D. Molecular

1. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
Profa. Dra. Ruscaia Dias TeixeiraProf. Dr. Paulo Queiroz

2. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Avaliação da estrutura dos componentes do
DNA

3. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
É um campo emergente na área de análises
clínicas laboratoriais.

4. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Detecta Agentes infecciosos (Ex: HPV)

5. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Detecta alterações genéticas do próprio organismo
Auxilia no diagnóstico e prognóstico dessas doenças

6. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Identifica pessoas (criminosos ou cadáveres)
• Existem sequências que se repetem no nosso genoma.
• O número de repetições pode variar de pessoa para pessoa
• Ao reconhecer sítios com pedaços de DNA com variados números de
cópias em série, podemos distinguir duas pessoas .

7. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Determina paternidade ou graus de parentesco.
(filhos possuem metade dos alelos maternos e metade dos alelos do pai)

8. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Auxilia na determinação da terapia a ser utilizada
Tratamento com GH
Mutação no gene SHOX Mutação no gene GHR
Insensibilidade ao GH
TRATAMENTO DE BAIXA ESTATURA

9. DIAGNÓSTICO MOLECULAR
Avalia a suscetibilidade a doença
Gene APP
Síntese de PPA em cérebros normais
Beta – amilóide – clivagens anormais da PPA
Placas amielóides
Associado ao maior risco de desenvolvimento de
Alzheimer
Alzheimer

10. CONCEITOS IMPORTANTES

11. GENE

12. Splicing

13. MUTAÇÃO GÊNICA
Gene com sua função alterada, levando ao aparecimento de
doenças.
Adição ou subtração de bases
Substituição de bases

14. ANEMIA FALCIFORME

15. ALELOS
Forma alternativa do mesmo gene
Ocupam o mesmo locus em cromossomos homólogos

16. cDNA
DNA sintetizado a partir de uma molécula de
mRNA, cujos íntrons já foram removidos,
numa reação catalisada pela enzima
transcriptase reversa.

17. PRIMERS

18. SÍTIOS DE RESTRIÇÃO

19. REPETIÇÕES EM TANDEM
• Sequências curtas
• Idênticas ou similares
• em tandem (agrupadas) ou dispersas pelo
genoma.
• em tandem: DNAs satélite
• No repetições: variam em cada indivíduo,
tornando-os únicos.
• Formam uma espécie de “impressão
digital” do DNA.

20. INDICAÇÃO DOS TESTES
MOLECULARES

21. DIAGNÓSTICO
1. Doenças infecciosas
2. Doenças genéticas
3. Câncer

22. 1. DOENÇAS INFECCIOSAS
• Detecção rápida de microrganismos de:
– Crescimento lento
• Mycobacterium kansaii – lesões pulmonares
– Não cultiváveis
• Treponema pallidum (bactéria agente da Sífilis)
• bacilo Mycobacterium leprae (micobactéria agente da lepra)

23. 1. DOENÇAS INFECCIOSAS
Determinação de resistência antimicrobiana
Streptococcus pneumoniae X penicilina

24. 1. DOENÇAS INFECCIOSAS
Monitoramento de doenças através da quantificação da
infecção.

25. 2. DOENÇAS INFECCIOSAS
TESTES MOLECULARES MAIS COMUNS:
• Avaliação de carga viral para:
– HIV
– Hepatite C

26. 2. GENÉTICA HUMANA
• Diagnóstico das doenças monogênicas:
– identificação do gene afetado
– mutação responsável pela doença
• Fibrose cística (gene CFTR – produção de muco e sucos gástricos)
• Síndrome de Marfan (gene Fibrilina – formação das fibras elásticas)
• Distrofia muscular de Duchene (gene distrofina – permeabilidade celular das
fibras musculares)

27. 2. GENÉTICA HUMANA
Identificação de portadores heterozigotos
Genótipos :
Hb AS (heterozigoto de Hb S) - traço falciforme
Hb AA (padrão normal)
Hb SS (homozigose de Hb S) – anemia falciforme
Hb SC (dupla heterozigose de Hb S e Hb C) – doença
falciforme
Doenças falciforme

28. 2. GENÉTICA HUMANA
Diagnóstico pré-natal
• líquido amniótico – descamações fetais

29. 2. GENÉTICA HUMANA
Predisposição a doenças genéticas
Três alelos do gene APOE: ε2, ε3 e ε4.
Indivíduos com uma cópia do alelo ε4: risco 2X a 3X de desenvolver Alzheimer tardia.
Homozigotos ε4ε4: risco 6X
Apolipoproteina E
VLDL

30. 2. GENÉTICA HUMANA
• TESTES MAIS COMUNS:
– Trombofilia hereditária (trombose)
– X Frágil (retardo mental)
– Microdeleção do Y (infertilidade masculina)

31. 3. CÂNCER
CARCINOMA MEDULAR DA TIREÓIDE
– Detecção de mutações no proto-
oncogene RET (regulam o ciclo celular)
em uma criança com histórico familiar
– Permite a tireoidectomia profilática
– Elimina o risco de câncer tireoidiano
que pode ser fatal.

32. 3. CÂNCER
POLIPOSE ADENOMATOSA FAMILIAR
– Mutações no gene APC determinam elevadíssimo risco
de desenvolvimento de tumores colorretais malignos.
– Testes deste gene indicarão:
• quais indivíduos da família necessitarão de monitoragem
• quais não terão de se preocupar

33. 3. CÂNCER
Filha
Mãe
Câncer de mama
BRCA1 mutante
50% Gene mutante 50% Gene normal
10% de risco85% de risco

34. 3. CÂNCER
LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA
Proteína quimérica ABL
 Atividade tirosina quinase

35. 3. CÂNCER
LLC
• Identificação de pacientes com pior prognóstico.
– Portadores de translocação do braço longo do 13 - confere prognóstico
favorável e sobrevida de 11 anos
– Alterações envolvendo braço longo do 11 – confere sobrevida de 6,6
anos
– Portadores de deleção do braço curto do 17 - sobrevida de 2,5 anos

36. VANTAGENS E DESVANTAGENS
DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR

37. VANTAGENS
1. BAIXA CONCENTRAÇÃO DO AGENTE
Identifica, caracteriza e quantifica
concentrações extremamente pequenas de
DNA/RNA de organismos patogênicos.

38. VANTAGENS
2. VERSATILIDADE DE AMOSTRAS:
• Sangue periférico
• Fluidos corporais (Líquor, derrame pleural, líquido pericárdico)
• Materiais obtidos através de punção (Medula óssea)
• Tecidos frescos
• Tecidos embebidos em parafina.

39. VANTAGENS
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO
– MOMENTO DA COLETA
• INÍCIO DA INFECÇÃO
• FASE CRÔNICA

40. VANTAGENS
3. VIABILIDADE DO MICROORGANISMO
– CONSERVAÇÃO E TRANSPORTE
• Material conservado - Temperatura ambiente
• Sob refrigeração (gelo seco ou reciclável)

41. VANTAGENS
4. TEMPO CURTO DE CRESCIMENTO DE
MICROORGANISMOS
– GENOTIPAGEM
– DIAGNÓSTICO RÁPIDO
– VERIFICAÇÃO DE RESISTÊNCIA A DROGAS

42. VANTAGENS
5. Alta especificidade
6. Diagnóstico rápido, abreviando e otimizando o tratamento.
7. Diagnóstico qualificado com aprimoramento no manejo da
doença.
8. Diagnóstico confiável
9. Diagnóstico com melhor reproducibilidade de resultados.

43. DESVANTAGENS
– CONTAMINAÇÃO DA AMOSTRA
– PRESENÇA DE INIBIDORES
– VIABILIDADE DOS AGENTES RNA: RNAse
– CUSTO
– PADRONIZAÇÃO

44. TÉCNICAS MOLECULARES

45. TÉCNICAS MOLELCULARES
1. Southern blot
2. Hibridização in situ
3. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
4. PCR
5. Fingerprinting
6. Eletroforese em campo pulsado (PFGE)
7. Microarranjos
8. Sequenciamento

46. 1. SOUTHERN BLOT
• Emprega sondas de DNA com homologia à
sequência do DNA-alvo em estudo.

47. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU
• Baseia-se no emparelhamento de 2
sequencias de DNA e uma RNA marcada
com Digoxigenina.
• Permite a visualização de uma sequência
nucleotídica especifica em células e
tecidos.

48. 2. HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

49. Passos da Hibridação in situ
1. Coleta do material biológico
2. Fixação e desidratação
3. Hibridação
4. Detecção da sonda por imunohistoquímica
5. Revelação com um substrato de fosfatase alcalina

50. SONDA

51. 3. RFLP
• RFLP - Polimorfismo de comprimento de
fragmentos de restrição.
• Mutações podem alterar o DNA entre um
sítio de clivagem e outro.
• Isto gera diferentes formas (polimorfismos)
do mesmo trecho de DNA.

52. 3. RFLP
• Raia 1: pessoa normal - dois fragmentos (alelos) do mesmo tamanho.
• Raia 2: Portador - um alelo sadio e o outro com a mutação.
• Raia 3: possui os dois alelos mutados.

53. 4. PCR
• PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)
• É uma técnica que amplifica uma sequência
específica de DNA,
• Objetivo: tornar a sequencia de DNA
abundante e disponível para diversas
técnicas de biologia molecular.

54. PCR Ciclos
• Desnaturação: 94°- 95°C
• Anelamento: 55°- 65°C
• Extensão: 72°
• Número de ciclos: 25-40

55. PCR - Desnaturação
A desnaturação é o primeiro passo do PCR,
no qual as fitas de DNA são separadas
através de aquecimento a 95°C.

56. PCR - Anelamento
O anelamento é o processo através do qual
duas sequencias de nucleotídeos são
ligadas através da formação de pontes de
hidrogênio. Na reação de PCR, o
anelamento se dá através da ligação dos
primers com o DNA Alvo, a temperatura de
55°C.

57. PCR Primers
Os primers são sequências de 15 a 30
nucleotídeos, fita única, que são usadas
para flanquearem as extremidades da
região a ser amplificada. Marcam o início e
o fim da sequência-alvo.

58. PCR Taq DNA Polimerase
Amplifica o DNA a partir do anelamento com os
primers, na presença de Mg, a altas
temperaturas.

59. PCR Ciclos

60. PCR Requerimentos
• Cloreto de Magnésio: .5-2.5mM
• Tampão: pH 8.3-8.8
• dNTPs: 20-200µM
• Primers: 0.1-0.5µM
• DNA Polimerase: 1-2.5 units
• DNA Alvo:  1 µg

62. Variações da PCR
a. RT-PCR,
b. nested PCR,
c. multiplex PCR,
d. RAPD-PCR
e. PCR real time.
µmicra

63. RT-PCR
• Utiliza uma enzima chamada transcriptase
reversa para converter uma amostra de
RNA em cDNA .
• Antes da etapa de amplificação por PCR,
• Permitindo estudo de vírus de RNA e
análises de expressão gênica.

64. Nested-PCR
 É uma técnica na qual são realizados diversos ciclos de
amplificação com um grupo de primers
 O produto dessa amplificação é re-amplificado, utilizando-se
outro grupo de primers dirigidos para uma seqüência que se
encontra dentro da seqüência amplificada pelo primeiro grupo
de primers.
 Atualmente, raros são os estudos realizados utilizando esta
técnica.

65. MULTIPLEX PCR
• É uma reação de amplificação
• Detecta múltiplas sequências-alvo numa
mesma amostra.
• Vários pares de primers
• Desenvolvida para detecção simultânea de
vários patógenos.

66. Multiplex-PCR
• Vantagens :
– Diminuição da intensidade e do período de
trabalho laboratorial
– Redução do número de reagentes
– Redução dos custos

67. Multiplex-PCR
• Desvantagens desta técnica em relação ao
PCR:
– Redução da sensibilidade de detecção

68. RAPD-PCR
 “Random Amplified Polymorphic DNA”
 Primer único e pequeno (usualmente de 10 a
15 bases), aleatório
 Amplificação do DNA genômico em condições
de baixa estringência
 Não sendo necessário o conhecimento prévio
da região de ligação do primer.

69. RAPD-PCR
• Quando submetidos à PCR, estes
iniciadores arbitrários resultarão na
amplificação de uma ou mais seqüências de
DNA
• Gerando conjuntos de fragmentos que
funcionam como marcadores genéticos
• O número e o tamanho destes fragmentos
são à base de tipagem de um isolado
bacteriano (DESTRO, 1995).

70. RAPD-PCR
• A principal vantagem do RAPD sobre o PCR
tradicional é a possibilidade de detectar
polimorfismos do DNA sem a necessidade
de conhecimento prévio da seqüência de
nucleotídeos de um gene relevante ou do
DNA alvo (MASLOW et al, 1993).

71. PCR EM TEMPO REAL
• Permite que a amplificação e a detecção ocorram
simultaneamente, num sistema fechado,
• Termociclador que possua sistema de
monitoramento de emissão de fluorescência.
• Esta técnica é empregada para quantificação de
amostras, como para testes de carga viral e
monitoramento de doença residual mínima.

72. PCR em Tempo Real
 Possui sistema tubular para detectar o acúmulo de
produtos de PCR
 Composto de um termociclador com câmeras detectoras
refrigeradas para detecção de luz fluorescente, em que a
ressonância emitida é diretamente proporcional à
intensidade de fluorescência e por sua vez ao número de
produtos amplificados.

73. TÉCNICAS PARA
DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES
• Existem várias técnicas que usam o PCR.
• Algumas destas técnicas baseiam-se nas
diferenças de mobilidade eletroforética de
fragmentos com sequências de DNA
selvagens e mutantes.

74. TÉCNICAS PARA
DIAGNÓSTICO DE MUTAÇÕES
• Existem ainda outras técnicas que se baseiam na
clivagem de bases não pareadas em
heteroduplexes.
• Técnicas que utilizam a detecção de alterações na
proteína transcrita por um determinado
fragmento de DNA.

75. APLICAÇÕES DO PCR
1. Rápida amplificação de um gene específico ou de um
exon de um determinado gene como a primeira etapa
para rastreamento de mutações não caracterizadas:
– PCR para amplificações de exons específicos do DNA genômico
– RT-PCR para análise de transcritos

76. APLICAÇÕES DO PCR
2. Rápida genotipagem de regiões dos genes
que são polimórficas:
I. Digestão da região polimórfica com enzimas de restrição sítio
específica.
II. Flanqueamento de primers ao sítio de restrição polimórfico,
III. Amplificação da região do polimorfismo

77. APLICAÇÕES DO PCR
3. Diagnóstico de mutações conhecidas através
da discriminação alélica pelo tamanho
• Pequenas deleções ou inserções em alelos podem ser
detectadas por PCR.
• Exemplo: deleções no alelo mais comum que causa a fibrose
cística (DF508)

78. APLICAÇÕES DO PCR
4. Diagnóstico de mutações conhecidas através
da susceptibilidade a enzima de restrição:
• Mutações que mudam um sítio de restrição podem ser
detectadas, pela digestão do produto de PCR com a enzima
de restrição específica

79. 5. Fingerprinting
• O “fingerprinting” é um método para
caracterização e discriminação de
microrganismos de origem alimentar (JAY,
2005).
• Cada vez mais utilizado para fazer
inferências sobre níveis de variação
genética dentro e entre populações
naturais (LYNCH, 1990);

80. 6. PFGE
• Eletroforese em Gel de Campo Pulsado
• Uma das técnicas mais utilizadas para
análise epidemiológica da maioria das
bactérias patogênicas.
• É um método derivado da eletroforese
convencional do DNA, em gel de agarose,
sendo a principal diferença a mudança
repetida da orientação do campo elétrico.

81. PFGE
Imagem: http://pcrfilme.vilabol.uol.com.br/

82. PFGE
• Esta mudança provoca o re-arranjo da
estrutura conformacional da molécula,
permitindo a sua migração no gel.
• A técnica de PFGE revelou-se capaz de
diferenciar cepas da bactéria obtidas a
partir de diferentes municípios.

83. 7. MICROARRANJOS
• São lâminas com uma alta densidade de
seqüências de DNA
• Permitem estudos de expressão gênica,
• Analisa uma grande quantidade de genes
ao mesmo tempo, utilizando sondas de
cDNA.

85. 8. SEQUENCIAMENTO
• Detecta mutações em genes conhecidos.
• Permite analisar cada uma das bases de
determinada sequência de DNA.

86. 8. SEQUENCIAMENTO
Uso de algumas técnicas que buscam alterações

Após a identificação da região gênica que apresenta
alguma alteração

Tal região é submetida ao sequenciamento para
confirmação e determinação da mutação.

87. CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Possibilitou uma grande evolução nas análises de rotina
de laboratórios clínicos e industriais.
• Organismos de cultivo difícil ou impossível tornaram-se
passíveis de serem analisados.
• Exames citogenéticos convencionais estão sendo
substituídos pela ferramenta molecular.
• Determinação de predisposição para certos tipos de
câncer e doenças cardiovasculares têm se tornado
realidade.
• Revolucionou a ciência e a prática da medicina e áreas
correlatas

88. DESAFIOS
• Tornar as variadas técnicas de biologia
molecular, uma alternativa viável à rotina
laboratorial, principalmente em relação ao
custo e recursos humanos.

89. HISTÓRICO DA BIOLOGIA
MOLECULAR

90. 1953
Watson e Crick propuseram a
estrutura de
dupla-hélice do DNA
1957
Arthur Kornberg isolou a
DNA polimerase 1958
Matthew Meselson &
Franklin Stahl: Replicação
semi-conservativa do DNA

91. 1971
David Baltimore & Howard
Temin demonstram a
presença da RT em vírus
capaz de sintetizar DNAfd
a partir de RNAfs
1975
Fred Sanger: Seqüenciamento de DNA
baseado em terminação de cadeia por
incorporação de ddNTPs
1985
Kary Mullis: Permite obter (in vitro)
grandes quantidades de uma
sequência
específica de DNA

92. 1989
Descoberta daTaq
polimerase
termoestável no
lago
do “Yellowstone
National Park”
1995
Haemophilus influenzae:
primeiro
genoma seqüenciado1998
C. elegans: Primeiro genoma
completo
de um animal
2000
Rascunho doGenoma Humano
Imagens: Paola Cardarelli -XVI ENAAL

93. OBRIGADO!