1. Priscila Raijche de Oliveira
Research in Veterinary Science Journal

2. Nome comum: tasneirinha, flor-das-almas e maria-mole;
Ocorrência: região centro-sul do Brasil Senecio
brasiliensis;
Princípio ativo: alcalóides pirrolizidínicos –
hepatotóxicos;
Partes tóxicas: Folhas (verdes/secas).
Principal causa de morte em bovinos na região Central do RS e
uma das principais causas de morte em equinos na Paraíba.

3. Substância orgânica, de origem natural, cíclica, contendo
um nitrogênio em um estado de oxidação negativo e cuja
distribuição é limitada entre os organismos vivos.
20% das substâncias naturais descritas;
Maioria de caráter alcalino;
 Alcalóides verdadeiros átomo de nitrogênio em um anel heretocíclico;
 Protoalcalóides átomo de nitrogênio não inserido a um anel
heterocíclico;
 Pseudoalcalóides Compostos nitrogenados com/sem anéis
heterocíclicos que não são derivados de aminoácidos (terpenos/ esteróides).
Cocaína

4. Localização nos vegetais
 Tecidos com crescimento ativo;
 Células epidérmicas e hipodérmicas;
 Bainhas vasculares;
 Vasos lactíferos;
Localização intracelular
Retículo endoplasmático Vacúolos
Raramente estão presentes em tecidos mortos
O Local de estoque frequentemente é diferente daquele no qual
são sintetizados.

5. Funções:
Proteção - gosto amargo;
Reserva de Nitrogênio;
Reguladores de crescimento;
Manutenção do equilíbrio iônico;
Proteção contra irradiação UV.

6. ALCALÓIDE PLANTA ATIVIDADE
Artemisina Artemísia annua Antimalárico
Atropina Atropa belladona Anticolinérgico
Capsaicina Capsicum spp. Anestésico local
Colchicina Colchicum autumnale Antigotoso
Escopolamina Datura spp. Antiparkinsoniano
Emetina Cephaelis ipecacuanha Amoebicida
Morfina Papaver somniferum Analgésico
Quinina Cinchona spp. Antimalárico
Reserpina Rauwolfia spp. Anti-hipertensor
Vimblastina, Vincristina Catharanthus roseus Antitumoral

7. Ocorrência natural em cerca de 6.000 espécies
de plantas de diversos gêneros e famílias;
Alguns: Fitoalexinas (proteção) Citotoxinas
Distribuídos em diferentes partes/ proporções
variadas (externelidades);
 Derivados do aminoácido ornitina.
Descarboxilação Transaminação
Condensação
intramolecular

8. Radicais livres: Moléculas altamente reativas
capazes de oxidar proteínas, substratos de
nucleotídeos e lipídios, induzindo alterações
celulares e morte Parkinson, Alzheimer, a
esclerose múltipla, mutagênese, distúrbios
teratogénicos.
- Espécies reativas de oxigénio (ROS) e
espécies reativas de nitrogênio (RNS)

9. Óxido nítrico (NO) reage com superóxidos
Peroxynitritos Radical hidroxil
Inibição da respiração mitocondrial
Célula com déficit energético

10. Senécio spp.: Representa o maior risco para o gado
e, por sua vez, para os consumidores de produtos de
origem animal.

11. Testar se a planta S. chrysanthemoides
apresenta os seus efeitos tóxicos por meio
de geração de espécies reativas de oxigênio
(ROS) e espécies reativas de nitrogênio e
(RNS), levando a apoptose.

12. Animais
Camundongos albinos suíços de ambos os
sexos;
Peso: 20-25 g;
Condições padrão de temperatura (25 ± 5 º
C) com manutenção de um ciclo de 12 h luz /
escuridão;
Dieta padrão e água ad libitum;
Sacrifício: Anestesia com éter.

13. Extrato da planta: Senecio
chrysanthemoides
Folhas, caules e raízes das plantas foram
secas e moídas em pó;
Extração com etanol a 95%;
Evaporação do sob pressão a 40 °C;
Dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO,
10 mg/ mL);
 Armazenado a 20 °C.

14. Isolamento de macrófagos peritoneais murinos
 Macrófagos peritoneais foram lavados: solução salina
gelada tamponada com fosfato (0,02 M, pH 7,2; PBS);
 Centrifugação 300g por 10 min a 4 º C;
 Sedimento resultante ressuspenso em meio RPMI-
1640, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo
inativado quente, penicilina (100 unidades/ ml) e
estreptomicina (100 µg/ mL) - Referido como meio A;
 A viabilidade celular foi determinada a 95% por
exclusão de azul de tripano; - COLORAÇÃO =
MORTE;
 As células foram mantidas a 37 º C, CO2 a 5%.

15. Ensaio MTS: Efeito de Senecio sobre a viabilidade dos macrófagos
 Macrófagos foram semeados em placa de cultura de tecidos de 96
poços;
 Individualmente incubadas com concentrações crescentes de S-EtOH
(0-25 µg/ mL) por 24 h a 37 º C, CO2 a 5%;
 Depois de 24 h, MTS e PMS foram misturados na proporção de 20:01;
 20 µL dessa mistura foi adicionado a cada poço;
 Células incubadas durante 3 horas a 37 º C;
 Absorvâncias foram medidas a 490 nm.
MTS (sal de tetrazólio): Reduzido a formazano (cor) pelas desidrogenases
mitocondriais, na presença do acoplador de elétrons (PMS).

16. Detecção de ROS foi medida utilizando um
indicador de ROS (H2-DCFDA);
Determinação de espécies reativas de oxigênio (ROS) em macrófagos
H2-DCFDA H2-DCF DFC Fluorescênci
a
Hidrólise
por
esterases
Oxidação
por
ROS
Célula livre,
Permeável,
Não
fluorescente

17. A produção de NO foi medida por estimativa de nitrito usando
o ensaio de Griess – NO em solução aquosa = nitritos (cor).
 Macrófagos foram deixados aderir em placas de 6 poços para cultura
de tecidos;
 Poços foram incubados com diferentes concentrações de S-EtOH (0-10
µg/ mL) durante 24 h;
 Sobrenadantes recolhidos e incubados com um igual volume de
reagente de Griess à temperatura ambiente durante 10 min;
 Absorbâncias foram medidas a 550 nm utilizando leitor de microplacas;
Medida da produção extracelular de óxido nítrico por macrófagos

18. DAF-2 DA DAF 2 DAF - 2T
Determinação da produção de óxido nítrico intracelular em macrófagos
Vias
dependentes
de óxido nítrico
Clivado por
esterases
 Concentração de S-EtOH: 0 – 10 µg/ mL;
 Fluorescência medida em citômetro.
Marcador
Fluorescente de
NO

19.  Mercúrio laranja fluorescente foi utilizado como
medida da glutationa intracelular
 Mercúrio laranja se liga com os grupos sulfidril de
tióis não protéicos como os da glutationa (GSH) e,
portanto, a fluorescência é diretamente
proporcional ao nível de GSH intracelular.
Determinação de tióis não protéicos em magrófagos

20.  Macrófagos (1 X 106/mL) foram incubados na ausência (controle)
e presença de S-EtOH (14 µg/ mL) durante 24 horas a 37 ºC;
 Células foram centrifugadas (300 g/ 10 min);
 Lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em anexina-V
tampão de ligação;
 A anexina V-FITC e iodeto de propídio (1 µg/ mL, PI) foram
então adicionados e incubados durante 30 min - Protegido da luz
à 20-25 ºC;
 Leitura foi realizada com um citômetro de fluxo;
Determinação da externalização de fosfatidilserina em macrófagos

21.  Ensaio que consegue identificar as zonas de DNA fragmentado,
resultante da apoptose, pela adição de nucleotídeos marcados com
corante fluorescente (FITC) nas extremidades cortadas do DNA;
 Reação catalisada pela enzima de TUNEL;
 Células TUNEL positivas = DNA fragmentado (presença de
coloração verde do corante FITC) / TUNEL negativas = DNA
íntegro.
 S-EtOH: 14 µg/ mL;
 Leitura em citômetro.
A detecção in situ da fragmentação de DNA pelo terminal desoxinucleotidilo
transferase (ensaio de TUNEL)

22. Concentrações mais elevadas:
5,0 µg/ mL: 64,26 ± 1,67%
10 µg/ mL: 56,22 ± 2,31%
Tóxico
Até 1,0 µg/ mL:
89,60 ± 2,10%
Não-tóxico.
Extrato etanólico do Senécio (viabilidade celular):
SENÉCIO É CITOTÓXICO
PARA MACRÓFAGOS
MURINOS

23. Baixa concentração de S-EtOH
(1,0 µg / mL):
Aumento de 5,5 vezes a intensidade
de fluorescência.
Senécio aumentou geração de espécies reativas de oxigênio em
macrófagos murinos.
Concentrações mais elevadas de
Senecio (5,0 e 10,0 µg / ml):
Redução dose-dependente da
intensidade de fluorescência
(Tabela 1).

24. Senécio aumentou a geração de óxido nítrico (NO) em macrófagos
Concentrações mais baixas
(0,1, 0,5 e 1,0 µg/ mL, 24 h):
Progressivo aumento da produção
ocorreu a partir de valores basais:
4,90 ± 0,72 µM
8,18 ± 1,27 µM
11,45 ± 0,97 µM
18,79 ± 0,32 µM
Concentrações, superiores
(5, 10 e 25 µg / mL, 24 h):
Redução da produção de NO:
6,96 ± 1,47 µM
5,27 ± 0,93 µM
4,69 ± 0,42 µM
Efeito da S-EtOH na geração de NO extracelular:
testado em concentrações de 0-25 µg/ mL por 24 h:

25. Senécio aumentou a geração de óxido nítrico (NO) em macrófagos
Usando uma sonda específica DAF-2DA para medir a produção de NO intracelular
S-EtOH (1,0 µg / mL, 24 h):
Dobrou a intensidade de fluorescência
da DAF-2 em comparação com valores
de linha de base.
Maiores concentrações
(5,0 e 10 µg/mL):
Intensidade de fluorescência reduzida
(Tabela 1).

26. S-EtOH (1,0 µg / mL, 6 h):
Reduziu significativamente a
fluorescência do mercúrio laranja em
comparação com o controle.
(Fig. 2C, Tabela 1)
Senécio esgota tióis intracelulares não protéicos em macrófagos.
Maiores concentrações
(5,0 e 10,0 µg / mL):
Dose-dependente diminuição da
intensidade de fluorescência foi
observada (Tabela 1).

27. Senécio induz externalização de fosfatidilserina em macrófagos
Controle: Às 24 h, apenas 1,47% de células foram anexina V-FITC positivas enquanto
que 0,18% PI foram positivos.
O tratamento com S-EtOH resultou em aumento de ligação de ambos: Anexina V-FITC
(34,88%, fig. 3) e PI (25,88%, fig. 3).
O efeito de S-EtOH
(14 µg/ mL) sobre a % de
ligação de anexina V-FITC
e Iodeto de propídeo foi
estudado.

28. Avaliou-se a fragmentação do DNA induzida por S-EtOH (14 µg/ mL, 24 h, a 37 º C)
em que a proporção de cortes de DNA foi quantificado através da medição da ligação
de nucleotídeos marcado com corante fluorescente FITC ligado às extremidades
cortadas
Consequentemente, a fluorescência obtida é directamente proporcional aos
Senécio induz o corte do DNA in situ em macrófagos.

29. Alcalóides Pirrolizidínicos são capazes de
interagir com diversas moléculas, tendo forte
afinidade para grupos sulfidril (-SH), incluindo
tióis não protéicos, causando redução do
processo antioxidante celular.
S-EtOH é citotóxico para macrófagos. A
citotoxicidade é mediada, em parte, pela sua
capacidade de gerar ROS, como medido por
um aumento na fluorescência de DCF.

30.  Óxido nítrico é um importante defensor imunológico
contra patógenos invasores, mas sua produção
descontrolada pode ser prejudicial para os macrófagos;
 Combinação com superóxidos formando peroxinitritos
que podem inibir o complexo mitocondrial;
 O aumento gradual em ROS e RNS contribuiu
para a citotoxicidade observada.

31. Seguido de um estímulo apoptótico,
fosfatidilserina presente no folheto interno
da membrana plasmática vira para fora
para a monocamada externa de plasma
membrana e, por conseguinte, exposição
de fosfatidilserina é considerado como um
marcador de apoptose.

32.  A anexina V, por ter uma afinidade forte para
fosfatidilserina, serve como uma medida da
apoptose.
 Iodeto de propídio (PI): Utilizado para distinguir morte
por apoptose da morte celular por necrose.
 O presente estudo sugere que Senécio medeia a
morte celular por apoptose e necrose por haver
populações ligadas a Anexina V (população
apoptótica) ou PI (população necrótico).

33.  A fragmentação do DNA é uma das características
da apoptose. A ocorrência do corte do DNA de S-
EtOH foi detectada com o ensaio de TUNEL, em
que a proporção de cortes do DNA permite uma
maior ligação de nucleotídeos fluorescentes;
 Senécio provoca a desestabilização do ambiente
intracelular de macrófagos murinos através de
uma carga aumentada de radicais reativos que
conduzem a toxicidade e morte celular.