1. Molecular biology, School of Medicine
February 23- 2015
María Alejandra Aristizábal Giraldo and Mary Luz Bohórquez

2. STEATOSIS
An accumulation of fat in the liver
Alcohol-related fatty liver disease Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).
A threshold of <20 g
alcohol per day in
women and <30 g in
men is usually used
to allow a diagnosis
of NAFLD.

3. ALCOHOL-RELATED FATTY LIVER DISEASE
LIVER ALCOHOL
DEHYDROGENASE
INDICATES
ATP
FALSE CALORIES Storage and biosynthesis
of cholesterol and
triglycerides

4. NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE (NAFLD).
The non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as a steatosis
entity encompassing a broad spectrum of liver damage, occurring in the
absence of chronic alcohol consumption
simple steatosis
steatosis
necroinflammatory
changes associated with
varying degrees of fibrosis
called steatohepatitis
cirrhosis.
include

5. Hepatic component of the metabolic syndrome
Prevalence among 20-30% of the population in Western countries
and 15% in Asian countries
It is characterized by the increased flow and hepatic uptake of circulating free
fatty acids (FFA) from excessive peripheral lipolysis, all as a result of insulin
resistance (RI) in adipose tissue
FEATURES

6. Hepatomegaly is
very common.
Splenomegaly with
or without portal
hypertension may
occur with cirrhosis.
• Age> 45 years
• BMI> 30 kg / m2
• Hypertriglyceridemia
• Presence of comorbidities:
 Diabetes mellitus Type 2
 Metabolic syndrome
 Sleep apnea syndrome
RISK FACTORS

7. LIPID-PEROXIDATION
Is considered as the main molecular
mechanisms involved in
the oxidative damage to cell structures and in
the toxicity process that produce cell death.
It involves the formation and propagation of lipid radicals, the
uptake of oxygen, a rearrangement of the double bonds in
unsaturated lipids and the eventual destruction of membrane
lipids, with the production of a variety of breakdown products,
including alcohols, ketones, alkanes, aldehydes and ethers
Cause or consequence of oxidative stress

8. OXIDATIVE STRESS
Oxidative stress is essentially an imbalance between the production of free
radicals and the ability of the body to counteract or detoxify their harmful
effects through neutralization by antioxidants (enzymes: glutathione
reductase; exogenous: Vitamin C, Beta-carotene and Vitamin E)
Oxidative stress leads to many pathophysiological conditions in the body

9. HEPATOCYTE
Hepatocytes are the
chief functional cells
of the liver and
perform an
astonishing number of
metabolic, endocrine
and secretory
functions.
Roughly 80% of the mass of the liver is
contributed by hepatocytes.

10. • Protein synthesis
• Protein storage
• Transformation of CHO
• Synthesis of cholesterol,
bile salts and
phospholipids.
• Detoxification,
modification, and excretion
of exogenous and
endogenous substances
• Initiation of formation and
secretion of bile
WHAT ARE THEIR FUNCTIONS?

11. One of the
most common chronic
liver diseases
(affecting
hepatocytes)
NON-alcoholic fatty
liver disease
(steatosis)
oxidative stress
ROS
Balance between pro- and
antioxidants is impaired
Lipid peroxidation
Oxidative stress can
lead to the
modifications of
biological molecules,
including DNA, lipids
and proteins and has
been implicated in
many pathological
conditions

12. Evaluate the association
between alterations in
nuclear morphology and
oxidative stress by
identifying protein
products of lipid
peroxidation (oxoLPP).

13. “Método donde los biólogos
moleculares y celulares
conducen estudios
experimentales sobre células
aisladas de un organismo
mantenidas en condiciones
que permiten su supervivencia
y crecimiento”

14. VENTAJAS
Facilidad para
cultivar células de un
único tipo específico
con propiedades
homogéneas.
Las condiciones
experimentales
pueden controlarse
más fácilmente.
Se lleva a cabo el proceso
de clonación celular, donde
una única célula puede
formar una colonia de
células idénticas
DESVENTAJAS
No se encuentran en el ambiente normal, y por ende
sus actividades no están reguladas por otras células y
tejidos como ocurre en células in vivo

15. ¿Para qué se realizó esto en la investigación?
 Se cultivaron células de la línea Hep62, en
condiciones fisiológicas.
 Se les adiciono el “fatty acid complex” (FA)
para inducir in-vitro la esteatosis y observar
diferentes comportamientos.
 A otras se les adicionó adicionalmente
CoCl2, un compuesto que regula el estrés
celular exógeno.
 Se dejaron muestras control.

16. Es una determinación de las células vivas o
muertas, en base a una muestra total de
células. Por lo general se involucra tinción o
aplicación de productos químicos para identificar
dicha variable.

17. La acumulación del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento del
colorante dentro del ambiente ácido del lisosoma
Se usó el ensayo
de ABSORCIÓN
LISOSOMAL
NEUTRO ROJO.
¿Para qué se realizó esto en la investigación?
Para determinar la viabilidad de las células cultivadas
Se basa en la detección de los daños que producen
los compuestos tóxicos sobre la integridad de la
membrana de los lisosomas y sobre el control del flujo
del colorante a través de la misma.
Como respuesta se observa una disminución en la capacidad
de las células para retener al colorante Rojo Neutro en el
interior de los lisosomas, la cual es indicadora de la viabilidad
celular

18. Método empleado para distinguir
entre diferentes tipos de células o
para revelar la presencia de
determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos,
esporas, cápsulas, paredes celulares,
centros de actividad respiratoria,
proteínas, entre otras.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos
(cationes+) que tienen alguna afinidad específica por los
materiales celulares.

19. ¿Para qué se realizó esto en la investigación?
Para evaluar la acumulación de grasa intracelular
SE USÓ TINCIÓN CON FLUORESCENCIA
 Técnica más versátil y poderosa para la localización de
proteínas dentro de una célula por microscopía óptica, y
observación a través de microscopio de fluorescencia.
 Químico fluorescente = es aquel que es capas de absorber la
luz de determinada longitud de onda (de excitación) y emite luz
(fluoresce) a una longitud de onda específica más larga.
 Los fluorocromos emiten luz visible (+) o infrarroja (-).
 En los microscopios, solo la luz fluorescente emitida por la
muestra, se usa para formar la imagen.
Se usó el
fluorocromo
rojo Nilo-
DMSO

20. Cuando un investigador desea detectar la presencia de proteínas específicas, se
recurre al método de anticuerpos unidos en forma covalente a los
fluorocromos.(microscopía de inmunofluorescencia)
La microscopía de fluorescencia
convencional tiene limitaciones, la
principial es :
 Superposición de imágenes
fluorescentes
 Microscopía de
barrido confocal.
¿Para qué se realizó
esto en la
investigación?
Detectar los productos de la
peroxidación de lípidos
(reactivos (oxoLPP).)

21. .
Ensayo que se basa en la reducción
metabólica del Bromuro de 3-(4,5-
dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol
(MTT) realizada por la enzima
mitocondrial succinato-DH en un
compuesto coloreado de color azul
(formazan), permitiendo determinar la
funcionabilidad mitocondrial de las
células tratadas.
¿Para qué se realizó
esto en la
investigación?
1. Viabilidad, proliferación y
supervivencia celular.
2. Función mitocondrial
3. Actividad de las
oxidorreductasas mitocondriales

22. Se analizó mediante métodos de fluorescencia (DCFDA) la presencia de
especias reactivas de oxígeno en todas las células (las que fueron tratadas con
el FA complex, y las que no).
Fisiológicamente
Cantidades normales
 Esenciales para la producción de energía.
 Síntesis de compuestos
 Fagocitosis
 Transducción de señales.

23.  Envejecimiento
 Cáncer
 Enfermedades coronarias
Patológicamente
Cantidades
aumentadas
Detectar estado
fisiológico, o patológico
según la evaluación de
ROS y estrés celular
¿Para qué se realizó esto
en la investigación?

24. ES UNO DE LOS MÉTODOS MÁS PODEROSOS PARA DETECTAR UNA
PROTEÍNA EN PARTICULAR EN UNA MEZCLA COMPLEJA DE PROTEÍNAS.
Se utiliza un
anticuerpo
específico para
detectar la
proteína de
interés
El resultado aporta
información sobre el
peso molecular de la
proteína y su cantidad
relativa en la muestra
Las proteínas de
la muestra se
separan mediante
electroforesis en
gel en función del
peso molecular

25. En este método se usan 2 anticuerpos diferentes,
uno específico para la proteína buscada y el otro
unido a una enzima informadora (reporter).

26. Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo
a su movilidad electroforética, es decir en función de su talla, o peso molecular
SDS-PAGE
SDS : Dodecilsulfato Sódico
PAGE : Electroforesis en gel de
poliacrilamida

27.  Phospho-specific (Ser139)
 Total histoneH2AX(CellsignalingTechnology)
 β-actin (BDBios- ciences)
¿Para qué se realizó
esto en la
investigación?
Para detectar proteínas específicas
como las histonas, especialmente la
H2AX

28. Poderosa técnica para la medición de la masa de las moléculas como las
proteínas y los péptidos.
¿Para qué se realizó
esto en la
investigación?
Análisis de lípidos
carbonilados y la
modificación de
proteínas
Tiempo inversamente proporcional a la masa

29. .
Es una base de datos donde están las interacciones conocidas y
predichas de las proteínas humanas.
Las interacciones incluyen asociaciones directas (físicas) e indirectos
(funcionales).
Adicionalmente da información de proximidades en el genoma, fusión de
los genes, datos bioquímico y moleculares, en resumen recolecta la
información conocida de las proteínas.
¿Para qué se realizó
esto en la
investigación?
Para tener un patrón establecido
de las características propias de
una proteína y poder analizar las
modificaciones que presenta

31. • Lípidos intracelulares tinción Rojo Nilo y fluorescencia
• Incremento de AG en la células HepG2
• El CoCl2 no presento ningún efecto acumulativo de lípidos ni el control ni
en los hepatocitos con AG.

33. • Alteración en la forma del núcleo en células
tratadas con AG y Ag/CoCL2
• Los oxoLPP mostraron gran intensidad tanto
en células tratadas con AG y AG/CoCL2
• CoCL2 no mostro significancia con esta
prueba
A
B
fueron evaluados con
CHH y microscopio de
fluorescencia

36. • Se identificaron 3 bandas especificas por su intensidad en las muestras de
Ag y AG/CoCL2
• Al analizar las bandas con MS se identificaron especies de Histonas
H2A,1 H2B,1 H3,3 Y H4

40. Regulan
metabolismo
lipídico
Reparación de
ADN
Splicing
Remodelación de
cromatina
Proteínas del
citoesqueleto

41. • Células tratadas con AG mostraron tener grandes cantidades de oxoLPP y
LPP modificadas (en los grupos de AG y AG/CoCL2)
• Se pudieron evidenciar modificaciones estructurales en hnRNPs lo que
lleva
Se ha demostrado que se afectan en estrés oxidativo en
enfermedades hepáticas tal con la NAFLD y la
esteatosis

43. RESEARCHERS HYPOTHESIS PROOF
B.J. Stewart, J.R. Roede,
J.A. Doorn, D.R. Petersen
Demostration of excessive
acumulation of lipid in hepatocytes is
present in liver’s diseases (from
HepG2 cell)
M.Marmunti,M.Gavazza,
A.Catalá
Lipid peroxidation is one of the main
events induced by oxidative stress
and it can be particularly damaging
to the liver nuclear membrane rich in
PUFA.
C.T. Shearn, D.S. Backos,
D.J. Orlicky, R.L. Smathers-
McCullough, D.R. Petersen,
K.S. Fritz, P. Reigan.
Although that liver can metabolized
reactives oxoLPP has been shown
that high level of modifications of
liver and hepatocyte proteins due
reactive oxoLPP
J.J. Galligan, K.L. Rose,
W.N. Beavers, S. Hill, K.A.
Tallman, W.P. Tansey, L. J.
Marnett
Modifications of H3-H4 generate
disruption in nucleosome formation
which may challenge chromatic
dynamics and histone turnover

44. • An accumulation of free fatty acids, induces an increase in the
concentration of reactive oxygen species, which in turn generates an
activation of lipid peroxidation mechanism. This last, produces
reagents (oxoLPP) involved in the destruction of the core protein
structures triggering disease states, such as non alcoholic steatosis.
• With a clear knowledge of pathophysiological steatosis mechanisms,
we could generate better and more efficient treatments, that can
generate a stop in the disease progression reducing consequences,
such as the steatohepatitis and cirrhosis.
• Based on the same foundation of the previous one, we conclude that
its important to investigate and treatments to prevent and avoid the
disease

45. • Lodish, Harvery; Berk, Arnold; Matsudaira, Paul; Kaiser; Krieger, Chris A;
Scott, Matthew; Zipursky, S. Lawrence; Darnell, James. “Biología celular y
molecular”. 5. ed. Buenos Aires, Argentina. Editorial médica panamericana,
2005. pp: 313, 235, 187-189, 92-95.
• Martínez Sánchez, Lina María; Vargas Grisales, Natalia; Toro Montoya, Andrés
Eduardo; Pamplona Sierra, Ana Paulina; Queveda Orrego, Esteban. “Biología
molecular”. 7. ed. Medellín, Colombia. Editorial Universidad Pontificia
Bolivariana, 2014. pp: 139-140.
• Anavi, Sarit; Ni, Zhixu; Tirosh, Oren; Fedovora, Maria. “Steatosis-
induced proteins adducts with lipid peroxidation products and
nuclear electrophillic stress in hepatocytes”. Redox biology. 2 de
Abril del 2015. 158-168

46.  http://cdn.intechopen.com/pdfs-wm/38477.pdf
 http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/digestion/liver/histo_hcytes.html
 http://www.cyberlipid.org/perox/oxid0006.htm
 http://www.aegastro.es/sites/default/files/archivos/ayudas-
practicas/56_Enfermedad_hepatica_grasa_no_alcoholica.pdfc
 http://www.bvs.sld.cu/revistas/ibi/vol27_2_08/ibi03208.htm
 http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf
 http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lia/baiz
abal_c_rh/capitulo4.pdf

49. María Alejandra
Aristizábal Giraldo