méthode
Biais