Espectrofotometria

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ESCUELA DE POST GRADO

MAESTRIA EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

FACULTAD DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

CURSO INSTRUMENTACIÓN DE ANÁLISIS DE ALIMENTOS - TEORIA

ING. ALBERTO JUAN TORRES FLORES
Ing. Santos Jaimes Serkovic

LIMA 2006


ÍNDICE
Página
ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO 3
RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLOR 4

ABSORCIÓN DE ENERGIA 5

TIPOS DE LUZ 6

LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRÍA 8

LEY DE BERNARD 9

ESPECTROFOTOMETROS 10

ESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO 11

SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS 14

RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO 15

TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS 19

ESQUEMAS DE INSTALACIÓN
a) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA 22

b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA 23

ESPECTROFOTOMETRO DE LECTURA DIRECTA 24

ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ 25

CROMATOGRAFÍA 26

CLASES DE CROMATROGRAFÍA 32

I CROMATOGRAFÍA DE PAPEL 33

II CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA 35

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA 38

3.3 TÉCNICAS DE SEPARACIÓN 40

CROMATOGRAFÍA DE GASES 41

ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA
CROMATOGRAFÍA DE GASES. 42

III SISTEMA HPLC 44

M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores Ing. Santos Jaimes Serkovic 2


ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO
REGIONES QUE LO FORMAN
RAYOS GAMMA

1 A°
Rayos "X"

10 A° Rayos X Suaves

100 A°
Vacio UV
2000 A°
Cerca de visible UV
4000 A°
0.4 u VISIBLE
8000 A° CERCA DE INFRARROJOS

0.8 u

25 u Infrarrojos

400 u Lejos del IR

25 cm Microondas

Radio Ondas

1 km



RELACIONES ENTRE LA ABSORCIÓN DE LUZ Y COLOR
REGIÓN DE LONGITUD ONDA.

mu Color
MILIMICRA Transmitido
< 380 Ultravioleta
380-435 Violeta
435-480 Azul
480-490 Azul verdoso
490-500 Verde azuloso
500-560 Verde azuloso
560-580 Verde amarillento
580-595 Amarillo
595-650 Anaranjado
650-780 Rojo
> 780 Cerca de Infrarrojo

La luz visible representa una parte muy pequeña del espectro
electromagnético.
Se extiende de 380 a 780 mu (milimitra)

La región ultravioleta se extiende de 185 m u hasta la visible.
La longitud de onda mas cortas son consideradas como la región mas lejana (o
de vacío) ultravioleta.

Unidades m u = 10-7 mm = mu
10

Aº = milimitron = 1 millón de m.
1000 (1 mil millonésimo de m)

La onda electromagnética varía entre cuatrilloncico de metro y 100, 000 km de
longitud.



ABSORCIÓN DE ENERGIA

P P

DISPERSION

b
Cuando un haz de energía choca contra una sustancia le pueden suceder
varias cosas.
- Ser absorbida
- Ser reflejada
- Ser transmitida
- Ser dispersada
- Ser refractada

La longitud del trayecto óptico es “b”

Efecto de Luz de haz sobre un objeto:

1. Puede pasar a través de la materia habiendo solo una pequeña absorción y
por lo tanto poca perdida de energía se mide % de luz transmitida.

2. La dirección de la propagación del haz puede ser alterado por :
o Reflexión
o Refacción
o Difracción
O puede haber dispersión por la presencia de alguna materia particular
suspendida.

3. La energía radiante puede ser total o parcialmente absorbida.
La absorción implica una transparencia de energía al medio y esto esta
relacionado a las características de las estructuras moleculares.

En la figura:

Po es el haz de luz incidente

Po es la energía no absorbida después de pasar por la muestra o recipiente
(energía transmitida)

Transmitancia = P = T
Po


Definición:
Viene a ser la relación entre el poder radiante transmitido por una muestra
al poder radiante incidente.

El poder radiante transmitido se puede medir usando detectores (fotoceldas,
fototubos)

Absorbancia.- Es el logaritmo a la base 10 del recipado de la transmitancia.

A = Log 10 1
T

A = Log 10 Po
P

TIPOS DE LUZ

El campo de la luz visible se extiende desde 380 a 780 m u de longitud
onda.

De acuerdo al tipo de luz se perciben los colores

1. Luz del día (luz indirecta) (fuente C)
2. Luz del Sol (fuente B)
3. Luz de lámpara de tungsteno (artificial) (fuente A)

Graficando
Se aprecia que estas fuentes aportan diferentes longitudes onda y los
colores dependen de la longitud / .

La función de la fuente de luz es de provocar la luz INCIDENTE de
suficiente intensidad para la medición.

A
IN T E N S ID A D

B
C

400 500 600 700

V IO L E T A N A R A N JA
V ER D E R O JO
M. Sc. Ing. Alberto Juan Torres Flores L
A ZU A M A R IL L O Ing. Santos Jaimes Serkovic 6


La fuente de luz mas usada es la lámpara de tungsteno.

El inconveniente es de que emite su principal porción de energía en la región
cercana al infrarrojo del espectro solo el 15% cae dentro del espectro de luz
visible.

Temperatura operacional 2854º K.

Se tiene espectroplometros de absorción UV – visible emplean 2 tipos de
lámparas, las halógenas y de dentrecio las halógenas cubren el espectro de luz
visible, las de denterio se emplea para medidas en la zona del ultravioleta.

Las lámparas no emiten luz monocromática, es decir radiación de una longitud
onda única ya que la luz es policromática, se debe seleccionar la longitud onda
en que interese trabajar el monocromador permite obtener una luz
monocromática.

Un cuerpo es incoloro cuando transmite pero no refleja (no refleja ni absorbe
Ejemplo Agua)

Un objeto negro absorbe todos los tipos de radiación

Un objeto blanco refleja todos las longitudes onda visible.

Cuando observamos una manzana, esta absorbe de determinadas longitudes
onda y refleja las ondas mas grandes o sea del color rojo.

La onda reflejada es la que el ojo humano capta.

R E F L E JA D A

M A Z
A B S O R B ID A

Se debe tomar en cuenta:



1. La composición de la fuente luminosa
2. Características físicas y químicas del objeto
3. sensibilidad del ojo.

LEYES FUNDAMENTALES DE LA FOTOMETRIA

2 LEYES
1. La Ley de Bourguer o de Lambert (1760)
2. La Ley de BERNARD (1852)

1. LEY DE BOURGUER
Establece que cuando un haz de luz monocromático previamente dispuesto
en paralelo entra a un medio absorbente la velocidad de disminución de su
poder radiante con respecto a la longitud de trayecto de luz a través de un
medio absorbente b, es proporcional al poder radiante del haz.
Esta proporción es geométrica.

b

P A B P

(1/4)
(½ ) (½ )
La capa absorbe la 1 de la luz = H
2 2

Capa B absorbe la 1 con la 1 precedente = H
2 2 4

luego (derivada parcial)

P P b
P
Integrando y usando logaritmos de base 10 y haciendo

P = P0 cuando b = 0

Se obtiene :
P
2 . 3 0 3 lo g kb
P



Esto quiere decir que el poder radiante de una luz no absorbida decrece
espontáneamente, conforme al espesor del medio absorbente aumente
aritméticamente.

2. LEY DE BERNARD.-
Establecer que el poder radiante de un haz de una radiación monocromática
paralela decrece en una forma similar a como aumenta la concentración del
constituyente absorbente de la luz.

2.303 Log. Po = K’C
P

C = Concentración

Nota.- Esta ley deja de ser lineal a altas concentraciones, por lo que hay que
diluir instrumentos colorimétricos comerciales.

Los instrumentos para fotometría de absorción se clasifica en :

a. COMPARADORES VISUALES.-

Usan como fuente de luz, la luz del día y pasa a través de un par de tubos
conteniendo la muestra y el standard.

Se diluye la muestra hasta llegar al color del estándar y se ve la concentración.

Se usa los tubos de NESSIER (50 a 100 ml capa)

Otro método es hacer girar un disco con colores hasta igualar al de la muestra.

B. FOTÓMETRO DE FILTRO
Colorímetro fotoeléctrico

MUESTRA
DETECTOR

FILTRO

REOSTATO AL
GALVANOMETRO

LAMPARA

FOTÓMETROS DE FILTRO (Fig. N°01)

ESPECTROFOTOMETROS



INTRODUCCIÓN

Cada sustancia absorbe energía radiante de una determinada longitud de onda
y esto es una característica de todas las sustancias.

Si la luz blanca atraviesa una solución que tiene un compuesto colorado,
ciertas longitudes de onda serán absorbidas y otras serán transmitidas, de esta
interacción nace el color.

ESPECTROMETRÍA, etimológicamente es la medida de la absorción o
transición de la luz.

Cada sustancia (líquido) absorbe o transmite la luz de forma característica
generando una curva o espectro espacial que depende de la diferente
intensidad con que absorbe la luz a diferentes longitudes de onda.

Esto quiere decir que cada sustancia de un espectro definido de absorción con
la luz sea ultravioleta, visible o infrarrojo y gracias a este espectro específico
puede ser identificada.

Viene a ser una herramienta especial de ayuda a la bioquímica ya que
empleando muestra a concentraciones pequeñísimas (trazas) se puede
fácilmente hacer análisis cuantitativo de sus constituyentes que se hallan en la
muestra.

Permite también no solo identificar una sustancia y su concentración, sino
también su estructura y configuración molecular atómica y nuclear
(espectrómetros magnéticos de observancia nuclear, espectrómetrica infrarrojo
inorgánico, etc). Sistema HPLC bucrotografía de grases).

En 1941 se usó el primer espectrofotometro del ultravioleta fue un modelo DU-
BECKMANN.



ESQUEMA SIMPLE DE UN ESPECTROFOTOMETRO

L E N T E C O L IM A D O R
REGISTRADOR

FU E N T E
L U M IN O S A

D IS F R A C T O R DETECTOR
(P R IS M A ) C U B ETA A B SO R B ID A
(FOTOCÉLULA) )
(F O T O C E D U L A
(M U E S T R A D E
D IS O L U C IO N )

SE L EC T O R D E
(R E N D I J A )

M O N O C R O M A D O R

En la figura se tiene un fotómetro de filtro de lectura directa y de luz simple.

Usa un filtro de absorción o interpretación y solo deja pasar la Longitud onda
deseada, para el estudio de su margen varia de 20 a 30m u.

La luz que ha atravesado la muestra se mide como procedimiento por deflexión
en un galvanómetro.

La escala del medidor esta en mitades de transmitancia 0 – 100%.

ESPECTROFOTOMETROS

COMPONENETES ESENCIALES DE UN ESPECTROFOTOMETRO .-

1. LÁMPARA

Es la fuente de luz de alta intensidad para efectuar la medición.
En los espectrofotometros de absorción UV – visible se utilizará dos tipos de
lámpara: halógenas y deuterio.

El 1º abarca la zona de luz visible 250 – 350 m u. la de deuterio de emplea
para mediciones de la luz ultravioleta.

Rayo efectivo 200 – 375 m u



Si se desea altos niveles de iluminación se empleará lámparas de XENON o
vapor de Hg.

Debido al intenso calor que producen deben ser aislados terminantemente
para no afectar la muestra Temp. de operación 6000º k

2. MEDIOS DE DISPERSIÓN

Cuando se restringe las longitudes de onda del espectro y se deja pasar
solo lo que absorbe el material a medirse, se incrementa notablemente la
posibilidad de medición del instrumento.

Para ello se utiliza los filtros.

- FILTROS

La selección apropiada de un filtro es de acuerdo a su pico de transmitancia
y el ancho de banda de longitud de onda.

El pico debe de ser el más alto posible y el ancho de la banda que cubre el
mas angosto posible.
100%
Se tiene:
Filtros de gelatina TRANSMITANCIA
Filtros líquidos
Filtros de vidrio coloreados

(Absorbe longitud
onda no deseada)
λmu

Debido a que la fuente de luz es de alta temperatura el uso de filtro de
gelatina se ha descartado.

Clases de filtro:

a) Filtro de vidrio teñido
Son mejores que los de gelatina, alcanzan un ancho de banda de 35 –
50 m u y pico de trasnmitancia de solo 5-20% (bajo) su trabajo es
absorber la longitud onda no deseada.

b) Filtro de Interferencia
Se consigue anchos de banda mas estrechos.
Consiste en una capa dieléctrica de bajo índice de refracción y
transparente entre 2 capas de películas de plata semitransparentes.

La luz incidente ingresa, se refleja de regreso y vuelve entre las
películas.



Cuando la frecuencia guarda armonía cuando con T pasa la luz.

Ancho banda 10 – 17 m u

Pico de transmitancia 40 – 60%

c) FILTROS DE MULTICAPAS DE INTERFERENCIA

Consta de 5 a 25 capas de lato y bajo índice de refracción dieléctrica
obtenidas.

Ancho de banda de solo 8 m u

Pico de transmitancia 60 – 95%

Luz blanca

Película
metal

Placa vidrio

Son los filtros mas eficientes y remueve la radiación no deseada por
transmisión y reflexión en vez de absorción como las otras.

3. CELIMADOR
Viene a ser un lente que convierte la radiación en la luz lo mas paralelo
posible y lo enfoca en el monocromador.

4. MONOCROMADOR
Las lámparas no emiten luz monocromática, o sea radiación de una única
longitud onda.

Por lo tanto es necesario descomponer la luz policromática y seleccionar la
longitud onda que interese utilizar.

Esto se logra aplicando un MONOCROMADOR y hay de 2 tipos.

1. Prisma de refracción:
Usa un prisma en donde el rayo luminoso que incide sobre el prisma
sufre 2 sucesivas refracciones sobre c/u de sus caras.
La luz se descompone en sus diferentes longitudes de onda.

Para descomponer la luz visible los prismas de vidrio.



Los prismas de cuarzo o sílice fundido se aplican para la luz U.V.

Mediante una bacteria de giro se puede seleccionar la longitud de onda
deseada.

mu
800

Luz blanca 700
β
600

500

400
Rendija
Prisma β = < apical

SISTEMA DE MONTAJE EMPLEANDO PRISMAS

1.1 MONTAJE TIPO CORNO

Fuente luz Roa

Lente Prisma
Convergente Rendija

Lente
colimación Violeta

1.2 USO ESPEJO DE LITTROW ESPECTRO

i = < de incidencia < Apical = 30°

Rayo Incidente i 90° Superficie de Aluminio

Rojo r refacción

Azul
t = base del prisma

5.- RED DE DEFRACCIÓN O EMPARALLADO.



La dispersión de la luz también puede ser obtenida por medio de una
superficie estirada o escalonada.
Consiste en un gran numero de estrías paralelas dispuestas en forma
escalonada (15000 a 30000 por pulgada) en una superficie de aluminio
altamente pálida.

Se prepara con resina epoxica y aluminio.

R 2
R 2

β
i

β

θ

d
Esquema de acción de los rayos

i) = < incidencia

β) = < reflexión

θ) = < de escalón

d) = Constante del calor o paso

R1 y R2 son 2 rayos de luz que forman el haz luminoso.

Cuando el rayo luminoso incide sobre la superficie escalonada se observa
que el rayo R2 debe ocupar mayor long. que R1 (distancia d sen i)

d

i

En cambio a la salida R 1 debe ocupar mayor distancia que R 2 para una igual
longitud d sen β

Cuando los rayos están en pase actúan y se combinan en forma
constructiva



o sea m / = d (Sen i ± Sen θ) = O
donde m = orden de interferencia
Si la diferencia d Sen i – d Sen θ es igual a un múltiplo de m u los rayos
están en pase.

Este sistema escalonado en conjunto actúa como un espejo plano (cero
orden de interferencia).

Modificado el < θ pueden ser aplicados para una determinada longitud
onda.

Tienen mayor poder de resolución que los prismas y pueden ser usados en
todas las regiones del espectro.

Su poder de resolución esta dado por R = M x N

M = N° unidades de onda
N = N° total de escalona por unidad de longitud.

Ejemplo: Un emparedado graduado a 6000 líneas/mm y 15 mm ancho tiene el
siguiente poder de relación

R = M x N = 15 cm x 6000 líneas = 9000
Línea cm

En la región del verde / = 5400 Å

Luego el intervalo de longitud onda mas pequeña (que se puede aplicar es:

R = / = 90000
δ/

δ / = 5 400 = 0.06 Å
90000

Un prisma de vidrio para tener este poder de resolución debería de ser muy
grande (base de 75cm No practico).

Antiguamente la mayoría de los monocromadores eran prismas

Actualmente casi todas las redes de reflexión son de emparrillado o
gratings.

Ventajas: Son mas baratas de fabrica
Se obtiene mayor separación de longitudes de onda
Dispersan la radiación en forma lineal

6. RENDIJAS



Como su nombre lo dice se refiere en una pequeña abertura que restringe
al haz de luz.
Cumple doble función:
a) Contribuye a que el haz de luz no diverja y se concentra sobre la
muestra.
b) Selecciona una longitud onda de trabajo.

El monocromador descompone la radiación policromática en un continuo de
ondas monocromáticas, y la rendija contribuye a que sobre la muestra
iniciada solo un pequeño intervalo de frecuencias, lo que varia
determinados por la ANCHURA DE LA RENDIJA.

7. RECIPIENTE PARA LA MUESTRA.-

Se utilizan cubetas de vidrio y para la región del U.V. el de cristal de cuarzo
(Ojo: el vidrio absorbe la radiación U.V.).

Pueden ser de forma rectangular o cilíndrica

Vienen en tamaño: NORMAL
SEMI MICRO
MICRO de acuerdo al volumen del micro

Se tiene también las CUBETAS DE FLUJO CONTINUO, técnica critica de
entrada y de salida, permiten el paso continuado de la disolución, mientras
hace la medida.

8. DETECTOR

El rayo transmitido incide en un fototubo. Es un tubo al vacío con 2
electrodos.

La superficie del electrodo negativo es fotosensible por la diferencia de
potencial, los electrones se aceleran llegan al electrodo positivo y se
establece una corriente en el circuito.

El N° de electrones emitidos por unidad de tiempo dependen de la energía
radiante.

Son de mayor eficiencia los tubos fotomultiplicadores.

9. AMPLIFICADOR Y LECTURA

No se dará las características electrónicas de esta etapa de amplificación.

Opera como un medidor o instrumento de lectura.



Los primeros detectores son el ojo humano y las películas fotográficas,
consisten en transductores que convierten la energía radiante de una señal
eléctrica.

La señal eléctrica de respuesta del detector es directamente proporcional a
la potencia radiante P.

Se tienen los detectores de fotones, se les llama detectores fotoeléctricos y
los detectores calóricos (trabajan por el calor).

Como Ej. Del Detector de Fotones se tiene la célula fotoeléctrica tipo capa –
barrera.

Consiste en un plato Fe(+) sobre el cual esta apoyado en peniconductor
(Selenio) y sobre el una capa fría semi transparente de plata (signo)

La energía radiante sobre el semiconductor, excita los electrones en la
interfase plata – selenio los cuales son liberados y pasan al electrodo
colector (-).

Se genera una pequeña fuerza electromotriz la que puede ser registrada en
su galvanómetro.

La muestra esta en solución (líquida).

Los cubitos de vidrio se emplean en la región de la luz visible las
direcciones para la región ultravioleta, las de sal depondrá en la región del
infrarrojo.



TIPOS DE ESPECTROFOTOMETROS

• ESPECTROFOTOMETROS UV - VISIBLE
• ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA
• ESPECTROFOTOMETRO INFRAROJO POR TRANSFORMADA DE
FOURIA.
• ESPECTROFOTOMETRO DE FLUORESCENCIA

ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA (1957 EN AUSTRALIA)

Su funcionamiento al principio es semejante al espectrofotómetro de absorción
de sustancia en disolución, excepto que la muestra a analizarse debe ser
volatilizada por una llama.

Se relaciona mucho su función con el de los FOTOMETROS DE LLAMA, pero
hay diferencias sustanciales.

Se explica a continuación:

Se suministra una llama de temperatura regulada para volatilizar la
muestra, de acuerdo a la mezcla y combustible que se emplea (gas
aluminizado, propano, butano, cuetileno).



Se consiguen temperaturas desde 1700 a 4550 ºC. La mezcla se posee
generalmente en líquida mediante un atomizador en cantidad medida y
constante.

La función del sistema óptico, es reunir la luz de la parte mas intensa de
la llama (se ayuda con el espejo cóncavo). Se selecciona una
determinada longitud, vida y se mide la intensidad de los átomos
ACTIVADOS (ionizados).

b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATOMICA.
A diferencia del anterior mide la absorción por medio de los átomos
vaporizados NO IONIZADOS de parte la luz emitida por una lámpara
catódica hueca.

En la sustancia vaporizada se encuentran ionizados sólo una pequeña
fracción de los átomos. La mayor parte son los NO IONIZADOS, sobre
estos efectúa la medición el instrumento, resultando por consiguiente
mucho mas sensible que la FOTOMETRIA DE LLAMA.

Tiene asimismo ventajas que se reconocen lo siguiente:

b.1 Su costo es relativamente bajo comparado a otros tipos de
espectrofotómetros. Su costo es algo superior al de fotómetro de
llama, que es un instrumento simple.
b.2 Las lecturas instrumentales son directamente proporcionales a la
concentración.
b.3 Analiza separadamente mediante su lámpara cataliza empiece un
elemento, identificándolo y cuantificándolo.
b.4 Es apreciable su análisis de productos alimenticios para la
determinación de trazas de ciertos alimentos metálicos.

Nota: Estos instrumentos determinan la presencia de elementos metálicos,
pero no como se encuentran combinados en la muestra.

Principio de funcionamiento.

El método se basa en la medición de la luz absorbida a longitud onda de una
línea de resonancia dada por los átomos NO IONIZADOS o oxidados de una
sustancia.

A la temperatura normal de una llama de O 2 – acetileno y a la temperatura de 2
800º K solamente una fracción muy pequeña de todos los átomos es excitada
(ionizada).

El 99% permanece no excitada.
Se logra medir el nivel de concentración de los átomos de la llama.
El instrumento puede ser de simple haz o de doble haz luminoso.
Ejemplo: El espectrofotómetro de absorción atómica.
PERKIN – ELMER Modelo 303 de doble haz luminoso.



FUNDAMENTOS.
La espectrofotometría de absorción atómica se funda en el principio de
KIRCHOFF, de absorción por resonancia, según el cual los átomos absorben
radiaciones de la misma longitud de onda que puedan emitir.

En la absorción atómica se usan una fuente independiente de luz
monocromática, específica para cada elemento a analizar y que se hace pasar
a través de vapor de átomos midiéndose posteriormente la radiación absorbida.
Se usa la alta temperatura de la llama como fuente de excitación en donde los
espectros son sencillos y los resultados cuantitativos que se obtienen pueden
ser reproducibles.
Los espectros son sensibles por que el nivel de excitación (ionización) es bajo
al emplearse un nivel bajo de energía de la llama.
Esto da por ventaja que no hay interferencia de otras bondades de mayor nivel
de energía.

El nivel bajo de la llama no es problema ya que su función es solamente
atomizar la muestra y formar un vapor de átomos sin excitar.
Por ello se puede aplicar a mayor número de elementos que la FOTOMETRÌA.

La lámpara catódica actúa como fuente de radiación



ESQUEMA DE INSTALACIÓN

a) ESPECTROFOTOMETRO DE EMISIÓN DE LLAMA. (FOTOMETRO
DE LLAMA).



b) ESPECTROFOTOMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA
Se tiene en la figura 2 esquemas (a) y (b)
Dada la estrecha relación entre ambos es necesario una comparación.
La sensibilidad del espectrotol - de absorción atómica es del 99% y
corresponde al número de átomos no excitados.

Ambos métodos son complementarios.

En el gráfico (b) se ha señalado una fuente de radiación.
Esto elimina la señal de fotometría de llama y recoge solamente la de
absorción, la que se modifica con su cátodo hueco (Chopple).

Funciones de la Ciama.
1. Grafica la muestra que ingresa al estado líquido
2. Descompone los compuestos moleculares del elemento a analizar
las moléculas señaladas o átomo individuales.
3. Ioniza o excita estos átomos o moléculas.

Espectrofotómetros de HAZ SIMPLE
DE DOBLE HAZ
DE DIODOS
DE DOBLE LONG. ONDA Mod. PERKIN-ELMER



ESPECTRO FOTÓMETRO DE LECTURA DIRECTA

APLICACIONES.

A. ESPECTROFOTOMÉTRO DE LUZ VISIBLE.

• Análisis cuantitativo. Determinación de cantidades inferiores al
1% de cationes, de grupos funcionales.
• Estudios de equilibrios, determinación de formulas complejas y de
caracteres de equilibrio.
• Estudios cinéticos
• Otros: Determinación del almidón, azúcares reactores, proteínas,
V, T, C, en alimentos.

B. DE ULTRAVIOLETA.

• Determinación desustancias orgánicas (hidrocarburos, vitaminas,
esteroides, etc). Proteínas (Biuret), ácidos nucleicos. Separación
analítica son frecuentemente necesarios antes de la medida
espectrofotométrica.
• Identificación de moléculas orgánicas aromáticas como los
aminoácidos (tirosina, fenilolanina)
• Algunas sustancias inorgánicas así como el plomo en huesos,
fluor en mezclas de fluor y oxigeno, etc.



• Amplia apliación en el campo de la medicina, metabolitos de la
sangre, tejidos, caña, etc.

ESPECTROFOTOMETRO DE DOBLE HAZ



Smith y J Feinbug. Cromatografía sobre papel y capa fina.
Dana Abbott. Introducción a la cromatografía

CROMATOGRAFÍA

En 1906 el biólogo ruso TSWETT utilizó una columna de vidrio en forma de
tubo relleno con sulfato de Ca, ese polar y con una valirida de salida en la parte
superior.
Usó como muestra una mezcla de pigmentos de plantas y por la parte superior
iba agregando eter de petróleo.
Observó la aparición de una serie de bandas horizontales de distintos colores
que corresponden a los componentes de los pigmentos.
A partir de esto se usó el termino CROMATROGRAFÍA.

Esta separación no tiene que ver nada con el calor de los compuestos sino con
la diferente afinidad de ADSORCIÓN de los pigmentos hacia el material base y
ESO.

CASO:
Los de MENOR GRADO DE ADSORCIÓN avanzan mas rápido a lo largo de la
columna.
En 1 944 GORDON Y MARTÍN describieron los cromatógrafos de papel, se
tiene:
• De columna abierta (papel extendido)
• De capa fina (se tiene un soporte de placa de vidrio)

En 1952 se descubrió la cromatografía de gases.
Un gas reemplaza al disolvente líquido, por lo que la separación se realiza en
una columna cerrada.
En química y Biología es frecuente separar, aislar, purificar e identificar los
componentes de mezclas complejas. Ejemplo: Los amino ácidos de una
pectina.
Dado que algunos a. a. son muy parecidos entre sí, es muy difícil la separación
por cristalización fraccionada o métodos químicos por lo que se usa la
CROMATOGRAFÍA.

CROMATOGRAFÍA.
Definición. Es una técnica de separación de una mezcla de solutos, basándose
en la diferencia de velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a
través de un medio poroso, arrastrándose por un disolvente en movimiento.

La cromatografía hizo posible el análisis químico de materias orgánicas,
complejas que por otros métodos era casi imposible.

La cromatografía en papel liso posible la separación e identificación de
cantidades de un soluto del orden de 0.1 u g. (un microgramo es la millonésima
parte del gramo), lo normal es de 1 a 50 u g.



CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
Es la técnica de separación e identificación de sustancias químicas mediante
un disolvente que se mueve sobre hojas o tiras de papel filtro.



Técnica:
a) Cromatografía ascendente
b) Cromatografía descendente
c) Separación sencilla
Cromatografía unidimensional
X Origen
SF Creato del disolvente.
Línea que alcanza al final del proceso.

Se tiene una tira de papel filtro
En el origen se deposita una gota de la
Solución a separar de deja secar la gota
Queda una mancha el extremo próximo de la
Mancha en el papel se introduce en un disolvente
(Sin tocar a la mancha) Ej. (a)
Por capilaridad el disolvente va subiendo a través del papel al avanzar
disuelve y arrastra las sustancias de la mancha que por lo general se
mueve a distinta velocidad se deja actuar por un tiempo determinado se
seca el papel.
Se observan las sustancias separadas que tienen color.
A esta técnica se le llama cromatografía MONODIMENSIONAL.



CLASE INSTRUMENTAL DE ANALISIS DE ALIMENTOS – TEORÍA
16/05/06

Pregunta

¿Por qué habiendo partido las sustancias desde un mismo punto aparecen
como manchas separadas y con distancias recorridas diferentes?

Explicación.

Cuando el disolvente se mueve sobre la mancha de las sustancias actúan 2
tipos de fuerzas opuestas:

a) Fuerzas propulsoras
b) Fuerzas retardantes

a) Fuerzas propulsoras, actúan apartando las sustancias de su punto de
origen y desplazándolas en la dirección del flujo de disolvente.

Se tiene 2 fuerzas:
a.1 El flujo del disolvente.
Cuando fluye el disolvente arrastra con él todas las materias disueltas,
sino fuera por las fuerzas de retardo se podría lograr que el disolvente y
se una con él (esto cuando es soluble).
Si fuera insoluble se quedaría en el origen.
Ejemplo: azúcar y acetato de etilo.

a). Solubilidad
Viene a ser una fuerza diferencial ya que no todas las sustancias tienen
la misma solubilidad de cualquier disolvente.

En igualdad de condiciones cuanto mas soluble sea una sustancia con
mayor rapidez se moverá a lo largo del papel y por lo tanto se alejarían
mas de los menos solubles.



Se elige disolventes en base a conseguir los mejores efectos
diferenciadas en la solubilidad de las sustancias a separar.
Como ningún disolvente puede producir las diferencias mismas de
solubilidad, se acude al uso de 2 disolventes con diferentes propiedades.
El segundo se emplea al girar 90° el papel y se tiene la cromatografía
BIDIMENSIONAL.

b). Fuerzas retardantes. Son fuerzas que trata de impedir el movimiento de
las sustancias.
Se tiene:
b.1Adsorción.
Ejemplo: Una esferita de vidrio sobre una superficie abierta con melaza.
Retarda su avance, se tiene que se cubre con polvo adsorve muchos
gases. La celulosa también tiene propiedades adsorventes.
La adsorción es una propiedad reversible y la celulosa irá frenando
gradualmente la mayor parte de sustancias del disolvente a medida que
esta caída sobre la marcha.
La adsorción también es una fuerza diferencial, ya que hay sustancias
que son adsorvidas con mas fuerza que otros. La mas fuertemente
adsorvidas se irán quedando atrás.
b.2 Reparto
En y sobre el papel filtros de apariencia seca (6-12% humedad).

Definición
Adsorción: Adherencia a la superficie.
Absorción: Introducción de una sustancia en el cuerpo de otra.

Ejemplo: agua en esponja.
Se tiene el carácter del disolvente circulando por el papel filtro y la
celulosa contenida en el mismo papel filtro.
Si una sustancia es soluble a dos disolventes no mezclables y es
expuesto a ambos, se repartirá entre ellos.
La cantidad de sustancia que se cuente en cada disolvente dependerá
de la relativa solubilidad del soluto.



El grado de reparto una vez conseguido el equilibrio se le conoce como
coeficiente de reparto o razón de distribución.
El agua que forma parte del papel filtro esta firmemente adherido en las
fibras de la celulosa, el cual esta formado por un mismo es sustancia de
celdillas microscópicas.
El agua se halla estacionaria en estas celdillas y cada una puede ser
considerada como un diminuto “tubo”.
El disolvente avanza sobre estos “tubos”, recoge por reparto parte de la
sustancia disuelta en el agua del tubo y va depositando parte de ella y
por reparto en los siguientes tubos.
A medida que avanza el proceso se repite una y otra vez.
Como el soluto recogido por el disolvente en movimiento va siendo
disuelto continuamente al papel, se tiene que retardará su avance.
Este retardo esta en relación con el coeficiente de reparto de cada
soluto.
La constante R, esta dado por el movimiento relativo de una sustancia
con respecto al disolvente.

Distancia recorrida por la sustancia
R = ___________________________________
Distancia recorrida por el disolvente

Como en algunos casos al frente del disolvente sale fuera del papel es
mas conveniente emplear el movimiento de la sustancia con respecto a
un estándar (similar químicamente).

Distancia recorrida por la sustancia
Rx = ___________________________________
Distancia recorrida por el estándar X



En la cromatrografía de reparto, separación de una mezcla entre la fase móvil
(disolvente) y la estacionaria (soporte), la celulosa y la del gel de sílice, actúan
como soporte del agua.

La celulosa es un polímero de glucosa, posee una gran cantidad de grupos:
hidróxido (-OH) y una microestructura muy complicada (2 clases: fibrosa y
microgranular).

Cuando se desea que no haya fenómeno de adsorción se emplea la celulosa
para la separación de las sustancias solubles de agua.



CLASES DE COMATROGRAFÍA.

1. Cromatrografía líquida – Liquido
Usa de base celulosa o gel de sílice en forma de tira de papel, capa fría o
columna.

2. Cromatrografía de gas – Liquido.
Si dispone un líquido sobre un sólido y hay flujo de gas en sistema.

3. Cromatrografía de filtración sobre el gel.
Ejemplo. Dextramo que usados en aleiado contenido de grupos de
hidróxido tiene mucha afinidad con el agua, por lo que se hincha en su
contacto, formando un gel semitransparente.
La sustancia de tamaño molecular menor. Se le usa en la determinación de
pesos moleculares.

4. Cromatrografía de adsorción. Se usa la diferencia de comportamiento
en la adsorción, deserción de sustancias contenidas en un disolvente
móvil sobre un sólido estacionario, para la separación de los
componentes de una mezcla.
5. Cromatografía gas – sólido.
El disolvente es un gas.

6. Cromatografía de intercambio ionico. Se emplea materiales
especiales de estructura, pesos e insolubles. Estos contienen: grupos
reactivos que están asociados a iones.
Se emplea en la separación de sustancias ionicas orgánicas o inorgánicas.
Se usa resinas, geles y celulosas de intercambio iónico.



I. CROMATOGRAFÍA DE PAPEL
Emplea tiras u hojas de papel WHATMAN N° 1 ó N° 3.

OPERACIÓN.

1.1 Preparación de muestras.
Las muestras se aplican sobre el papel en forma de solución. Para ello los
sólidos han sido disueltos en una pequeña cantidad de disolvente
adecuado.
Las sustancias puras se aplican directamente.
En los tejidos biológicos es necesario hacer una purificación preliminar
debido al nivel de componentes; proteínas o sales e impurezas.

Las sustancias no deseadas se pueden superar por varios métodos.
Ejemplo: Los lípidos en los disolventes orgánicos.
Las proteínas con alcohol.
Las sales con reseñas de intercambio iónico o por electrolesis.
Al final se tiene muestras con tipos de moléculas mas homogéneas.

1.2 Aplicación de muestras sobre el papel
Se traza con un lápiz una línea paralela al lado por donde se va
comenzar.
Se marca con pequeñas cruces a distancias iguales los lugares donde
se va aplicar las muestras.
Se identifica cada uno (A, B, C, D).
Se aplica las muestras con un tubo capilar o un hito de platino.
Las manchas tendrán un Ø máximo de 5 mm.
Sacar la mancha después de cada aplicación.

1.3 Elección del disolvente.
Será de acuerdo a la sustancia que se ha desaparecer.
Se usa mucho el n-butanol.



Si se agrega el disolvente ácido acético y formic, piridina o solución de
amoniaco, ayudan a incorporar mas agua al disolvente cimentando la
solubilidad.

La técnica puede ser ascendente o descendente.

El papel (H colgado y colorado dentro de una cubeta ingresándose una
atmósfera saturada de vapor).

En la precedente el disolvente asciende hasta el extremo superior del papel,
cesando el flujo del líquido.

Los componentes permanecen sobre el papel y la distancia recorrida por el
disolvente es fija.

Esto es importante para la separación BIDIMENSIONAL.

Con la técnica dominante el disolvente corre a lo largo de papel debido a la
gravedad llegando fuera del papel.

Se puede aumentar la longitud del papel y obtener mejores resultados en la
separación.

1.4 Secado de papel.
Cuando el disolvente ha recorrido la distancia requerida o transcurrido un
tiempo especificado, se saca los papeles de la cubeta.
Se saca el papel con ayuda de un ventilador. Estará listo para el revelado o
localizado.

3.1. Revelado.
Interesa al final localizar la posición de las sustancias en el papel si son
colocadas no hay dificultad.
Si son varios se puede visualizar por métodos físicos como la fluorescencia
y la radiactividad o por aquellos químicos.



II. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

En la cromatrografía de papel, la hoja de papel aparta su propia columna de
celulosa. No necesita un tubo de vidrio para sostenerla.
Para muchos compuestos orgánicos el uso del papel y celulosa no es
satisfactorio. Otros medios tales como alumina y gel de sílice no pueden
prepararse en forma de tiras, por lo que se accede a fabricar capas finas sobre
laminas de vidrio.
Se aplica una capa de un material pastoso sobre una lamina de vidrio. Espesar
material = 0.50 u o 0.250 m. m.
La ventaja de esta técnica aparte de separar compuestos tales como lípidos
que no se puede en la de papel, es que se puede usar una amplia variedad de
materiales bioquímicos pulverizados como capa fina tales como:
Gel de sólidos
Celita
Aliminez
Se elige la capa de acuerdo al material a usar.

Cromatografía de capa fina.
Definición. Es una técnica de separación e identificación de sustancias
químicas por medio de un disolvente que se mueve sobre una capa delgada de
un disolvente que se mueve sobre una capa delgada de un adsorvente idóneo
colocado sobre una hoja de vidrio.
Otras ventajas sobre la separación en papel es que requiere menos tiempo, se
obtiene mejor resolución y manchas mas compactas.

2.1. Preparación de las placas.
Se prepara la papilla disolviendo con agua llegando a una consistencia
apropiada, no debe tener grumos.
Se extiende haciendo uso de una varilla de vidrio o se puede usar en
extender o aplicador especial.
El espesor habitual es de 0.25 m.m.
Placas mas finas dan separaciones mas rápidas; pero menos eficaces.
Placas mas gruesas 0.5 a 1 m.m. se emplean en el trabajo microperativo.



2.2 Alcado
Se calienta la placas en una estufa a 100 – 105° C por 2 horas por lo que se
activan.
Si se les deja luego a la atmósfera, se discurre (gran humedad).
Para medios tales como el gel, el secado es lento.

2.3 Elección del medio.
Celulosa microeristalina (Clomatrografía de reparto)
Gel de sílice (Clomatrografía y reparto)
Alumina (para adsorción)

2.4 Elección de disolvente.
Depende de la naturaleza del compuesto a separar.
Para sustancias solubles en agua se elige capas de celulosa o gel de sílice.
Para sustancias menos polares se elige capas de alivana o gel de sílice.
El disolvente apropiado se aplica en el centro de marcha mediante un
capilar muy fino o se evapora rápidamente.
Se cuenta con una variedad de segundos dizar ventas.

2.5 Desarrollo de las placas.
Por el método ascendente se hace uso de cubeta.



MÉTODO.
Se coloca en el interior un papel filtro empapado de disolvente que cubra
las paredes exteriores de la cubeta para tener una atmósfera saturada.
El fondo tiene disoluto 0.5 a 1.0 cm.
Se introduce la placa.
Se puede hacer la prueba con una o varias placas.
Con varias placas es mejor ya que se puede tener una cubeta sanduaich
en el que hay mejor control de la atmósfera.
Se deja que ascienda el disolvente unos 10 cm. por encima del origen y se
saca la placa.
Se marca con lápiz el efecto del disolvente y se deja empezar.

2.6 Revelado de placas.
A diferencia de la cromatografía de papel en la de capa fina es posible usar
en el revelado agentes corrosivos y alta temperatura, tales como ácidos
concentrados y compuestos oxidantes.
Se usa vapores de yodo (en cristal) al cabo de unos minutos el yodo tiende
a concentrarse donde están los compuestos.
Aparece una mancha marrón oscura sobre fondo amarillo que no es
destructivo.
Se puede emplear también la fluorescencia y la radioactividad (rayos
ultravioleta).

2.7 Cromatrografía Acanlitatura.
Se puede emplear un mayor espesor de capa adsorvente.
Conociendo la posición de las barras que interesan se retiren de la placa
mediante una espátula, se extrae la sustancia de polvo usando un
disolvente.
Ejemplo: Extraer Soxhlet.
En la cromatografía de capa fina cuantitativa se conoce el volumen de la
muestra.
Se analiza el producto disuelto.



2.2. Conservación del cromatrograma.
La conservación del cromatrograma de capa fina es difícil e indeseable ya
que las placas se pierden muchas veces.
La capa es delicada.
Se puede fotografiar la posición de las manchas después del mezclado.
Otra técnica es pulsar polarizar la capa con una dispersión de un plástico
especial transparente, al enderezarse permite retirarlo de la placa de vidrio
manteniendo el cromatrograma.
De otra manera puede generarse indefinidamente.

CROMATROGRAFÍA EN COLUMNA
Son unos tubos o columnas de vidrio con una válvula de Sclich en la parte
superior.
En el mezclado se tiene gran variedad de tipos y tamaños
3.1. Llenados en la columna.

Se coloca el tubo en posición vertical se sostiene un sujetador que se
coloca en el fondo de la columna un disco de porcelana (filtro) y encima de



este un poco de lana de vidrio. Esto retardará el material sólido de la
columna mientras que el líquido eluyente puede circular libremente.
El material adsorbente puede introducirse un poco, peso diferente es
colocado en la prima de papilla con el eluyente.
Antes de introducir el adsorbente se ha h echado empiece de disolvente
puro 2 a 4 cm. por encima de la lana de vidrio.
Se elimina el aire que pueda quedar retenido agotado por medio de una
varilla larga de vidrio.
La papilla formada por el adsorbente y el disolvente se agrega lentamente
en porciones hasta llegar a la altura deseada, se golpea suavemente ...
La altura del disolvente no debe exceder 2 a 5 m. m. sobre el sellado, a
partir de esto la columna esta lista para recibir la muestra que se desea
separar.

3.2. Disolventes empleados
Según sea la preparación de reparto, adsorción o intercambio ionico se
aplican 3 tipos de disolventes.
Para los separadores por adsorción es fundamental que los disolventes
empleados sean puros ya que si hay impurezas pueden alterar el
desarrollo del proceso.
Empleando adsorventes tales como alumina y gel de sílice, la intensidad
de la adsorción aumenta al crear la naturaleza polar del material
adsobido. Por esto se emplea disolventes apolares con el eter de
petróleo.
Se emplea para la correcta elección de la columna, una serie de
disolventes en los que vaya aumentando la polaridad.
Ejemplo: la serie agua > metanol > etanol > acetina > acetato de etilo >
eter > cloeceperaco > buceno.
Para las separaciones basadas en el intercambio único, la solución
acuosa, sería pasar por una columna de resina de intercambio iónico.



3.3 TÈCNICAS DE SEPARACIÒN

Guías de separación.
Columnas de reparto.

La mezcla a separa se disuelve en el disolvente apropiado vertiendo
una solución diluida que se introduce en la columna por medio de
una pipeta.
El disolvente elegido debe ser miscible con el empleado para llenar la
columna; la adición se ayuda empleando una varilla de vidrio
también.
Se abre una llave inferior y se deja salir el disolvente hasta que el
nivel de la muestra este 1 o 2 m. m. del adsorbente, a través del
adsorbible remplazando la llave.
El flujo se continua hasta que se han separado todos los
componentes.



b) Columnas de adsorción dibujo:
No naportucto
Disolvente A
Disolvente B

A B

3.4 Examen e identificación de los compuestos.
Cuando la muestra aplicada a la columna es colocada, se abrieron
fácilmente el proceso de separación. Embollo Metálico
Mediante un embolo o pistón
se emplea con cuidado el
adsorbente evitando que se
desmorone. COLUMNA RELLENO DE
COLUMNA

Se deja secar (evaporar). EXTRUCIÓN DEL RELLENO

Se corta en rodajas
Se extrae con disolvente cada rodaja
Se analiza el extracto.

II. CROMATOGRAFÌA DE GASES
Las 3 técnicas de separación ya descritas se vienen utilizando desde hace
mucho tiempo y son las mas apropiadas para separaciones de sólidos y
líquidos NO VOLATILES en solución.
La cromatografía de gases es particularmente apropiada para la separación
de gases y líquidos volátiles.



ESQUEMA DE INSTALACIÓN DE UN APARATO PARA
CROMATOGRAFÍA DE GASES.

1. Aire Fig. CROMATOGRAMA
REPRESENTADO LA SEPARACIÓN
B. Etano DE GASES DEL PETROLEO, SOBRE
ALUMINA, USAN-
C. Propano DO HIDROGENO COMO GAS PORTADOR.
D. Isobutano
E. n-butano
F. Isoperitano
G. N-pentano

La pequeña muestra de gas a separar se inyecta en la corriente de gas
inerte tal como N, H, dióxido carbónico, argón o helio que pare hasta una
columna que contiene un medio apropiado, capaz que irá retardando el
flujo, de manera gradual, de cada uno de los compuestos individuales de
la muestra que fluye a través de la columna.



Los compuestos separados margen a intervalos (de acuerdo a cada
componente) y pasan a través de un director.
Se hace posible la separación por las diferencias en la adsorverí en la
columna.

4. Los análisis de gases se llevan acabo en una columna de cada par
(gas - sólido).
Los líquidos y sólidos volátiles en canaletas de gas – líquido. Sobre el
gas partidor.
Se adquiere al estado puro en citados a presión o para resultados
óptimos se saca el gas antes de ser poco pasándose a través un tamiz
molecular (eliminan el vapor de agua).
El gas portador a emplear depende de la naturaleza de la muestra y del
tipo de detector instalado.
La velocidad del flujo del gas portador se controla con una medida de
caudal (rotavetro).
La colectora vertical del flotador indica continuamente la velocidad del
flujo.

4.1 Introducción de la muestra.
Se usa muestras pequeñas de 0.19 10 ul para gases y líquidos y
fracciones de mg. para sólidos.
Muestras mayores darán una mala separación.
Se hace uso de una micro-jeringa mediante una aguja que atraviesa el
tapón de goma.
La muestra aplicada debe evaporarse rápidamente a la entrada para ello
hay una resistencia eléctrica que calienta la entrada. Una buena
temperatura es 50°C.
Con gases o muestras muy pequeñas, la calefacción no es esencial.

4.2 La columna.
Son de vidrio, plástico o metales. Se perfora los metales por ser inertes,
resistentes y tener buena transferencia de calor.
Tiene 1.5 a 4.5 m. de longitud y 2 a 20 mm O.



En el sistema de cromatrografía capilar de gases los tubos o en 1.3 a 3
m.m. de longitud y de 0.1 a 1 mm. de O de diámetro.

4.1 Preparación de relleno.
a. Columnas de alumina
Los adsorventes mas empleados son alumina, carbón activo, gel de
sílice o trabajen bien a temperatura ambiental.
Para compuestos de elevado peso molecular se eleva la temperatura y
empleado adecuadamente en líquido no volátil para bloquear los cortes
activos y bajar el poder de adsorción.
b. Columnas de reparto.
El material de relleno viene a ser un soporte soluto finamente dividido,
que parte un líquido volátil.

3. SISTEMA HPLC
(HIGH PRESSURE LIQUID CHRDNATLLGRAPY).
CROMATROGRAFÍA DE LIQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN.
En cromatrografía de líquidos tiene lugar aveces usa ensanchamiento de
banda significativo fuera del relleno de la columna.
Se produce debido a la diferencia de hióabidad de flujo que hay entre las
capas de líquido coadyuvantes a las paredes del tubo y las del centro.
En la parte central el soluto se mueve con mayor rapidez que en la
peritica.
En el aparato HPLC, se hace uso de altas presiones y el equipo es mas
complejo, que un cromatografo común (ver Fig).

Tiene varias respuestas que pueden ser de vidrio o de accioina, cada
uno tiene 500 ml. de un disolvente.
Cuando hay formación de gases (O 2, N) disueltos que pueden interferir
en la sustancias de detección se hace uso de un difusor que mediante
una sustancia de vacío arrastra los gases disueltos fuera de la solución
mediante finas burbujas de un gas fuerte y de baja solubilidad.
Esos procesos y instrumentos HPLC se puede introducir los disolventes
a través de 2 ó mas recipientes hacia una cámara de mercía.



5.1 Sistema de bombas
Se usa presiones por encima de 600 psi, el flujo debe estar libre de
pulsaciones, el intervalo de calidad de 0.1 a 10 ml/min.
Componentes resistentes a la corrosión (se saca acero y teflón).
Se usan 3 tipos de bombas:
• Bombas reciprocantes (produce pulsaciones) por cierta fusión.
• Bombas de jeringa
• Bombas neumáticas (presión constante).
• Bombas de jeringa o de desplazamiento. Son cámaras como una jeringa y
un embolo.
Desventaja: Capacidad limitada de disolvente 250 ml, dificulta su cambio
de disolvente.
Ventaja: Flujo libre de pulsaciones.
• Bombas neumáticas. Son mas simples. La fase móvil esta en un
ceritenedor plegada el que puede prescindirse mediante aire
comprimido, no provoca pulsaciones, son baratos pero de baja presión y
capacidad limitada.
Control del caudal de bombeo.
Tiene dispositivos controlados por ordenador. Cualquier diferencia entre
la señal y lo programado su fuerza abstractiva se aumenta o disminuye
la velocidad del motor de la bomba.

Sistema de inyección de muestra.
Un factor limitante en la presión de las medidas es la reproductibilidad en
introducir la muestra de la columna.
Por ello los volúmenes que se emplean deben ser muy reducidos. De
unas pocas decinas de microlitro a 500 u litro (1/2 ml) e introducir la
muestra sin despresurizar el sistema.
Adicionalmente se usa un mecanismo llamado bucle de muestra. Su
tamaño varía de acuerdo a la muestra, son intercambiables y van de 5 a
500 u l.



La ventaja es que puede introducir la muestra a presiones de hasta 7000
psi con una presión de unas décimas por ciento.
Columnas para cromatografía de líquidos. Se construye de acero
inoxidable, vienen empaquetados cientos de columnas de O variable.
Su longitud varía de 10 a 30 cm, son rectas y se pueden alargar
acoplando 2 o mas columnas.
El O entero varía de 4 a 10 mm y los tamaños de partículas de los
rellenos van de 3.59 a 10 u m.
Tipos de relleno de la columna
Los mas empleados son de 2 tipos:
a. Películas. Bolas de vidrio o de polmero, no perones, esféricas de O
30 a 40 u m.
Es la superficie las bocas tienen un ambiente de sílice o alumina o de
una resina de intercambio ionico.
b. De partícula porosa. O de 3 a 10 u m. material sílice, alumina o
resina de intercambio iónico.
• Detectores.
En cronometría de líquidos se usan los detactores de ionización de llama y
de conducción térmica.
Se usan 2 tipos:
a. Detectores basados en una propiedad de la disolución.
Ejemplo: índice de refracción, la constante dielectica o la deusidad.
b. Detectores basados en una propiedad de soluto.
Ejemplo: absorvación UV, fluorescencia o intensidad de difección que no
son propias de esta fase móvil.
ESQUEMA DE UN APARATO HPLC (PERKIN-ELMER)


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