Présentation réalisée dans le cadre d'une UE du master 1 MABS. Exemple de réalisation personnelle de Powerpoint.

1. Pretseille Emmanuelle
Master MABS 2011-2012
Diagnostic moléculaire des MO
Determination of Escherichia coli O types by
allele-specific polymerase chain reaction :
application to the O types
involved in human septicemia
Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E.
N°57 (2007)

2. Plan de la présentation
Introduction
- Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
- Sérotypage de l'antigène O
Objectif et démarche R&D
Mise au point de la méthode de sérotypage
- Sélection des sérotypes et des souches
- Détermination des groupes phylogénétiques des souches
- Design d'amorces et mise en place de l'essai
- Validation de l'essai
- Résolution des discordances
Conclusions

3. Introduction
Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
Escherichia coli
- Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
- Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)

4. Introduction
Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
Escherichia coli
- Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
- Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
- Aussi un agent pathogène !
Pathologies dues à E. coli
Intestinales Diarrhées
Turista
TIA
Dysenterie
SHU
Extraintestinales Infections urinaires (80%)
(ExPEC) Septicémies (20%)
E. coli est responsable de pathologies intestinales mais aussi extra-intestinales.

5. Introduction
Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
Escherichia coli
- Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
- Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
- Aussi un agent pathogène !
Capsule
Antigène K
Antigène O
Paroi
Antigène H
Flagelle Antigènes K, O et H d'E. coli

6. Introduction
Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
Escherichia coli
- Bacille Gram - , ɣprotéobactérie
- Bactérie de la flore commensale intestinale humaine (80%)
- Aussi un agent pathogène !
Capsule
Antigène K
Antigène O Pouvoir
Paroi pathogène
Antigène H
Flagelle Antigènes K, O et H d'E. coli

7. Introduction
Sérotypage de l'antigène O
Limites
Techniques de
Sérogroupe
sérotypage Coût Résultats Applications
→ Diagnostic
→ Épidémiologie Agglutination
→ Vaccinologie ? avec des
+++ + +++
antisérums
(Biorad)
Agglutination
avec des billes ++
+++ +
de latex + Ac
anti-O (Oxoid)
Milieux
chromogènes + ++ 0157:H7
(BD)
La détermination Vidas ICE/ECO
phénotypique ++ +++ O157:H7
(Biomérieux)
de l'antigène O d'E. coli

8. Introduction
Sérotypage de l'antigène O
Limites
Techniques de
sérotypage Coût Résultats Applications
Méthode classique
Agglutination
avec des
+++ + +++
antisérums
(Biorad)
Agglutination
Test d'agglutination + avec des billes ++
+++ +
de latex + Ac
anti-O (Oxoid)
Milieux
chromogènes + ++ 0157:H7
(BD)
La détermination Vidas ICE/ECO
phénotypique ++ +++ O157:H7
(Biomérieux)
de l'antigène O d'E. coli

9. Introduction
Sérotypage de l'antigène O
Limites
Techniques de
sérotypage Coût Résultats Applications
→ Nécessité d'une Agglutination
nouvelle technologie : avec des
- coûteuse, + fiable et +++ + +++
antisérums
+ universelle (Biorad)
Agglutination
avec des billes ++
+++ +
de latex + Ac
anti-O (Oxoid)
Milieux
chromogènes + ++ 0157:H7
(BD)
La détermination Vidas ICE/ECO
++ +++ O157:H7
phénotypique (Biomérieux)
de l'antigène O d'E. coli

10. Introduction
Sérotypage de l'antigène O
Limites
Techniques de
sérotypage Coût Résultats Applications
→ Nécessité d'une Agglutination
nouvelle technologie : avec des
- coûteuse, + fiable et +++ + +++
antisérums
+ universelle (Biorad)
Agglutination
avec des billes ++
+++ +
de latex + Ac
anti-O (Oxoid)
Approche moléculaire
Milieux
chromogènes + ++ 0157:H7
(BD)
La détermination Vidas ICE/ECO
++ +++ O157:H7
phénotypique (Biomérieux)
de l'antigène O d'E. coli

11. Introduction
Sérotypage de l'antigène O (suite)
Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart
gnd galF
Synthèse de l'antigène O
Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.

12. Introduction
Sérotypage de l'antigène O (suite)
Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart
gnd galF
Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.
Techniques de sérotypage Limites
- Uniquement pour certains sérotypes
PCR basées sur les SNP de rfb
- Difficulté d'application en diagnostic
- Long
« rfb-RFLP »
- Difficulté d'interprétation des résultats
La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli

13. Introduction
Sérotypage de l'antigène O (suite)
Opéron rfb (6 à 19 gènes) JUMPstart
gnd galF
Le cluster rfb regroupe les gènes de synthèse de l'antigène O.
Techniques de sérotypage Limites
- Uniquement pour certains sérotypes
PCR basées sur les SNP de rfb
- Difficulté d'application en diagnostic
- Long
« rfb-RFLP »
- Difficulté d'interprétation des résultats
La détermination génotypique de l'antigène O d'E. Coli

14. Objectif et démarche R&D
Objectif
→ Mise au point d'un méthode de sérotypage de l'antigène O
basée sur une PCR multiplexe allèle spécifique de la portion 5' du
locus rfb : application aux Escherichia coli impliquées dans les
septicémies humaines
Hémocultures
(Biomérieux)
E.coli
Réplicons
LPS et
Une approche antigène O
moléculaire pour le ADN
sérotypage Thermocycleur
(Eppendorf)

15. Objectif et R&D Sélection des sérotypes et des souches
Démarche R&D
Détermination des groupes
Légende phylogénétiques
des souches
Pré-requis
Mise au point Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Devenir Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

16. Plan de la présentation
Introduction
- Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
- Sérotypage de l'antigène O
Objectif et démarche R&D
Mise au point de la méthode de sérotypage
- Sélection des sérotypes et des souches
- Détermination des groupes phylogénétiques des souches
- Design d'amorces et mise en place de l'essai
- Validation de l'essai
- Résolution des discordances
Conclusions

17. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

18. Mise au point de la méthode de sérotypage
Sélection des sérotypes et des souches
→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine
Sérotypes étudiés
O1 O7 O18
O2 O12 O25
O4 O15 O75
O6 O16 O157
Une sélection ciblée sur les sérotypes majeurs en bactériologie sanguine

19. Mise au point de la méthode de sérotypage
Sélection des sérotypes et des souches
→ Choix des 12 sérotypes les plus fréquents en septicémie humaine
→ Un panel de 370 Escherichia coli aux caractères variés
Souches
pathogènes :
Souches non Collections de - urosepsis,
pathogènes, souches - infections
commensales Ex : ECOR urinaires chez
Ex : Nissle 1917 vétérans,
- ExPEC

20. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

21. Méthode de sérotypage
Détermination des groupes phylogénétiques des souches
Analyses phylogénétiques 4 groupes d'E.coli
Groupe
Type d'E. coli
phylogénétique
A Commensales
B1 NR
B2 ExPEC
D ExPEC
La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique.

22. Méthode de sérotypage
Détermination des groupes phylogénétiques des souches
Analyses phylogénétiques 4 groupes d'E.coli
Groupe
Type d'E. coli
phylogénétique
A Commensales
B1 NR
B2 ExPEC
D ExPEC
La pathogénicité d'E.coli semble liée à son groupe phylogénique.
Comment le déterminer ?

23. Méthode de sérotypage
Détermination des groupes phylogénétiques des souches
(suite)
2 méthodes utilisées
PCR triplex MLST
→ Existence de séquences ADN
spécifiques aux groupes
phylogénétiques
chuA, yjaA et TspE4C2
Mise en évidence par :
PCR triplex et Southern blot

24. Méthode de sérotypage
Détermination des groupes phylogénétiques des souches
(suite)
2 méthodes utilisées
PCR triplex MLST
Extrait de Clermont et al. (2000)
Détermination du groupe
phylogénétique par PCR triplex

25. Méthode de sérotypage
Détermination des groupes phylogénétiques des souches
(suite)
2 méthodes utilisées
PCR triplex MLST
→ Existence de séquences ADN Multilocus sequence typing
spécifiques aux groupes
phylogénétiques
chuA, yjaA et TspE4C2
Détermination de profils alléliques
Mise en évidence par :
PCR triplex et Southern blot

26. MLST Détermination du groupe phylogénétique par MLST
polB trpA
Amplification
Chromosome
icd E. coli trpB par PCR Séquençage des
(fragment ~450nt) fragments obtenus
pabB
putP
Sélection de 6 gènes de ménage
Identification des
allèles de chaque
locus
Obtention des
Arbre profils alléliques
phylogénétique (ou sequence type) Compilation
des données

27. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

28. Méthode de sérotypage
Design des amorces
→ 2 souches phylogénétiquement
éloignées par sérotype
Extrait de Clermont et al. (2007)
Une sélection de souches pour
des résultats discriminants

29. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique

30. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Amplification du cluster rfb par Long-range PCR
gnd Opéron rfb JUMPstart
gnd.f JUMPstart.r
Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR

31. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Amplification du cluster rfb par Long-range PCR
gnd Opéron rfb JUMPstart
gnd.f JUMPstart.r
Fragment correspondant à rfb ( ~5000-17000 pb)
Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR

32. Long Range PCR Le kit Expand Long Template PCR System (Roche)
Extrait de Roche (2005)
Mix de 2 ADN polymérases
Enzyme Origine Activité Caractéristiques
Thermostable
Thermus
Taq Polymérase 5'3' Spécifique
aquaticus
Sensible
Thermococcus Polymérase 5'3' Thermostable
Tgo
gorgonarius Exonucléase 3'5' Fidèle
Un mix de polymérase « idéal » pour la Long-range PCR

33. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Séquençage de l'extrémité 5' de rfb
Séquençage par électrophorèse capillaire des
fragments PCR obtenus

34. Principe du séquençage par électrophorèse capillaire :
Séquençage étapes majeures (Applied Biosystems)
- Cycle de séquençage par technologie BigDye terminator
Extrait de Applied Biosystems (2009)
- Electrophorèse capillaire
→ Séparation des fragments
selon leur taille (charge) via un
polymère dénaturant POP &
détection de la fluroscence du
Extrait de Applied Biosystems (2009) ddNTP terminal
Résultats de l'électrophorèse capillaire

35. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Séquençage de l'extrémité 5' de rfb
Séquençage par électrophorèse capillaire des
fragments PCR obtenus
Séquences nucléotidiques interprétables d'~300-800 pb
pour le design d'amorces O spécifiques

36. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Choix de l'amorce reverse O spécifique
→ Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de
celles obtenues par de novo sequençage

37. Méthode de sérotypage
Design des amorces (suite)
Amplification du Séquençage de Choix de l'amorce
cluster rfb l'extrémité 5' de rfb reverse O spécifique
Choix de l'amorce reverse O spécifique
→ Comparaison des séquences de référence (GenBank) et de
celles obtenues par de novo sequençage
Design des amorces reverse O spécifiques
(fragments de 200 à 700 pb après PCR)
Exemples : rfbO16.r 5'-GGATCATTTATGCTGGTACG-3' (450pb)
rfbO7.r 5'-CGAAGATCATCCACGATCCG-3' (722pb)

38. Critères d'optimisation du design d'amorces
Design d'amorces
Une bonne amorce PCR doit être ...
- Absence d'hybridation secondaire
Spécifique ! - Minimum de 18 bases de long
- Tm > 45°C
- GC% ~50%
- Aucun dimère de nuclétotides
Stable ! - Aucun palindrome (structures secondaires)
- Attention GC% en 3'
Et attention 1
- Tm proches
à la compatibilité !

39. Méthode de sérotypage
Mise en place de l'essai
PCR multiplex
- Milieu réactionnel
Lysat bactérien
dATP dGTP, dTTP et dCTP
1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse
Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)

40. Méthode de sérotypage
Mise en place de l'essai
PCR multiplex
- Milieu réactionnel
Lysat bactérien
dATP dGTP, dTTP et dCTP
1 amorce forward (gndbis.f) + amorces reverse
Tampon 10x + Taq polymerase (ATGC Biotechnologie)
rfbO1.r , rfbO2.r , rfbO18.r , rfbO4.r , rfbO12.r , rfbO75.r ,
rfbO16.r , rfbO6a.r & rfbO7.r rfbO25a.r , rfbO15.r & rfbO157.r
Primer set 1 Primer set 2

41. Méthode de sérotypage
Mise en place de l'essai (suite)
PCR multiplex
- Programme PCR
100
95
90 Eppendorf Mastercycler
Température (en °C°)
(Eppendorf)
85 Dénaturation
80 (4 min, 94°C)
75
70
Extension finale
65
(5 min, 72°C)
60
55
30 cycles
50 5s, 94°C
10s, 59°C Temps (en seconde)
Évolution de la température dans le thermocycleur

42. Méthode de sérotypage
Mise en place de l'essai (suite)
- Résultats Extrait de Clermont et al. (2007)
Primer set 1 Primer set 2
Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex
(gel d'agarose et BET révélé aux UV)

43. Méthode de sérotypage
Mise en place de l'essai (suite)
- Résultats Extrait de Clermont et al. (2007)
Primer set 1 Primer set 2
Electrophorèse des fragments obtenus en PCR multiplex
(gel d'agarose et BET révélé aux UV)
Profils électrophorétiques identiques pour un même sérotype
(fragment PCR de même taille)

44. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

45. Méthode de sérotypage
Validation de l'essai
Reproductibilité Sensibilité Spécificité

46. Méthode de sérotypage
Validation de l'essai
Reproductibilité Sensibilité Spécificité
Reproductibilité (répétabilité)
Testée inter-laboratoires.
Tests réalisés : - PCR multiplex avec amorces spécifiques x12
- Typage de 24 souches dites communes
Méthode reproductible et précise
(Résultats identiques mais quelques optimisations)

47. Méthode de sérotypage
Validation de l'essai
Reproductibilité Sensibilité Spécificité
Sensibilité
Test sur 153 souches
→ Sensibilité ~ 93%
Problèmes rencontrés :
- Absence de produit PCR,
- Fragment de PCR correspondant
à un autre sérotype que celui
attendu
Sensibilité et spécificité de
la PCR multiplex

48. Méthode de sérotypage
Validation de l'essai
Reproductibilité Sensibilité Spécificité
Spécificité
Test sur 167 souches représentant
61 sérotype O non ciblés
→ Aucune fausse amplification
Problème rencontré :
Faux positifs pour 6 souches aux
sérotypes O ciblés mais
apparaissant faussement d'un autre
sérotype
Sensibilité et spécificité de
la PCR multiplex

49. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

50. Méthode de sérotypage
Résolution des discordances
→ 12 souches montrant des discordances de sérotypes
rfb RFLP et séquençage

51. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)
rfb RFLP
- Long-range PCR
gnd Opéron rfb JUMPstart
gnd.f JUMPstart.r
Fragment correspondant à rfb
Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR

52. Principe de la rfb RFLP (Coimbra et al., 2000)
rfb RFLP
- Long-range PCR
gnd Opéron rfb JUMPstart
gnd.f JUMPstart.r
Fragment correspondant à rfb
Amorces et zone amplifiée par Long-range PCR
- RFLP (Restriction Length Fragment Polymorphism)
5' GAAGANNNNNNNN / 3'
3' CTTCTNNNNNNN / N 5'
Site de coupure de l'endonucléase MboII

53. Méthode de sérotypage
Résolution des discordances
→ 12 souches montrant des discordances de sérotypes
rfb RFLP et séquençage
Rappel des problèmes rencontrés :
- Échec de l'amplification malgré les amorces spécifiques
- Produit PCR présentant un type 0 qui n'est pas le sien

54. Méthode de sérotypage
Résolution des discordances (suite)
Produit PCR présentant un type 0 qui
Adapté de Clermont et al. (2007)
n'est pas le sien → O1 et O6 / O18
Réarrangement du locus rfb
et
présence d'une séquence
typique de O18
Profil électrophorétique après rfb RFLP

55. Méthode de sérotypage
Résolution des discordances (suite)
Produit PCR présentant un type 0 qui
Adapté de Clermont et al. (2007)
n'est pas le sien → O12/O16
Les souches appartiennent
bien au sérotype O16.
(portion 5' de rfb typique
de ce sérotype)
Profil électrophorétique après rfb RFLP

56. Plan de la présentation
Introduction
- Escherichia coli et ses propriétés antigéniques
- Sérotypage de l'antigène O
Objectif et démarche R&D
Mise au point de la méthode de sérotypage
- Sélection des sérotypes et des souches
- Détermination des groupes phylogénétiques des souches
- Design d'amorces et mise en place de l'essai
- Validation de l'essai
- Résolution des discordances
Conclusions

57. Conclusions
Une méthode robuste
→ Méthode moléculaire de sérotypage de l'antigène O d'Escherichia coli
Méthode Qualités Limites
Rapide
Simple Sérotypage incorrect si :
PCR multiple Peu coûteuse - voies de synthèse de l'Ag
allèle Appareillage simple O variables
spécifique Typage de souches - dégénérescence du locus
« rough » et « non rfb
agglutinantes »
Bilan de l'essai de Clermont et al. (2007)

58. Sélection des sérotypes et des souches
Détermination des groupes
phylogénétiques
des souches
Design des amorces
Non Mise en place de l'essai
Résolution des
discordances
Oui Validation
Non de l'essai
Oui
Applications
Étapes de développement de la méthode de Clermont et al. (2007)

59. Conclusion
Des applications personnalisables
– DIAGNOSTIC :
Sérotypage de routine en LABM en cas de septicémies à E. coli
– EPIDEMIOLOGIE:
Création de kits épidémies spécifiques selon une région
géographique et/ou une pathologie
Exemple : Sérotype O45 et méningite du nouveau-né en France

60. Références bibliographiques
- Applied Biosystems (2009) DNA sequencing by capillary electrophoresis
- Biomérieux (2012)
http://www.biomerieux.fr/servlet/srt/bio/france/dynPage?open=FRN_IND_FDA_PRD&do
- Clermont O., Bonacorsi S. & Bingen E. (2000) Rapid and simple determination of
the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol 66:639-654
- Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E. (2007) Determination of
Escherichia coli O types by allele-specific polymerase chain reaction: application to
the O types involved in human septicemia. Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease 57:129-136
- Escobar-Paramo P., Clermont O., Blanc-Potard AB, Bui H, Le Bouguenec C &
Denamur E. (2004) A specific genetic background is required for acquisition and
expression of virulencde factors in Escherichia coli. Mol Biol Evol 21:1085-1094
- Genscript (2012)
http://www.genscript.com/cgi-bin/products/enzyme.cgi?op=all_ez&name=MboII

61. Références bibliographiques
- Institut Pasteur (2006) Rapport d'activité du Centre national de référence
Escherichia coli et Shigella
- Oxoid (2012)
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=DR0120&org=72&c=UK&
- Roche (2005) Expand Long Template PCR system
- Szalo I.M., Taminiau B. & Mainil J. (2006) La lipopolysacharide d'Escherichia coli :
structure, biosynthèse et rôles. Ann Méd Vét 150:108-124

62. Pretseille Emmanuelle
Rahabi Mouna Chirine
Master MABS 2011-2012
Diagnostic moléculaire des MO
Publication n°6
Determination of Escherichia coli O types by
allele-specific polymerase chain reaction :
application to the O types
involved in human septicemia
Clermont O., Johnson J.R., Menard M. & Denamur E.
N°57 (2007)