Isolation and characterization of the glucocerebrosidase from human placental tissue

1. Biochimie-Génétique Humaine:
Analyse d’articles Réalisé par: Encadré par:
TILIRINE Khalid
BEN ALLA Safa M. Mohamed BAAZIZ.
BOUTASKNIT Abderrahim
Isolation et caractérisation de la
glucocérébrosidase à partir du tissu
placentaire humain
UCAM-FSSM
Master Biologie Environnement et Santé
Département du Biochimie
2014/2015

2. Plan du travail

3. * La β-glucocérébrosidase encore appelée glucosylcéramidase,
Acide β-glucosidase , et D-glucosyl-N-acylsphingosine
glucohydrolase, est une hydrolase qui catalyse le clivage de la
liaison entre l'unité céramide et le résidus de glucose d'un
glucocérébroside.
* Elle se trouve dans les lysosomes
* responsable de la dégradation d’un lipide, le glucocérébroside (ou
glucosylcéramide).
* La masse = 59,7 kDa.
* Les mutations de cette enzyme provoquent une maladie
lysosomale caractérisée par l'accumulation de glucocérébrosides
dans les lysosomes maladie de Gaucher
La Glucocérébrosidase?

4. La Maladie de Gaucher
Un déficit en GCase (diminution de la qualité et/ou de la quantité de la
protéine)accumulation de glucocérébroside normalement éliminés ou recyclés
par l’organisme (surcharge lysosomale).
 La maladie classée en trois types ayant des différences en terme d’âge
d’apparition et de gravité : {I (95 sur100 cas) II et III}
Symptomatologie:
Une sensation de fatigue
une augmentation de volume du ventre,
des douleurs des os et des saignements du nez
des gencives ainsi que des bleus (hématomes) qui apparaissent en l’absence
de traumatisme.

5. Objectifs de l’étude
 l'isolement de la glucocérébrosidase à partir de tissu placentaire
des patients atteints par la maladie de Gaucher.
 la purification de la glucocérébrosidase à partir de cette source
humaine
 Indiquer certaines propriétés catalytiques et physiques de la GC
ase purifiée.

6.  D[1-14C]Glucocérebroside synthétisé.
 Glucosyl [1-14C] sphingosine préparé à partir de la glucocérébrosidase marquée.
 Taurochlorate de sodium et dithiothreitol
 Séphadex G-200 et et séphadex-CM (pharmacia fine chemicals Inc)
 La Cellexe-P (consiste à une cellulose phosphate).
 Tissus placentaires atteints de Gaucher (1.7 kg).
 Solutions et tampons organiques (ethanol, méthanol, 4,dinitro-benzène 1%, … ).
Les procédures expérimentales:
#

7. #
La chromatographie sur couche mince:
* Utilisation de 1-Butanol-acide acétique et de l’eau
un seul point avec 0,6RF
* Le composé a été dissout à 162°.
* Les placentas humains frais ont été immédiatement placées dans la
glace, délivrées et conservées à 0° jusqu’à ce qu’ils seront traités.

8. L’analyse de l’activité enzymatique :
- L’activité de GCase a été déterminée par incubation de l’enzyme dans 0.2
ml de solution de tampon phosphate de potassium 75 mM. PH 6,4 avec
0,12% de Cutscum (détergent non ionique utilisé pour solubiliser) +
taurocholate de sodium+glucocérébroside.
- Après incubation à 37° pendant 1h, la réacation a été freinée par l’ajout
d’1ml de la solution du sérum humain de l’albumine dans l’eau (10 mg/ml
w/v) et 0.1 ml de la solution de l’acide acétique et du taurocholate.
- Le [1-14C] Glucose clivé par l'enzyme était récupéré et sa radioactivité a
été déterminée.
- La protéine a été déterminée par la méthode de Lowry et al.

9. La purification de la GC
 Pour l’extraction, Les Placentas frais réfrigérés ont été libérés du sang fixé par
rinçage avec de l’eau distillée froide.
 Le tissu placentaire doux est passé à travers un hachoir à viande
 Broyage, et mise en suspension dans 2 volumes (W / v) d'eau distillée.
 Agitation pendant 1 heure à 4°
 Centrifugation à 10 000 x g pendant 20 min.
 Décantation et mise en suspension de la matière sédimentée.
 homogénéisation dans un mélangeur Waring pendant 1 min à 4°
 La matière homogénéisée a été centrifugée à 10 000 x g pendant 25 min

10. Fractionnement solide du sulfate d’ammonium
 247 g/l de sulfate d’ammonium + l'extrait d'enzyme sous agitation.
Centrifugation à 10 000 x g pendant 30 min.
Élimination du matériel sédimenté +ajout du 70,25g/l de sulfate d'ammonium.
Après 1h d’agitation et centrifugation  apparition d’un film sur la surface
du liquide (Il contient la majeure partie de l'activité de la GC ase).
Écumassions et mise en suspension dans le tampon citrate-phosphate (pH6).
Dialyse pendant 24h
Centrifugation à 40 000 X g pendant 30 min

11. La filtration sur gel- chromatographie échangeuse d’ions
250 ml de la solution posés sur une colonne (9 x 55 cm) de Sephadex G-200
équilibrée par Citrate-P.
L’élution de la GCase à partir de la colonne avec 2 litres d'un gradient
linéaire de NaCl allant de 0 à 500 mM
les fractions ont été rassemblées et appliquées à une colonne (4 x 50 cm) de
CM-sephadex A-25.
Quand la [NaCl]=250 mM Apparition de l’enzyme
Les fractions enzymatiques sont dialysées à pH 5.
L’échantillon est placé sur une colonne (2,5 x 50 cm) de Cellex-P.
Élution avec 1L de NaCl (0 à 500mM).
Dialyse et Chromatographie à nouveau deux fois sur des colonnes (2 x 20
cm) de CM-Sephadex .
Dans toutes les étapes de chromatographie l'enzyme a été élué comme un
seul pic symétrique à partir de laquelle la majorité de l'enzyme dans des
fractions les plus actives ont été rassemblées pour les étapes ultérieures

12. Résultats
Table I: Effet du détergent sur l'extraction des glucocérébrosidase de placenta humain
Le taurocholate de sodium a été nécessaire pour l'extraction efficace
de l’enzyme.
Cutscum n’était pas nécessaire pour l'extraction mais nécessaire dans
les étapes de fractionnement

13. Résultats
FIG. 1. Gel de filtration a été réalisée sur des
colonnes (1,6 X 84 cm) de Sephadex G-200
Le profil d'élution est hétérogène
Le profil d'élution est homogène

14. Résultats
Tableau II: La purification de la glucocérébrosidase à partir de placenta humain
La récupération de la glucocérébrosidase purifiée à la présente procédure
d'ensemble en moyenne d'environ 5% de l'activité de départ.

15. Résultats
FIG. 2: profils protéiques obtenus par électrophorèse sur gel de
dodécyl sulfate de sodium.

16. Résultats
FIG. 3 : Estimation de la masse moléculaire de la glucocérébrosidase
par électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium

17. Résultats
Tableau III: Activité de divers enzymes hydrolytiques dans l'extrait placentaire non
fractionnée et en préparation de la glucocérébrosidase hautement purifiée

18. Résultats
Tableau IV: Rapport entre l'activité de la glucocérébrosidase et l’activité
4-méthylumbelliféryl-β-D-glucosidase à différents stades de purification
Le rapport de l'activité catalytique au lipide naturel augmenté à travers les
étapes de purification

19. Résultats
Tableau V: L'hydrolyse de divers substrats par glucocérébrosidase purifiée
de placenta

20. Fig. 6: Inhibition de l'hydrolyse du (1-14C) glucocérébroside
par p-aminophényl-β-D-glucopyranoside.
Résultats

21. Discussion
*Les critères de l’homogénéité indiquent que la
préparation ainsi obtenu dans cette recherche est
hautement purifier.
*Le produit final est enrichi 4100 fois plus qu’un
extrait de placenta non fractionnée
*L’extrait brute de placenta est non contaminé par 14
enzymes lysosomale.
*Une seule bande de GCase apparait sur gel de dodycil
sulfat.

22. *Les détergents sont nécessaire pour l’extraction
enzymatique et la résolution chromatographique.
* le glycérol et le dithiothréitol maintenu la stabilité de
l’enzyme.
*La taille moléculaire de l'enzyme varie
considérablement en fonction de la méthode
d'extraction et de l'état de pureté.
Discussion

23. Le rendement de l’enzyme purifier par les techniques ainsi
utilisée était faible (5%).
Pour un isolement d’enzyme plus efficace, une nouvelle
technique était mis en évidence.
les perspectives d'études de remplacement d'enzyme
nécessitera des méthodes plus pratiques et efficaces d'isolement.
Étant donné que la Chromatographie d'affinité a été appliquée
avec succès pour l'isolement de β-galactosidase.
Discussion

24. *Des études sont actuellement en cours dans
l'espérons d’obtenir l’enzyme pure sous une
forme et en quantités appropriées pour évaluer
l'efficacité de la thérapie de remplacement de la
maladie de Gaucher.
*La thérapie de remplacement enzymatique
permettra d’évité un bon nombre des risques et
des complications rencontrées actuellement dans
la transplantation d'organes.
Discussion

25. *Traitement substitutif
Par La béta-glucocérébrosidase
L’enzyme de synthèse ayant obtenu l’autorisation de mise
sur marché est l’imiglucréase (CérézymeR). Produit par
culture de cellule de mammifères CHO.
Sous le traitement substitutif une amélioration clinique
apparait après 3 à 6 mois.
Le traitement substitutif reste actuellement le traitement
de référence et doit être proposé en premier intention.
Discussion

26. *Traitement par réduction de substrat
Miglustat, administré par voie orale, est utilisé en
deuxième intention dans la MG de type 1 en cas
d’impossibilité d’utiliser le traitement enzymatique
substitutif.
Discussion

27. Le disfonctionnement de certaine enzymes mènent à des
maladies métabolique plus ou mois grave, que ce soit les
maladies génétique du métabolisme des glucides ou celle
touchant le métabolisme des lipides ou les maladies touchant
les mitochondries.
La purification et la caractérisation des enzymes mise en jeux
par des techniques plus sophistiquées permet de connaitre
leurs structures et les propriétés catalytiques.
Thérapie enzymatique