O documento discute várias técnicas de diagnóstico virológico, incluindo métodos de amplificação como PCR em tempo real, extração de ácidos nucleicos, e aplicações destas técnicas para detecção e quantificação de vírus.
2. real-time PCR
Técnicas
Biologia
Molecular
TÉCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
Detecção do genoma viral
Futuro do diagnóstico de vírus
Necessidade de equipamento e pessoal treinado
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 2
3. real-time PCR
Técnicas
TÉCNICAS Biologia
Molecular
Métodos de Amplificação
Polimerase Chain Reaction (PCR)
Restriction Fragment Lenght Position (RFLP)
Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)
Reverse Transcriptase - Polimerase Chain Reaction (RT- PCR)
Real-Time PCR
Sequenciação
Métodos de Hibridização
Captura Híbrida
Southern Blot
Hibridização em tiras
CHIPS
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4. 4
Extracção Ácidos Nucleicos
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
5. real-time PCR
Técnicas
Extracção Ácidos Nucleicos Biologia
Molecular
Líse alcalina;
Neutralização;
Precipitação de Proteínas e detritos celulares;
Purificação Ácidos Nucleicos
Precipitação
Eluição em colunas
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6. real-time PCR
Técnicas
Extracção Ácidos Nucleicos Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 6
7. real-time PCR
Técnicas
Extracção Ácidos Nucleicos Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 7
9. real-time PCR
Técnicas
Extracção Ácidos Nucleicos Biologia
Molecular
Avaliação Ácidos Nucleicos por Espectofotometria UV
Estimar a concentração de DNA e RNA a ~260nm.
[dsDNA] ≈ A260 x (50 µg/mL)
[ssRNA] ≈ A260 x (40 µg/mL)
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10. 10
Técnicas de Amplificação AN
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11. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 11
12. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
Amplifica um fragmento de DNA especifico;
Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir obter milhões de
cópias do fragmento pretendido;
Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de DNA de
sequência conhecida;
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
Região Alvo
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13. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
MISTURA DE REACÇÃO:
DNA
Primers: Oligonucleótidos de cadeia simples com
sequência complementar às sequências alvo do
ADN (idealmente 20-24 nucleótidos);
Buffer: Solução tampão para estabilizar a reacção;
Mg2+ (Magnésio): Ajuda na ligação dos nucleótidos
e estabilidade da Taq;
dNTP’s: Nucleótidos livres (A, T, C, G);
Taq polimerase: Enzima termo-estável (+/-72ºC)
que efectua a cópia da sequencia alvo do ADN.
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15. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
PROCEDIMENTO
4º Passo: Repetição dos passos anteriores por 30-45 ciclos no máximo;
FINAL: Obtenção de 2nºciclos copias do fragmento alvo.
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16. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
Electroforese em Gel de Agarose:
Separa as moléculas (proteínas ou ácidos núcleicos) de acordo com o seu
peso molecular;
DNA e RNA possuem carga eléctrica negativa migram para o pólo positivo
(quanto mais pequenas mais migram);
Brometo de Etídeo que se vai intercalar na dupla hélice de ADN e possibilitar
a visualização dos fragmentos quando em exposição a luz UV;
Amostras da PCR carregadas no gel;
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18. real-time PCR
Técnicas
Polymerase Chain Reaction Biologia
Molecular
APLICAÇÕES
Detecção de sequências específicas de DNA viral
Detecção AdV em amostras respiratórias
Detecção EBV em biópsias Nasofaringe
Detecção JCV em LCR
...
DESVANTAGENS
Altamente sensível a contaminação com quantidades residuais de DNA.
Falsos positivos e artefactos.
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19. Restriction real-time PCR
Fragment Técnicas Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 19
20. Restriction real-time PCR
Fragment Técnicas Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela actividade
diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência
específica)
Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição
Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’
3’ – (…) TGACT (…) – 5’
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21. Restriction real-time PCR
Fragment Técnicas Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular
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22. Restriction real-time PCR
Fragment Técnicas Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 22
23. Restriction real-time PCR
Fragment Técnicas Length
Biologia
Polymorphism (RFLP) Molecular
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais
Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
Detecção variantes HPV – Associação com patologias
Detecção variantes EBV – Associação com agressividade
...
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Sensível a contaminação por DNAses
Artefactos
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24. Single Strand real-time PCR
Conformation
Técnicas
Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular
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25. Single Strand real-time PCR
Conformation
Técnicas Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de polimorfismos/mutações;
Diferenças de sequência de um único nucleótido são suficientes para que
cadeias simples de DNA adquiram uma conformação tri-dimensional
diferente;
Gel de Poliacrilamida permite correr as amostras (apenas em cadeia
simples/desnaturadas) em função da sua conformação.
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26. Single Strand real-time PCR
Conformation
Técnicas
Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 26
27. Single Strand real-time PCR
Conformation
Técnicas Biologia
Polymorphism (SSCP) Molecular
APLICAÇÕES
Detecção de variantes Virais
Detecção variantes CMV – Associação com resposta a terapia
Detecção variantes HPV – Associação com agressividade
...
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Contaminações
Leitura gel poliacrilamida
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
28. real-time PCR
Técnicas
ReverseTranscriptase PCR Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 28
29. real-time PCR
Técnicas
ReverseTranscriptase PCR Biologia
Molecular
Baseada na técnica da PCR;
Análise de expressão de mRNA;
Usa a enzima Transcritase Reversa para converter o mRNA em cDNA;
Protocolo PCR para aumentar exponencialmente o número de cópias do
mRNA;
mRNA: 5’ – AUGCGUAUCGAUAUCGAUAAGCUA (…) AAAAAAAAA – 3’
TTTTTTTTTT – 5’
Molécula Alvo
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30. real-time PCR
Técnicas
ReverseTranscriptase PCR Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 30
31. real-time PCR
Técnicas
ReverseTranscriptase PCR Biologia
Molecular
VANTAGENS
Permite fazer análise quantitativa
da expressão de mRNA.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 31
32. real-time PCR
Técnicas
ReverseTranscriptase PCR Biologia
Molecular
APLICAÇÕES
Expressão mRNA viral
Avaliação actividade viral
DESVANTAGENS
Todas as do PCR
Contaminações
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
33. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 33
34. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
PCR was traditionally limited to end-point analysis
using agarose gels
Limitations of end-point PCR:
Poor precision
Low sensitivity
Short dynamic range
Low resolution
Size-based discrimination
Ethidium bromide for staining does not allow
for accurate quantitation
Requires post-PCR processing
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 34
35. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Monitoriza a fluorescência
emitida durante a reacção de
PCR como um indicador da
produções de amplicões em
cada ciclo de PCR;
Monitorização em tempo real;
Detecção da amplificação nos
estádios precoces da reacção –
maior precisão;
Alvo: DNA ou RNA
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 35
36. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 36
37. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 37
38. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
SYBR Green I Sonda de Hibridação Sonda TaqMan
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 38
39. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Exponential
If 100% efficiency – exact doubling of
products. Specific and precise
Linear PCR phases in linear view
High variability. Reaction components Plateau
are being consumed and PCR products
are starting to degrade.
[DNA] Linear
Plateau
End-point analysis. The reaction has
stopped and if left for long – Exponential Cycle #
degradation of PCR products.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 39
40. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Baseline – The baseline phase contains
all the amplification that is below the
level of detection of the real time
instrument.
Threshold – where the threshold and
the amplification plot intersect defines
CT. Can be set manually/automatically
CT – (cycle threshold) the cycle number
where the fluorescence passes the
threshold
Rn – (Rn-baseline)
NTC – no template control
DRn is plotted against cycle numbers to
produce the amplification curves and
gives the CT value.
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 40
41. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
CT = threshold cycle
Fracção dos ciclos de
PCR a partir da qual é
detectado sinal
Quanto maior a quantidade de DNA, menor o valor de Ct
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 41
42. real-time PCR
Técnicas
RealTime PCR Biologia
Molecular
Aplicações
Quantificação carga viral
Monitorização carga viral
Monitorização terapêutica
VANTAGENS
Amplificação monitorizada em tempo real
Ausência de processamento pós PCR (baixo risco de contaminação)
Requer pouca quantidade de amostra (DNA ou RNA)
Rápido, Específico, sensível e reprodutível
Quantitativo
Barato
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 42
43. real-time PCR
Técnicas
Sequenciação Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 43
44. real-time PCR
Técnicas
Sequenciação Biologia
Molecular
Usada para determinar a sequência de nucleótidos
Método de sequenciação mais utilizado – método didesoxi
Adição de didesoxinucleótidos que terminam a reacção de polimerização
3’ OH – necessário para adição do nucleótido seguinte
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 44
45. real-time PCR
Técnicas
Sequenciação Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 45
46. real-time PCR
Técnicas
Sequenciação Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 46
47. 47
Técnicas de Hibridização
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II
48. real-time PCR
Técnicas
Técnicas de Hibridização Biologia
Molecular
Alvo – DNA ou RNA
Utilização de sondas
específicas
Possibilidade de diferenciação
entre subtipos de vírus
Técnicas
Captura Híbrida
Hibridização em tiras
Southern Blotting
CHIPS
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 48
49. real-time PCR
Técnicas
Captura Híbrida Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 49
50. real-time PCR
Técnicas
Captura Híbrida Biologia
Molecular
Principio da técnica
Hibridização de Ácidos Nucleicos
Amplificação sinal por Quimioluminescência
Método semiquantitativo
Método
Hibridização amostras positivas com sondas específicas
Complexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplaca
Reacção com anticorpo secundário conjudado com FA
Adição de reagente e detecção por quimioluminescência
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 50
51. real-time PCR
Técnicas
Captura Híbrida Biologia
Molecular
45 minutes
at 65ºC
60 minutes
at 65ºC
15 minutes
30 minutes
60 minutes
agitação
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 51
52. real-time PCR
Técnicas
Southern Blot Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 52
53. real-time PCR
Técnicas
Southern Blot Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 53
54. real-time PCR
Técnicas
Hibridização em tiras Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 54
55. real-time PCR
Técnicas
Hibridização em tiras Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 55
56. real-time PCR
Técnicas
Chips Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 56
57. real-time PCR
Técnicas
Chips Biologia
Molecular
Tipagem de vírus:
HPV, HCV, HIV
Tubos ou lâminas com sondas
específicas para cada subtipo
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 57
58. real-time PCR
Técnicas
Chips Biologia
Molecular
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 58
59. We ask the lab for a diagnosis,
expecting a yes or no, but often
end up with just a maybe…
Professor Mark Pallen
Aula 4 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte II 59