1. INTRODUCCIÓN
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es
observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe
reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de
oxígeno adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de
cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al
enfriarse a 40 grados.
2. RECOMENDACIONES GENERALES DE EMPLEO PARA LOS MEDIOS DE
CULTIVO
Preparación de los Medios de Cultivo Deshidratados
Por regla general los ingredientes de los medios de cultivo se disuelven por agitación y
calentando ligeramente en agua destilada. Los medios que contienen agente gelificante se
suelen hervir durante 1 minuto para conseguir su disolución. Aunque en la mayor parte de
los medios hay que calentar, hay que evitar sobrecalentamientos innecesarios. Algunos
medios presentan turbidez inevitable o precipitados, por ejemplo la Base de Caldo
Tetrationato. Al distribuir el medio debe hacerse de forma uniforme, para que el
precipitado quede bien repartido.
Posteriormente a la disolución se procede a la esterilización del medio. En algunos casos
existen componentes lábiles que no pueden añadirse en el medio de cultivo deshidratado
y que será necesario su esterilización por separado y una posterior incorporación de
forma aséptica para obtener el medio completo. El pH de los medios de cultivo se ajusta
durante su fabricación a los valores descritos en cada uno de ellos. Sin embargo, la calidad
del agua que se utiliza en su hidratación, la utilización de medios no recientes etc.
Pueden modificar este parámetro por lo que es aconsejable verificarlo y reajustarlo si
fuera necesario. En algunos casos se puede ajustar el pH después de la esterilización de
forma aséptica y utilizando soluciones ácidas (Acido Clorhídrico) o básicas (Sodio
Hidróxido) estériles. En los medios sólidos la medida se hace a 45-50ºC (el agar todavía no
ha gelificado) mientras que en los líquidos se hace a temperatura ambiente. Los medios
ácidos (pH<5) pueden presentar malas gelificaciones debido a la posible hidrólisis del Agar
con la temperatura. Son medios que no es aconsejable refundirlos, y si es imprescindible,
es aconsejable añadirles agar.
El método más comúnmente utilizado para la esterilización es el Autoclavado. Sin
embargo, hay ingredientes en algunos medios que no mantienen sus propiedades si se
someten a altas temperaturas.
Esterilización
En la etiqueta del producto se indican las condiciones de esterilización. De todas formas se
describen unas pautas de carácter general.
Autoclavado: Exposición durante 15 minutos a 121ºC.
Con este tratamiento mueren las células vegetativas y las endosporas bacterianas. Sin
embargo, los medios que contienen hidratos de carbono, deben esterilizarse a
3. temperaturas no superiores a los 116-118ºC, para prevenir su descomposición y la posible
formación de compuestos tóxicos que inhiban el crecimiento bacteriano.
Filtración: Es el medio más habitual cuando existen productos lábiles.
Habitualmente el producto a esterilizar se filtra a través de una membrana de acetato de
celulosa o nitrocelulosa de un poro de 0,22 μm. Las soluciones de antibióticos, las de
carbohidratos, las vitaminas, etc., se suelen esterilizar por este método y añadir al medio
de cultivo ya esterilizado, cuando éste está a temperatura no superior a los 45-50ºC.
Tindalización: Exposición a 100ºC durante 30 minutos.
Con este tratamiento mueren las células vegetativas, pero no las endosporas. Cuando el
medio esta frío, se incuba bajo condiciones de germinación de las endosporas, y si ello
ocurre, se repite el tratamiento térmico.
Precauciones con algunos Ingredientes
Algunos medios contienen productos tóxicos. Se deben tomar las medidas de seguridad
necesarias al manipular estos productos. Algunos de estos compuestos son la Fucsina
básica y ácida, la Pararrosanilina, la Azida Sódica, el Sodio Selenito, etc.
Conservación de los medios preparados
Lo más recomendable es preparar el medio cuando se va a emplear, aunque en muchos
casos por razones obvias una parte del medio preparado se consume y el resto se guarda
como medio preparado. El tiempo de vida del medio preparado dependerá de la propia
naturaleza del medio, de la hermeticidad de los recipientes que lo contienen, de la
temperatura de conservación y de las condiciones medioambientales. Si la hermeticidad
es buena y la temperatura baja, 2-8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6
semanas.
De todas formas la refrigeración favorece la deshidratación y en algunos casos, como por
ejemplo, los medios para anaerobios, la conservación es mejor a temperatura ambiente
que en frigorífico. Se deben evitar las condensaciones ya que el depósito de gotas de agua
podrá ser causa de una alteración casi inmediata del medio. Tampoco deben emplearse
medios preparados en los que se observe un efecto de deshidratación.
Conservación de los medios deshidratados Como regla general y si no se establecen
condiciones particulares los medios deshidratados deben almacenarse en lugar fresco,
seco y al abrigo de luz directa del sol.
4. Existen unos medios en concreto, que requieren un almacenamiento entre 2-8°C, que son:
414703 Selenito Verde Brillante, Caldo
414680 Marino, Agar
413824 Selenito, Base de Caldo
414698 Marino, Caldo
413809 Selenito y Cistina, Caldo
414722 Emulsión Yema de Huevo
414723 Emulsión Yema de Huevo-Telurito
414724 Potasio Telurito solución 3,5%
En la manipulación de los frascos se debe procurar que las aperturas y cierres sean los
menos posibles y que el tiempo durante el cual el frasco permanece abierto sea el
mínimo. De lo contrario el medio se irá rehidratando, con lo que comenzará a
compactarse y endurecerse, ya que son generalmente higroscópicos. Incluso podría llegar
a tener lugar un crecimiento bacteriano en superficie. En estas condiciones debe
desecharse el producto.
Conservación de los medios preparados listos para su uso.
Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de conservación, que es
de varios meses si las condiciones de almacenamiento y transporte son las adecuadas. Se
recomienda su almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y protegidos de
la luz.
Algunos medios deben conservarse entre 2-8ºC, siendo este requisito especificado en la
etiqueta del producto. Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de
0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua puede provocar
precipitados o hacer que cristalicen ciertas sustancias del medio de cultivo, así como
originar grietas en las placas preparadas.
En los medios de cultivo que deben mejorarse y que deben contener aditivos lábiles, se
suministra el medio basal preparado y según la necesidad se deben añadir los aditivos de
forma estéril.
Destrucción y desinfección
Una vez realizados los cultivos, el medio debe ser autoclavado a 121ºC durante 30
minutos antes de su desecho definitivo. De igual manera se debe proceder con el material
de laboratorio empleado en los cultivos antes de su lavado y nuevo uso.
6. LOS MEDIOS DE CULTIVO SE CLASIFICAN BASÁNDOSE SEGÚN SU COMPOSICIÓN
QUÍMICA
Medios sintéticos o químicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de
nitrógeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son
estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a
concentraciones conocidas.
Medios complejos o de composición indefinida. Estos medios llevan ingredientes como
extracto de levadura, peptona, infusión de cerebro, extracto de carne, etc. Que contienen
nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composición cualitativa ni
cuantitativa de estos nutrientes.
Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos
adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos
(particularmente heterótrofos exigentes). Ejemplo: adicción de sangre, suero o extractos
de tejidos de animales y plantas.
Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseño el crecimiento específico de
un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el
aislamiento de microorganismos a partir de una población microbiana mixta. Ejemplo:
CO2 como fuente de carbono es selectivo para autótrofos; adicionando cristal violeta se
inhibe el crecimiento de los Gram. (+); Utilizando maltosa como única fuente de carbono
sólo crecerán los que usen maltosa.
Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminación de
microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en
dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolíticos de no hemolíticos; McConkey
diferencia lactosa (+) de lactosa (-).
F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento óptimo ya que el
crecimiento rápido y prolífico suele ocasionar la muerte rápida de las células. Ejemplo: al
añadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen ácidos, acidificándose el
medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
7. AGAR NUTRITIVO
Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de
microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.
Su uso está descrito en muchos procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y
otros materiales de importancia sanitaria.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Pluripeptona 5.0 Suspender 31 g de polvo por litro de agua
destilada. Mezclar y dejar reposar 5
Extracto de carne 3.0 minutos. Calentar suavemente agitando y
Cloruro de sodio 8.0 hervir 1 o 2 minutos hasta su disolución.
Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15
Agar 15.0 minutos.
pH final: 7.3-0.2
FUNDAMENTO
Es un medio usado para el cultivo de microorganismo poco exigente en los requerimientos
nutricionales. No contiene inhibidores de crecimiento microbiano. La Pluripeptona es la
fuente de carbono y nitrógeno para el crecimiento microbiano.
El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras
sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.
CARACTERISTICAS DEL MEDIO:
Ámbar claro a medio ligeramente opalescente.
8. AGAR EMB (Eosina Azul de Metileno).
Se emplea como medio diferencial para el aislamiento y diferenciación de bacterias
entéricas Gram-negativas, de rápido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite
el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.
Fórmula (en gramos por litro) Instrucciones
Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de
Lactosa 5.0 agua destilada. Reposar 5 minutos;
mezclar, calentando a ebullición durante 1
Sacarosa 5.0 o 2 minutos hasta su disolución. Esterilizar
Fosfato dipotasico 2.0 en autoclave a no más de 121C durante 15
Agar 13.5 minutos. Enfriar a 45C y distribuir agitando
Eosina 0.4 suavemente.
Azul de metileno 0.065
pH final: 7.2 -0.2
Fundamento
Por la combinación de estos dos colorantes y los dos hidratos de carbono se pueden
distinguir algunos géneros. Las bacterias lactosa-negativas y sacarosa negativas
(Salmonella y Shigella) dan colonias incoloras, mientras que las lactosa y/o sacarosa-
positivas dan colonias púrpura-violetanegruzco con o sin un centro oscuro y quedan
rodeadas de una zona incolora.
La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y sacarosa, ya aquellos
que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de metileno;
9. éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. También es
posible la identificación de Candida albicans.
Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. Presentan un característico brillo
metálico.
Modo de empleo
Sembrar en la superficie del medio, Incubar entre 35º y 37ºC de 18 a 24 horas.
Resultados
Microorganismos Tipo de Colonia
Verdosas con brillo metálico y centro negro
Escherichia coli
azulado
Klebsiella pneumoniae Mucosas, rosa púrpura, confluentes
Proteus mirabilis Incoloras
Enterococcus faecalis Incoloras, pequeñas, puntiformes
Shigella flexneri Incoloras
Salmonella typhimurium Incoloras
Control de Calidad
Control físico-químico
Aspecto: polvo fino. Solubilidad:
opalescente con precipitado.
Color: púrpura rosado. pH: 7,2 ±0,2
Características del medio
10. Standard Plate Count (SPC)
Se utiliza para el examen microbiológico de alimentos, agua y productos lácteos.
Composición Concentración del medio gr/litro
Triptona 5.0
Dextrosa 1.0
Extracto de levadura 2.5
Agar 12.0
pH final: 7.2- 0.2
