O documento descreve 1) fagos lambda que carregam DNA e infectam bactérias, 2) técnicas de criação de bibliotecas genômicas usando fragmentação de DNA e fagos, e 3) mecanismos de replicação fiel e reparo do DNA em bactérias.

1. FAGOS LAMBDA: comporta fragmentos maiores que plasmídeo. Limite de tamanho relacionado com
capacidade de empacotamento para encaps. Propagam genoma dentro de bactérias. Dentro do DNA
viram são mantidas informações para infecção e replicação do genoma. Célula hospedeira norteia o
comportamento, replicação rápida reproduz vírus mais rápido. Infectam de modo horizintal. O genoma do
fago λtem cerca de 50 kb. Na extremidade esquerda estão localizados os genes que codificamas proteínas
da cabeça e cauda; os genes que codificamproteínas envolvidasno ciclo lítico mapeiam na extremidade
direita. A região central do genomapode ser removida ou substituídapor DNAexógeno sem afectara
capacidade de replicação do fago, permitindo a inserçãode DNA exógeno até≈25 kb.
BIBLIOTECA GENÔMICA: fragmentação permite amplificação dos genes individuais, produzindo massa
clonada. Uma amostra do DNA genômico total é primeiro separada mecânicamente ou parcialmente
digerida por enzimas de restrição em grandes fragmentos. Essa população quase aleatória de fragmentos
de DNA superpostos é, então, separada por eletroforese em gel para isolar trechos com de 15 Kb de
comprimento. Ligantes sintéticos são unidos às pontas desses fragmentos, são formadas pontas adesivas,
eos fragmentos são, então, inseridos em um vetor, tal como o DNA do fagol, preparado com as mesmas
pontas adesivas. As E.coli são, então, infectadas com esses fagos recombinates. O lisado resultante
contém fragmentos de DNA humano abrigados em um número suficientemente grande de vírus para
garantir que quase todo o genoma esteja representado. Estes fagos constituem uma biblioteca genômica.
DNA POLIMERASE REPLICATIVA: fidelidade com a replicação, as outras geral conseqüências compa ou
incompatíveis com a célula por introdução de alterações nos caracteres hereditários.
REPARO DE DNA: não possui compromisso com a informação. Complexo replicativo é interrompido até
reparar. ENDO reparam no meio. EXONUCLEASES reparam falhas nas pontas.
FOTORREATIVAÇÃO ENZIMÁTICA: remove dímeros de pirimidina formados por exposição do DNA ao
UV, enzimas revertem a modificação, se ligam a ela mesmo na ausência de luz, mas só reagem com luz.
REPARO DE BASES ALQUILADAS: guanina é muito afetada por agentes alquilantes, uma transferase
reconhece e remove o grupamento metila causador da mutação, há degradação da enzima nesse
processo. EXCISÃO DE BASES: clivagem da ligação base nitrogenada-desoxirrobose por glicosilases,
preenchendo com a base correta pela DNApol (ocorre na correção da desaminação da citosina a uracila –
remove a base, uma endo cliva em região adjacente, DNApol preenche e ligase liga). EXCISÃO DE
NUCLEOTÍDEOS: incisão endonucleotidica dos dois lados da lesão seguida de preenchimento pela
DNApol, reparo de regiões curtas ocorre constitutivamente e de longas depende de indução por ocorrência
de lesão.
PROTEÍNA-TUS: interrompe movimento da forquilha, desencadeia sistema de reparo. Se liga à sequência
consenso, funcionando como um terminador para a helicase.
Ocorrência de erros: RADICAIS LIVRES (atuam sobre fita dupla), RADIAÇÃO, ELEMENTOS MÓVEIS
(inserção de sequência heteróloga – geralmente não detectáveis). NATURAIS: aumento significativo de
uma das bases, induz erros. BYPASS: base mutante é aceitada e qualquer base com pareamento é
inserida, gerando um mutante. Frequência de mutações geralmente identificadas por surgimento de
colônias diferentes. MENOR numero de mutantes significa reparo POUCO ativo. Reparo MUITO ativo
perpetua mutações. Mutação em sequências conservadas levam em geral a morte celular, não havendo
contabilidade de mutantes nas colônias. BASES MAL PAREADAS: responsabilidade do sistema de
correção de erro são ptnas codificadas pelos GENES mut. Remove segmentos de fita simples contendo
mal pareamento. Um sinal específico direciona o sistema de excisão do erro para a fita recém sintetizada
(reconhecimento das sequências GATC próximas ao erro). Fitas com GATC metiladas são as parentais, a
outra é a recém. Tb reconhece adições, deleções e substituições. REPARO POR ECOMBINAÇÃO: fita
complementar não danificada é utilizada como molde na substituição do fragmento lesado. Se o molde não
estiver disponível fica uma lacuna, em organismos diplóides há a mesma ou quase a mesma sequência
nos cromossomos homólogos. Em E.Coli a RecA pareia as duas moléculas de DNA homólogas e catalisa
reações de troca de fita. SISTEMA SOS: expressão induzida por erros graves capazes de impedir a
síntese do DNA, os genes SOS dão origem a enzimas de reparo, exemplo: dímeros de pirimidina, há
excisão, ficam lacunas, RecA se liga, isso desativa o repressor dos genes SOS, lexA, cuja região possui
um operador SOSbox. Logo RecA repara recombinando (com troca das fitas) e por indução de genes
SOS. É usada RecA- em bactérias de laboratório para que a mutação induzida seja mais eficiente e não
corrigida, na célula viva ela é necessária para reduzir o efeito letal da mutação. RecA Tb cliva repressores

2. de genes virais, permitindo síntese de unidades pteicas q vão compor o capsídeo e lisar a célula.
RecBCD: atuam como topoisomerases, abrindo e clivando sequências defeituosas, agregando outras
ptnas. A clivagem se dá dentro do motivo chi, gerando fita simples com gap que pode ser reconhecida pela
RecA. Ela então gera uma junção de Holliday e um gap em outra fita. (OLHAR DESENHO) RuvAB:
também catalisam troca de fitas, são como argola ao redor da fita dupla.
REPARO SUJEITO A ERRO: genes SOS umuC e umuD incorporam qualquer base com o fim de
prosseguir a replicação, resgatando a viabilidade da célula. UNIÃO DE EXTREMIDADES NÃO-
HOMÓLOGAS: se ocorre quebra nas duas fitas (morte e câncer – causado por radiação ionizante,
quimioterápicos e radicais livres). Extremidades são justapostas para recombinar, o mesmo complexo liga
as extremidades e acaba por resultar em DNA com sequência alterada. HOMÓLOGAS: muito preciso em
bactérias e leveduras, cromossomo homólogo ao lesado faz cópia da sequência perdida com quebra da
dupla fita e transfere ela para o sítio de quebra no cromossomo lesado, restaurando a seq original.
TRANSIÇÃO: purina por purina. TRANSVERSÃO: purina por pirimidina. MUTAÇÃO SINÔNIMA: códons
de um mesmo AA. SENTIDO TROCADO: introduz AA, conservada ou não, de acordo com as
similaridades dos aas. SEM SENTIDO: códon de parada. FRAMESHIFT. AGENTES MUTAGÊNICOS:
causam alterações conformacionais e químicas sobre genoma.
TRANSPOSON: tipo de transferência horizontal, causa alterações estruturais. Incidência em regiões
regulatórias são menos destrutivas, na codificante interrompe transc da ptna. RECOMBINAÇÃO SÍTIO
ESPECÍFICA: garantem mecanismo de inserção de fagos e transposons. DNA móvel, não envolve
recombinação homóloga.
DNA RECOMBINANTE: ligar 2 ou mais segmentos de DNA gerando molécula capaz de auto-replicação
no hospedeiro. DNApol usava in vitro permite amplificação do gene, sendo usadas Tb enzimas de
restrição, ligases, quinases, fosfatases que introduzem modificações sobre o DNA. Número de cópias do
plasmídeo dentro da célula depende da ori de rep.
TRANSFORMAÇÃO: introdução da quimera (plasmídeo) dentro de hospedeiro competente (E.Coli)e
verificação das colônias. Plasmídeos: é usado em insertos pequenos e que possuem pouca especificidade
para se ligarem ao vetor. Contém um ou mais genes de resistência a drogas ( selecionar as bactérias
transformadas)Tem tb um sítio de clonagem múltipla que apresenta muitos sítios-alvo de enzimas de
restrição. É neste sítio que são inseridos os fragmentos de DNA. Alguns tem o gene Lac Z (enzima b –
galactosidase - facilita a seleção das bactérias transformadas). O gene Lac Z está em contiguidade com o
sítio de múltipla clonagem. Quando no plasmídeo é inserido um fragmento de DNA, esse gene é
interrompido e não há produção da b -galactosidase. Essa enzima age sobre um substrato incolor
chamado X-gal que é adicionado ao meio convertendo-o em um corante azul. A colônia que apresenta o
plasmídeo sem o gene Lac Z interrompido fica azul (do contrário fica branca). Fagos: Para clonar
fragmentos muito grandes. Cosmídeos: Parecido com o fago, porém é mais fácil para manipular por não
possuir especificidade.
Mini-prep (TÉCNICA DE LISE ALCALINA): Centrifugação da cultura→ Ressuspensão em
tampão→adição de NAOH/SOS: lise bacteriana em pH alcalino→ neutralização do lisado (com acetato de
potássio)→ centrifugação e descarte do DNA cromossômico→ DNA plasmidial no sobrenadante (com
adição de isopropanol). DNA plasmidial fica em solução por renaturar mais fácil, o genômico ppta.
SÍTIOS MÚLTIPLOS DE CLONAGEM: vários locais únicos de clivagem para endonucleases de restrição,
os quais constituem o sítio de inserção. AUXOTRÓFICAS: dependem de nutrientes específicos.
COMPATIBILIDADE PLASMIDIAL: inserir mais de um plasmídeo com origens de replicação diferentes, a
célula não vê como material duplicado e descarta um deles. A origem deve ser compatível com a
plataforma usada. DEFOSFORILAÇÃO previne o plasmídeo de se ligar nele mesmo.
VETORES DE CLONAGEM: insertos de DNA genômico, transcrito reverso cDNA, de subclonagem ou
sintético (em geral obtidos por recombinação homóloga). ATIVIDADE NÃO ESPECÍFICA: pode ocorrer

3. por erro de tamponamento ou no método de incubação. Solventes orgânicos podem ser usados para
terminar reação.
LIGANTES/ADAPTADORES: transformam extremidades abruptas em coesivas.
TRANSFERÊNCIA WESTERN: Nesta técnica, submete-se a amostra à eletroforese em um gel de SDS
poliacrilamida. Após separadas no gel as proteínas são transferidas por contato ou por um campo elétrico
para a superfície de uma lâmina de polímero. Adiciona-se um anticorpo específico para a proteína de
interesse. Adiciona-se um segundo anticorpo marcado radiativamente específico para o primeiro. Um auto-
radiograma revela uma faixa escura onde está a proteína de interesse. Como alternativa, o segundo
anticorpo pode conter uma enzima que gera um produto corado.
ENZIMAS DE RESTRIÇÃO TIPO 2: sequências de reconhecimento são, em geral, constituídas por quatro
a seis pares de nucleótidos, e palindrómicas. Clivagem ocorre dentro ou próxima. Bactérias que produzem
endonucleases de restrição também contêm as enzimas de modificação correspondentes que metilam
bases no local de reconhecimento das endonucleases.
MODIFICAÇÃO DAS EXTREMIDADES DO DNA: por preenchimento parcial das extremidades 3’
recuadas, por preenchimento total, por remoção das 3’ projetadas (polimerase de DNA do fago T4,
polimerase Klenow, nuclease S1 e mung bean) – extremidades coesivas são convertidas em cegas.
Adição de linkers – cegas em coesivas, p minúsculo na frente. Adição de adaptadores – coesivas em
coesivas diferentes. Cauda de homopolímeros – cegas em coesivas pela transferase terminal.
DESFOSFORILAÇÃO: Remoção dos grupos 5’P das extremidades do DNA pela fosfatase alcalina para
impedir a recircularização do vector (aumenta a eficiência de clonagem) ou a ligação intermolecular do
DNA dador, em particular, a ligação de fragmentos de DNA de regiões genómicas diferentes. Tratamento
com fosfatases diminuem o backgound.
ISOLAMENTO DE RNAm: A cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT éutilizada no isolamento de
mRNA eucariótico. O RNA citoplásmico éconstituído fundamentalmente por RNAs ribossómicos (rRNAs) e
RNAs de transferência (tRNAs). Os RNAs mensageiros (mRNAs), são muito menos abundantes, mas têm
caudas poli-A que hibridam com oligo-dTs covalentemente ligados àmatriz da coluna. Após hibridação, os
rRNAs e tRNAs são removidos da coluna por lavagem, sendoos mRNAs depois eluídos com um tampão
de baixa concentração salina. A preparação de mRNA purificado resultante contém muitas moléculas de
mRNA diferentes que codificam diferentes proteínas.
ETAPAS DA CLONAGEM: preparação/escolha do vetor > ligação do vetor e incerto > transformação no
hospedeiro > seleção de clones (a partir do fenótipo observado na célula – por isso é importante usar um
gene repórter na cepa).
PREPARAÇÃO: digestão do plasmídeo, dirigida com 2 enzimas de restrição, não dirigida com 1. Klenow
ou T4-DNApol preenche extremidades 5’ proeminentes resultado da digestão. Linkers podem ser
adicionados nas extremidades com o sítio de restrição desejado. Purificação do vetor pode ser feita por
ELETROFORESE. O controle é feito com os plasmídeos(taxa de realização) e os incertos
puros(contaminação).
Taq polimerase: coloca A amais que pode ser usado a favor. Apresenta resistência a temperatura e é
usada no PCR.
PCR: o controle da temperatura permite que o primer anele no lugar correto. Para replicar fragmento
compreendido entre dois primers, alvo inicial é o RNAm, primers de múltiplas timinas anelam na cauda
poli-A que só existe nos RNA processados, por transcriptase reversa se faz o cDNA. cDNA é denaturado
(96°C) para primers anelarem e haver ampliação. Ciclos consecutivos vão fornecer fragmento amplificado
com enriquecimento de determinadas sequências.

4. Os clones genómicos podem ser obtidos por PCR a partir de DNA cromossómico extraído das células.
São adicionados primers que ladeiam a região de DNA que se pretende clonar, sendo amplificado apenas
o DNA entre os primers(incluindo os primers). Esta técnica permite obter selectivamente uma curta
extensão de DNA cromossómico.
Os clones de cDNA podem ser obtidos por RT-PCR a partir de mRNA extraído das células, e purificado
por cromatografia de afinidade em coluna oligo-dT. O primeiro primer (oligo-dT) é depois adicionado à
população de mRNAs, sendo utilizada a transcritase reversa para produzir a cadeia de cDNA
complementar. Pode ser em tempo real ou não, permitindo monitoramento da progessão, permite ver a
partir de qual ciclo há p sinal de interesse, por fluorescência.
CURVA DE DISSOCIAÇÃO: garante se não ocorreram reações secundárias e não há sequências
inespecíficas amplificadas. Há picos de fluorescência quando o fluoróforo for liberado pela temperatura. A
polimerase passa em cima da sonda liberando ela, oq dá a fluorescência.
KNOCKOUT: Deleção de um gene específico (ou uma família de genes) de um genoma funcional. Pode-
se inviabilizar a proteína do produto, deletar determinada região, marcar ponto de deleção com K7 para
saber que ocorreu, é grande, então tem q ver viabilidade.
ANTI-SENSE: Função: modular a expressão gênica por hibridização seletiva a seqüência complementar
do mRNA ou pre-mRNA alvo. Habilidade de atingir a expressão de genes específicos;Pode ser usado para
modificar a forma de splicing. Inibição ou impedimento do transporte, splicing, 5´capping, 3
´polyadenylatione tradução do RNA pela inibição da interação do RNA com outras moléculas como
proteínas e outros ácidos nucléicos. Inibir a ligação do ribossomo (5´região); bloquear a tradução (região
codificante) ou Inibir o splicing (sítio splicing).
ANTI-GENE: Sob certas circunstâncias o DNA pode adotar uma conformação de TRIPLA HÉLICE, que
pode ser inter ou intramolecular. Tripla hélice intermolecular são formadas pela adição de uma terceira fita
seqüência específica ao sulco maior da dupla hélice de DNA. São moléculas de polipurinas ou
polipirimidinas que se unem a fita rica em purina do alvo. São ligantes específicos para dupla fita de DNA.
Na região PROMOTORA causa competição com fatores de transcrição, impedindo estericamente. No
interior da região a ser transcrita provoca bloqueio.
IRNA DE INTERFERÊNCIA: Mutagênese direcionada baseada na observação de que em muitos sistemas
a expressão de um RNA dupla fita causa a degradação do mRNA correspondente. Fácil síntese e
manipulação. Simples aplicação. Resistente à ação de nucleases.Baixo custo. Resposta rápida. Permite
estudar ação de genes em organismos de difícil manipulação em laboratório. Necessidade de
conhecimento prévio da seqüência alvo. Optimização da aplicação e do dsRNA (fita dupla de
RNA).DICER: picota a fita de RNA, é uma RNase 3. Esses fragmentos vão se ligar a complexos protéicos
formando os RISC (ver
desenho).
VERIFICAR SE O DNA É DE
UM MESMO ORGANISMO:
fazer o sequenciamento do
genoma afim de verificar se
há compatibilidade com
organismos similares, ver se é
euca ou proca. Se não houver
similaridade no nível
genômico, ver se tem no nível
protéico.
Uma enzima de restrição
particular reconhece somente

5. uma seqüência única de bases. DNAs de origens diferentes sob a ação da mesma enzima de restrição
produzem fragmentos com o mesmo conjunto de extremidades fitas simples. Portanto, fragmentos de dois
diferentes organismos (por exemplo, bactéria e homem) podem ser ligados por renaturação das regiões de
fita simples. Se os fragmentos de DNA humano são misturados com o DNA plasmidial linearizado,
permitindo a ligação entre eles, uma molécula de DNA plasmidial contendo DNA humano pode ser gerada.
Este plasmídeo híbrido pode ser inserido numa bactéria através de transformação e então o inserto será
replicado como parte do plasmídeo.
MICROCHIPS: Os micro-chips de DNA são fabricados por máquinas robóticas com múltiplas pontas de
impressão, que liberam gotículas de solução de DNA em posições específicas numa placa de vidro, que é
do tamanho de lamínula de microscópio. A disposição de cada molécula de DNA no chip deve ser
relacionada com um gene específico. Por técnicas de hibridização, cDNA preparado de RNA-m extraído
de um determinado tecido apontará no micro-chip quais genes estão ativos e quais estão inativos nesse
tecido.
GFP: Para a localização intra-celular de uma proteína, o método mais empregado atualmente é o da
proteína de fluorescência verde, ou GFP ("green fluorescent protein"). Por esse método, uma pequena
seqüência de DNA que codifica para uma peptídeo fluorescente é ligado a uma das extremidades de um
gene alvo. O gene alvo codificará, portanto, uma proteína recombinante, ou proteína de fusão. A maior
parte dela continuará a codificar a sua seqüência nativa, mas uma pequena porção terá atividade
fluorescente e assim a proteína poderá ser detectada no interior da célula. Em que compartimento celular
seu produto gênico atua (ou seja, a proteína que ele codifica), Com quais proteínas ele interage, Quais
funções bioquímicas específicas ele coordena.