1. Medición de antibióticos en
fluidos corporales.
JUANDO
BACTER.

2. Introducción
La designación de antibióticos actualmente se realiza teniendo en cuenta sus
propiedades particulares de distribución.
Penetración de la barrera Vida media mas larga
hemato-encefálica
Con la disponibilidad de las pruebas rápidas la medición en sangre y otros
fluidos es factible, conveniente y ampliamente practicables.
Aminoglucósidos acceso a
Absorción vía oral: NSA
Unión a proteínas plasmáticas: baja
(10%-50%)
 Ototoxicidad
 Nefrotoxicidad
Black et al. La Ototoxicidad se relaciona tanto con niveles picos como valle, valor de p <0.05

3. Diferentes estudios demuestran que
la eficacia se correlaciona con el nivel
pico de los antibióticos en suero.
La toxicidad se ha correlacionado
tanto con los niveles pico como el
valle de los niveles en suero.
Es difícil probar la que toxicidad
ocurre a un nivel particular en
sangre.
Toxicidad/relación
Terapéutica de los
Aminoglucósidos mas
Utilizados.

4. Como elegir un prueba
La FDA publica los métodos oficiales para las
preparaciones farmacéuticas. No existe una guía para la
determinación clínica de antibióticos en sangre y
tejidos. Como resultado, hay un grupo heterogéneo de
ensayos y condiciones para que cada laboratorio elija.
• The American Society for Clinical Pathology (chicago IL) tiene controles de
calidad que son enviados periódicamente.
• La técnica de difusión en agar es sencilla, el único parámetro que necesita
un rígido control es la preparación del estándar de antibiótico.

5. Ventajas y desventajas de las distintas pruebas para
cuantificar antibióticos en fluidos corporales.
Elección del método
• Tipo de laboratorio
• Numero de muestras procesadas
• Equipos disponibles
• Facilidad del laboratorio
• >10 muestras por día : automatizado

6. Manipulación de las muestras
Obtención de procesar lo antes posible Cada antibiótico pierde
las muestras su potencia de forma
diferente.
Almacenamiento
AG>estables que
< 4°C mismo día penicilinas
-20°C, 4 días
-70°C
Tejidos
2-3 horas -20°C >24 h -70°C

7. Fluidos diferentes a sangre
No están estandarizados.
• Diferentes tipos y cantidades de proteínas
• Valores de pH diferentes
• Componentes químicos
• Componentes celulares
No hay un método para analizar antibióticos en
todos los fluidos.

9. Ensayos microbiológicos
Se basa en la determinación del nivel de un
antibiótico, por una respuesta microbiológica
definida a una serie de concentraciones de
antibióticos por una cepa de un
microorganismo analizado.

10. Método en agar
3 categorías generales.
Uni, bi y tridimensional.
• Unidimensional: usa un tubo capilar, se
vierte el agar y se deja secar. La
suspensión del antibiótico se pipetea
dentro de la superficie del agar
endurecido, y se forman zonas de
inhibición en una dimensión.
 Ideal para bacterias aerobias.
 Muy usado en Japón, poco conocido en
los laboratorios clínicos del mundo.
o Desventajas: no puede
automatizarse, consume mucho
tiempo, compleja preparación.
Es usado en población pediátrica donde la
muestra obtenida es muy poca. Se usa
poco, se usa mas bi o tridimensional.

11. Bidimensional: el antibiótico se difunde directamente contra la
pared de la bacteria analizada.
• Se considera bidireccional porque la cantidad de antibiótico
que se difunde desde la fuente es igual en todo el agar.
Tridimensional: el antibiótico viaja directamente bajo el botón
de la placa de petri así como a largo de la superficie del agar
La mayor desventaja de los ensayos microbiológicos es que
genera una pendiente empinada, especialmente para los
ensayos con antibióticos Aminoglucósidos.

12. Elementos que influyen en los ensayos
microbiológicos
Deben contralarse las condiciones que afectan la acción de los antibióticos y el
crecimiento de los microorganismos.
• Diseño: debe asegurarse que la producción de los halos de inhibición
alrededor del disco es directamente proporcional a la cantidad de antibiótico
presente en esta fuente. Debería tenerse certeza que la respuesta es lineal
dentro de los rangos normales encontrados en muestras clínicas.
• Medio: existen 11 medios diferentes, lo cual no es un factor independiente,
pero se relaciona con el método de ensayo y el organismo analizado. Un
medio que presenta bueno resultados para un organismo, puedo no ser el
optimo para otro microorganismo.
• Estándar de antibióticos: es el factor mas critico en los ensayos. Cada
antibiótico tiene diferente actividad a diferentes valores de pH.
Los antibióticos son disueltos en los buffer apropiados a altas concentraciones, se
almacenan en alícuotas de 1 ml a (-20°C) no por mas de 3 meses.
o Aminoglucósidos: estables
o Penicilinas: lábiles

13. • La dilución del buffer se hace en el fluido apropiado para su uso.
• Los antibióticos deben ser pesados en balanza analítica y calcular la potencia en
mg del polvo.
• Es importante también que no halla una segunda sustancia antibiótica en el
estándar de antibióticos, porque los materiales farmacéuticos pueden contener
conservantes que no son recomendados, se usa solo en emergencias.
• Para la determinación de niveles de antibióticos en sangre, debe ser usada sangre
o suero.
Otros fluidos
o Suero equino
o Suero bovino
o Suero humano normal
o Suero humano inactivado a 56°C por 30 min
o Suero bovino albumina SBA
o Suero fetal de ternero.

14. • Factores físicos: el tamaño
del disco puede afectar la
eficiencia del ensayo. Si se
usa el disco recomendado
740-E se debe añadir 20 µl
de muestra. El máximo
crecimiento de este disco es
de 25 µl.
• Técnica es 5 a 6 veces mas
sensible que la que usa
discos de papel.

15. Elección del organismo
Es simple la búsqueda de un solo antibiótico, pero cuando se
buscan varios debe tenerse mas precaución, se debe tener en
cuenta el sinergismo y antagonismo.
La forma optima seria separar los compuestos químicos por
electroforesis o cromatografía.
• Los organismos mas comúnmente usados para la medición de
antibióticos en sangre son:
Bacillus sp. S.aureus Sarcina lutea. Streptococcus sp.
Providencia sp. Clostridium sp. Klebsiella sp.
Hongos y bacterias Bacterias bioluminiscentes

16. Ensayo unidimensional.
• Bacterias aeróbicas, poco crecimiento para el ensayo.
Medio: agar nutritivo 1% de peptona, pH 7.8 (varia dependiendo del
antibiótico) 19 ml se dispensa para almacenamiento.
Procedimiento: se incuba toda la noche en tripticasa soya, se diluye
1:100 y se agita bien. Antes de usar se calienta a 48°C.
Se añade 1ml de la suspensión bacteriana a 19 ml del agar, agitar bien.
Pipetear el agar dentro de tubo cónico de 3mm, se deja secar (cada
estándar se deposita en un tubo diferente).
Se repite 3 veces cada estándar igual que el suero del paciente. El
crecimiento debe ser de 1.5 mm por encima de las capas del agar.
Se incuban los tubos a 37°C toda la noche.
Interpretación: se mide la distancia donde el punto de crecimiento del
paciente y el agar se encuentran (meñisco) en mm. Los resultados
se calculan en las graficas de dosis-respuesta. En el eje Y se traza la
concentración del antibiótico y en el X la distancia de inhibición.

17. Ensayo tridimensional.
Se ajusta el medio Difco al pH 7.9. puede ser
almacenado en 25 ml de crecimiento por 1 mes.
Antes del ensayo, se descongelan alícuotas de 0.4 ml
a 50°C, se añade crecimiento de Klebsiella en agar
tripticasa soya. Se mezcla la solución y se sirve en 2
placas de petri plásticas.
Procedimiento: se pipetea 0.002 ml (2µl) de suero del
paciente con pipetas estériles desechables, sobre
discos 740-E.

18. Calculo de los resultados: se usan cálculos de curvas de dosis respuesta (diámetro vs
concentración), sin embargo, si el rango de concentración es 4 veces mayor, se grafica la
concentración del antibiótico vs el cuadrado del diámetro.
Resultado de los métodos microbiológicos: 4 horas o menos.

19. Método en caldo
• Método turbidimetria.
Turbidimetria se refiere a cualquier técnica que
dependa de los cambios de crecimiento de la
bacteria en el medio liquido como medida de
crecimiento en solución antibiótica.
El cambio en el numero de bacterias es medido
directamente por fotometría o por la producción
de cambios en el pH o la relación de CO2.

20. Formula de crecimiento por unidad vs porcentaje de
transmisión de la densidad óptica de la suspensión
bacteriana.
Log (I0/I): OD: (N) [Eab)/2.3]
I0: cantidad de luz que sale de la suspensión
OD: densidad óptica
N: masa bacteriana
E: coeficiente de extinción de las partículas
a: área de efectividad óptica de la partícula
b: densidad de la suspensión

21. Abbott MS-2
Dispositivo que monitorea continuamente el crecimiento
bacteriano en unidades de densidad óptica. Usado para
determinar niveles de antibióticos en sangre bajo condiciones
clínicas usando el análisis de curva de crecimiento.
Fase logarítmica, sembrado bajo
los compartimientos donde c/u
tiene un disco. Diodos de luz roja
3 h, DO se
grafica.
El medio se inocula dentro
de las cubetas.

22. Ensayo de cambio de pH
• Los antibióticos actúan interfiriendo el crecimiento y/o
metabolismos de las bacterias.
• Los cambios en la actividad metabólica de la bacteria bajo
la influencia de los antibióticos puede ser usada para medir
la concentración de antibióticos.
• P.pio: >antibióticos en contacto con la población bacteriana
> será la modificación de las vías metabólicas.
• Si no esta el antibiótico presente, la bacteria crece y habrá
cambio de pH por metabolización de un componente
(azúcar, urea..etc.), si el antibiótico se añade se afecta el
sistema del microorganismo y los cambios en el pH son
mínimos.

23. Ensayo de medición de ATP.
• Utiliza ATP endógeno de una cepa
de Klebsiella edwardsii.
• Se inocula el estándar con la cepa
analizada en paralelo con el suero
de los pacientes. Después de 2
horas de incubación a 37°C, se
extraen los tubos con una
solución de EDTA/H2S04 y la
cantidad de ATP bacteriano es
determinado en un
espectrofotómetro. Una grafica
de concentración de antibiótico vs
cantidad relativa de ATP es usada
para calcular la cantidad de
antibiótico en sangre.

24. Bioluminiscencia
Envuelve el uso de la luminiscencia
bacteriana para determinar la
actividad antibiótica en suero.
Procedimiento: la actividad bacteriana
en el suero es inactivado por
calentamiento a 56°C por 30 minutos.
Se añade 0.8 ml de suero, 0.2 ml de
NaCl al 10% y buffer 1.5% . El pH final
es de 7.9. después de 10 minutos de
pre incubación a 30°C, se añade
proflavina para una concentración
final de 1.5 µg/ml a un pH de 7.9 o 25
µg/ml a pH 6.0. se incuban los viales
con movimientos suaves a 30°C. se
lee la luminiscencia con un
fotómetro/fotomultiplicador que es
universalmente proporcional a la
concentración del antibiótico. Proflavina se intercala en el
ADN e induce el sistema de
luminiscencia de bacterias
mutantes en la oscuridad.

25. Concentración inhibitoria en suero, y
concentración bactericida en suero.
• Procedimiento: se ajusta la concentración entre 105 106 UFC/ml en cada tubo. 0.1
ml de cada dilución 1:100 y 1:1000 son inoculadas en la superficie del agar
apropiado. Después de incubar toda la noche se calcula el inoculo de el numero de
UFC entre 20-200 colonias. El resto del procedimiento se maneja muy parecido a la
CIM/CBM.
• Se añade 1ml de suero al primer tubo, se mezcla bien, se añade 1 ml del tubo 1 al
2 y se mezcla, 1 ml del tubo 2 se añade al tubo 3. esto continua hasta el ultimo
tubo 12, que recibe 2 ml de caldo. Se remueve entonces 1 ml de este tubo a uno
estéril para el control de esterilidad del medio. La concentración de la bacteria
queda entre 105 106 UFC/ml.
• Se incuba 18-24 horas a 35 °C.
• La menor concentración del suero del paciente que presente una completa
inhibición visible de crecimiento será el SIC.
• La concentración se convierte a títulos por esta formula. Titulo: 1/dilución.
• La SBC es la menor concentración del suero que mata el 99.9%.
• No es muy usado por la dificultad de calibrar el inoculo, el medio de cultivo,
tiempo de incubación…etc.

26. Ensayos químicos directos Ensayos radio-enzimáticos
• Sirven para determinar • La adenilación y la acetilación
sustancias son las bases de los ensayos
químicas, sustancias activas radio-enzimáticos.
y los subproductos. Ya que • La cantidad de adenilación y
acetilación producida en el
reacciona con grupos caldo es directamente
químicos específicos de la proporcional a la cantidad de
molécula antibiótica. Es útil antibiótico en la solución.
en farmacéutica cuando se • La sonicación es una técnica
analizan sustancias rápida y sencilla para obtener
puras, pero in vivo mas del las enzimas tan eficiente como
el shock osmótico.
95% no conservan su estado
• Las enzimas son estables por
nativo. 24 horas a 4°C y 30 días a (-
• No son realizados de rutina 20°C) con BSA.
el los laboratorios clínicos.

27. Análisis químico de la fluorescencia
directa
Procedimiento
• Una molécula es fluorescente
cuando puede recibir luz en una • 0.2 ml de la muestra (sangre o
longitud de onda y la emite en otra no) se mezcla con 0.4 ml de
longitud de onda. buffer fosfato y se extrae
Ventajas y desventajas completamente con 2.5 ml de
Los otras sustancias usadas para el acetato de amilo. Se
ensayo pueden también producir centrifuga. Se transfiere el
fluorescencia. sobrenadante a una cubeta de
Son mucho mas sensibles que los Fluorometría. Se añade 0.6 ml
ensayos químicos y es capaz de dar de el reactivo fluorescente. Se
resultados no solo en agita por 5 min. La
nanogramos, sino también en fluorescencia es color
picogramos por mililitros. Puede turquesa. Se montan también
distinguirse entre antibióticos
activos e inactivos. estándares y controles.

28. Ensayos inmunológicos
Los altos costos de los equipos para realizar RIA a retrasado mucho estas
técnicas, además, debe mantenerse grandes cantidades de stock de
isótopos radioactivos, lo que impulso el uso de isótopos no
radioactivos.
Todas las RIAs para antibióticos emplean 2 pasos en general:
1. Envuelve 3 componentes: Ag radiomarcado (Antib), Ac alta avidez
contra Ag y Ag radiomarcado (Antib px)
2. Cuando se alcanza el equilibrio se debe determinar la cantidad de
anticuerpos ligados. La medición de estas uniones determina la
cantidad de antibiótico.
Tiene como ventaja la alta especificidad, se presentan algunas reacciones
cruzadas entre antibióticos de la misma familia pero nunca entre
diferentes.

29. Inmunoensayos no radioactivos.
La enzima o la sustancia fluorescente se une al antígeno o anticuerpo
de tal manera que la actividad del compuesto original no es
afectado sensiblemente.
La diferencia entre RIA y ensayos no radioactivos es la manera como se
evidencia la aglutinación. Se mide la velocidad de reacción de la
enzima y no mide la actividad radioactiva.
v: V [S/(S + Km)]
v: medida de la velocidad de reacción
S: concentración del sustrato
Km: constante
Mucho mas sensible que los métodos espectofotométricos.
La base de estos ensayos es la preparación de un conjugado hapteno-proteína,
donde el hapteno (Antib) y la proteína (enzima) funcionan naturalmente.

30. Técnica de inmunoensayo de enzimas
múltiples.
Fue desarrollado del método de • Ventajas
radicales libres que emplea un Pequeño volumen de muestra
conjugado para detectar Analiza todos los antibióticos
medicamentos por
espectrofotometría y No se requiere mucha habilidad
resonancia de electrones. Automatizable
Requiere equipo muy Resultados rápidos
especializado. • Desventajas
La principal reacción es la Altos costos
alteración de la actividad de
una enzima cuando el Analiza los medicamentos uno a
conjugado medicamento- uno
enzima es ligado al anticuerpo. Puede tener interferencia con
Esto causa un cambio medible otros metabolitos
en la cantidad de productos Puede medir metabolitos
liberados. inactivos

31. Análisis cromatográficos
• Utilizan la habilidad de un Cromatografía liquida de alto
compuesto en un tipo de rendimiento
solución para ser
selectivamente removido de Método de referencia de
esta solución dentro de un aplicación en clínica.
ensayo absorbente y
cuantitativo. De elección para análisis de
• Ventajas: analiza los penicilinas y cefalosporinas.
compuestos por separado, es Es usado en laboratorios
rápido y sensible (0.5-1 μg/ml) modernos para medir agentes
• Desventajas: personal experto, anticonvulsivantes y
caro, uso de varios antiarrítmicos
procedimientos de extracción.

32. Pasos básicos HPLC
• Extracción del medicamento con un solvente
especifico.
• Separación de el medicamento en la fase
sólida por HPLC.
• Detección del efluente de fase sólida por
fotometría.
• Cuantificación de la cantidad de antibiótico
presente por análisis de picos altos o picos de
área de análisis.

33. Cromatografía de gases-liquido. Cromatografía de capa delgada.
Fue usada para realizar • Es usado en laboratorios
ensayos de antibióticos que clínicos para separar
pueden ser volátiles. compuestos de alto peso
Pasos: molecular en compuestos
biológicamente activos.
• Extraer el medicamento del
suero Resonancia magnética
• Conversión del espectroscópica nuclear.
medicamento a su forma No están disponibles en clínica
volátil. pero están bajo investigación.
• Separación por GLC Cuando los núcleos giran en un
• Detección por campo magnético son
ionización, captura de irradiados por un segundo
electrones…etc. campo magnético
perpendicular, que cambia sus
• Detección del alineaciones a un nuevo
medicamentos por altos campo.
picos o picos de área.

34. Mycobacterium tuberculosis
Para que se miden niveles de medicamentos antituberculosos en
los fluidos??
• Prevenir reacciones toxicas que ocurren en medicamentos
como cicloserina y Aminoglucósidos
• Determinar si la concentración en tejidos o fluidos es
adecuada para una terapia efectiva
• Monitorear el cumplimiento de los pacientes
• Monitorizar el metabolismo de ciertas drogas, como el
fenotipo acetilador de Isoniazida.
• Para investigación.
• Daño renal, mala absorción, problemas hepáticos…etc.

35. Mycobacterium tuberculosis
• El monitoreo de los medicamentos antituberculosos es
realizado en todos los casos de aislamientos MDR en el
NJCIRM, por la necesidad de asegurar que la concentración
máxima del medicamento exceda al MIC de la cepa MDR
• Se usan 3 técnicas para detectar los niveles de
medicamentos antituberculosos en materiales biológicos:
1. Bioensayos
2. Métodos fluorométricos y espectofotometricos
3. Métodos cromatográficos

36. Las muestra de suero deben ser recolectadas en las horas picos de acción
del medicamento antituberculoso.

37. También otros factores pueden interferir en la
absorción y en la biodisponibilidad del
medicamento:

38. Preparación de la muestra
• La incorrecta preparación de la • Dependiendo del método de
muestra puede resultar en la análisis, las proteínas pueden
perdida de la actividad de l ser removidas por tratamiento
medicamento como con 5 o 10% acido
consecuencia de un tricloroacetato o sulfato de
combinación con una proteína amonio. Se almacenan a 4 °C
o conversión del por 2 semanas o congeladas a
medicamentos a formas (-20°C) por tiempo indefinido.
inactivas o a derivados lábiles. • Las muestras recolectadas
• es necesario estabilizar la para análisis de Rifampicina
Isoniazida a (-20°C) porque, el deben ser tratadas con acido
compuesto se pierde ascórbico y almacenadas a (-
rápidamente por la Activación 20°C) por hasta 3 meses.
de proteínas. Estas proteínas • ETB, PIZ, PAS, ETH, PTH no son
generalmente interfieren en afectados por otras proteínas
los métodos fluorometricos. u oxidación.

39. Los bioensayos son sensibles, no tan caros, pero requieren experiencia, puede
demorarse algunos días y son relativamente imprecisos. No pueden distinguir
entre los metabolitos activos e inactivos.
Isoniazida Rifampicina
• La acetilación de Isoniazida es la principal y • Es un compuesto relativamente
clínicamente mas importante vía metabólica de
su metabolismo. El producto principal que del inestable en agua , y a un pH de 2-3
metabolismo de la Isoniazida es N-acetil- la Rifampicina es fácilmente
isoniazida que es catabolizada por la N-acetil- hidrolizado a 3-formil-rifampicina y
transferasa en el hígado e intestino.
• Los niveles de N-acetil-transferasa en un
1-amino-4-metilpiperazina. En pH
paciente influyen en la concentración de alcalino, en presencia de aire
monoacetil-hidrazona y diacetil-hidrazona en la atmosférico, la Rifampicina se oxida
orina, y esta es la base para determinar los fácilmente a rifampicina-quinona.
ensayos del estado acetilador de pacientes.
• El ensayo espectrofluorometrico puede medir • Sin embargo, la solución de
isoniazida y acetilisoniazida y solo requiere un Rifampicina puede ser estabilizado
volumen de 200 µl.
• Se ha descrito también HPLC para medir la
por la adición de ascorbato de
concentración de isoniazida y acetilisoniazida en sodio (200 µg/ml) y soluciones de
fluidos y tejidos. Rifampicina en dimetilsulfoxido (10
• El método El-Sayed and Islam fue usado para mg/ml) son estables por varias
medir específicamente la concentración de
Isoniazida y acetilisoniazida para el fenotipo semanas.
acetilador.

40. Pirazinamida Etambutol
• El ensayo espectrofotométrico
• Cuando los pacientes están ha sido descrito para la
siendo tratados con cuantificación de Etambutol en
Pirazinamida , se pueden liquido cerebro espinal y orina.
Las muestras son extraídas con
monitorear los valores de la cloroformo y reveladas con
concentración tanto de azul de bromotimol.
Pirazinamida como de acido • Se ha descrito bioensayos para
pirazinoico para prevenir determinar Etambutol en
suero.
efectos adversos, • Una variedad de cromatografía
principalmente de gases y cromatografía de
hiperuricemia. masa fueron descritos para
medir la concentración de
Etambutol en fluidos
biológicos.

41. Aminoglucósidos Etionamida
Estreptomicina, Capreomicina • Se describe un método
y kanamicina pueden ser HPLC que distingue entre
medidos de fluidos Etionamida, protionamida y
biológicos y tejidos usando los metabolitos sulfoxido. se
un bioensayo descrito por observo que estos método
McClatchy. son capaces de medir
Estreptomicina y kanamicina concentraciones menores
pueden ser medidos por de 10-50 ng/ml.
inmunoensayo de
polarización de
fluorescencia (FPI) usando
el sistema comercial Abbott
TDX.