1. 2009 年 第 6 期
研究报告 中
国 酿 造 总第 207 期
83
雀稗麦角菌原生质体诱变育种及发酵条件研究
3
韩增飞 ,刘志国 ,曾丽娟 ,房国梁 ,付云洁
(武汉工业学院 生物与制药工程学院 ,湖北 武汉 430023)
摘 : 为获得麦角碱高产菌株 ,提高雀稗麦角菌 ( C laviceps paspa li stra in 3103 )发酵的产碱率 ,用溶壁酶水解处理菌丝体 、
要 不同浓度
的亚硝基胍诱变处理制备的原生质体 ,经再生培养获得诱变菌株 ,再经紫外初筛后进行发酵复筛 ,采用 Van2 rk 方法测定产碱量 。
U
筛选得到的高产菌株进行二级发酵并优化其发酵条件 。实验结果表明 ,经亚硝基胍诱变处理 ,麦角总碱的产率由 90mg /L 提高到了
1600mg/L,增加了约 16 倍 ;单位产碱率由 221
5mg /L / g提高到了 400mg /L / g,增加了约 17 倍 ; 连续传代培养可以得到稳定的高产菌
株 ,接种量为 20% 时可有效缩短发酵周期 。结果表明 ,用亚硝基胍对原生质体进行诱变处理可有效提高 C 1papspa li的产碱率 。
关 : 雀稗麦角菌 ; 原生质体 ; 亚硝基胍 ; 诱变育种 ; 发酵
键 词
中图分类号 : Q 933; TS201 1
3 文献标识码 : A 文章编号 : 0254 - 5071 (2009 ) 06 - 0083 - 04
Protopla st m utagenesis of C la viceps paspa li and opti iza tion of ferm en ta tion cond ition s
m
3
HAN Zengfei, L I Zhiguo , ZEN G L ijuan, FAN G Guo liang, FU Yunjie
U
( S chool of B iology and Pha r aceu tica l Eng ineering, W uhan Poly techn ic U n iversity, W uhan 430023, Ch ina )
m
Abstract: The strain of C laviceps paspa li p roducing higher yield of ergot alkaloids was obtained through p rotop last mutagensis, in which the mycelium
of C laviceps paspa li was first treated by lywallzyme and the different concentrations of the nitrosoguanidine, and the stable mutants was obtained after
the p ri ary screen of UV and second screen of fer
m mentation. The p roductivity of ergot alkaloids was measured by the method of Van 2 rk. The results
U
showed that the p roductivity of ergot alkaloids was increased by 16 folds ( from 90mg /L to 1600mg /L) and the unit p roductivity of ergot alkaloids was
increased by 17 folds ( from 221 5mg /L / g to 400mg/L / g) . Inoculum of 20% could short the period of fer mentation. These results indicated that the
p rotop last nitrosoguanidine mutagenesis was a feasible app roach to increase the p roductivity of lysergic am ide by the C. papspa li strain.
Key words: C laviceps paspa li; p ro top lasts; nitro soguanidine; m utagenesis; fer entation
m
雀稗麦角菌 ( C. paspa li) 属麦角菌属 , 其主要产生结构 集 , 本实验室保藏 ; 原生质体高渗液 : KCl 01
7mol /L; 溶壁
简单的棒状麦角衍生物 (如麦角酰胺 ) , 此类药物在临床 酶 : 广东微生物研究所生产 ; VAN 2
URK 试剂 : 35mL H2 O ,
上用于治疗神经内分泌 、
脑血管系统的疾病 (如老年性痴 65mL 浓 H2 SO4 , 01
15mL 10% ( w / v) FeCl3 , 200mg对二甲氨
[1 ]
呆 ) 以及产后止血或作为原料用于合成其他重要药物 。 基苯甲醛 。
因野生麦角产量不足 , 并受到自然条件的限制 , 麦角碱主 斜面培养基 : 去皮马铃薯 200g, 切块煮沸 01 后过
5h
要依赖发酵生产 。近几十年来 ,国外科研人员在菌种的选 滤 ,加琼脂 20g, 葡萄糖 20g, 加水至 1000mL , 用浓氨水调
pH 值为 51 。
[2 ]
育、
发酵技术及培养条件等方面进行了研究 。国内也有 2
: 豌豆汁 01 , 琥珀酸 1% , 甘
[3 ]
利用麦角菌发酵生产麦角酰胺 、
麦角新碱和麦角隐亭的报 液体菌丝体培养基 3%
道 。由于雀稗麦角菌是多核细胞 ,一般培养条件下不易产 露醇 4% , KH2 PO4 1% , MgSO4 ・ 2 O 01
7H 03% 。双蒸水配
生分生孢子 ,发酵周期长 、
麦角碱产率低 、
生产成本高 , 因 制 ,用浓氨水调 pH 值为 51 。
2
此难以大规模应用于工业生产 。至今国内的麦角碱类药 黄豆汁再生培养基 : 黄豆粉 01 , 葡萄糖 1% , 甘露
5%
物仍然依赖进口 。 醇 10% , ,琼脂 2% 。双蒸水配制 ,浓氨水调 pH 值为 51 。
2
本实验前期采用原生质体紫外诱变的方法对麦角 [4 ]
初筛 培 养 基 : 甘 露 醇 5% , 琥 珀 酸 3% , KH2 PO4
菌进行改造 , 麦角碱产率显著提高 , 从 20m g /L 提高为 01 , 琼脂 2% , M gSO4・ 2 O 01
1% 7H 03% , 双蒸水配制 , 用浓
氨水调 pH 值为 51 。
[3 ]
90m g /L 。为进一步提高产碱率 , 在前期紫外诱变改 2
造的基础上 , 研究了亚硝基胍诱变方法 , 并对发酵条件 MYG培养 基 : 麦 芽糖 01 , 酵母 膏 01 , 葡 萄 糖
5% 5%
进行优化 , 为发酵生产麦角碱类药物奠定基础 。 1% ,甘露醇 01
6mol /L。
1 材料和方法 CY 培 养 基 : 蛋 白 胨 01 , 酵 母 膏 01 , 甘 露 醇
M 2% 5%
11 材料与仪器
1 01
6mol /L。
雀稗麦角菌 ( C lavice paspa li strain 3101 ) : 由 国 外收 PDA 培养基 : 土豆提取液 20% , 葡萄糖 20% , 蔗糖
收搞日期 : 2009 2 2
02 26
作者简介 : 韩增飞 ( 1984 2) ,男 ,山东临沂人 ,硕士研究生 ,研究方向为微生物生物技术 ; 刘志国 3 ,教授 ,通讯作者 。

2. 2009 No. 6
84 S e ria l No. 207 C h ina B rew ing Research Report
01
6mol /L。 离心 5m in, 取上清液 1mL ,加 2mL Van 2 rk 试剂 ,室温静置
U
发酵复筛培养基 : 初筛固体培养基去掉琼脂 。 4h 后 ,于波长 550nm 处测定吸光度值 ,以麦角酰胺标准物
RMYG、 M、
RCY RPDA 分别 为 M YG、 M、
CY PDA 加上 配制标准系列按上述同样方法检测并绘制标准曲线 , 得到
2%琼脂 。 标准曲线方程为 y = 01
0082x + 01
001, y为波长 550nm 处的
高速离心机 : 上海安亭科学仪器厂 ; 高速离心机 吸光度值 , x 为麦角酰胺浓度 μg /mL ) , 此法测定的是胞
(
( CF 215R ) : 日本日立 ; 紫外可见分光光度计 ( WV8500 ) : 外的麦角碱含量 。
上海精密仪器科学有限公司 ; 三用紫外分析仪 ( ZF 2 ) :
1 菌丝体用 4%酒石酸与丙酮 ( 1 ∶ ) 的混和液浸提 , 用
1
江苏海门其林医用仪器厂 ; 多用途微量检测仪 ( DNA Ex2 匀浆机高速匀浆 , 4000 r/m im 离心 5m in, 取上清液同上测
pert) : Austria GmbH。 [7]
定 (细胞内麦角碱 ) 。
11 方法
2 11 1 菌株的发酵研究
25
11 1 菌丝体培养
21 将雀稗麦角菌种接种到新鲜斜面培养基中 , 于 25 ℃～
取适量于 27 ℃培养的菌种斜面幼嫩菌苔于研钵中研 26 ℃活化培养 7d。斜面培养后 , 用接种针挑取幼嫩菌丝
磨 ,并接入菌丝体培养基中 , 27 ℃静置培养 3d ～4d, 用滤 于研磨器中 ,加水研磨至看不到菌丝块为止 ,用吸管接入盛
网过滤收集菌丝体 。 有 100mL 液体种子培养基的三角瓶 (体积为 250mL ) 中 , 在
11 1 原生质体的制备
22 27 ℃、160r/m in ～180 r/m in 避光振荡条件下培养 4d ～5d, 作
菌体培养液 4000r/m in 离心 5m in,收集菌丝体 ,先用无 为一级种子。将一级种子以 20%接种量转接到新鲜液体培
菌水离心冲洗 1 次 ,再用 01 mol /L KCl离心冲洗 2 ～3 次 ,
7 养基中培养 3d ～4d 作为二级种子
[8 ]
。
按 01 ∶ (菌丝体 ∶ )的比例加入含 10mg/mL 溶壁酶
2g 1mg 酶液 将原始菌株和诱变菌株的二级种子以 20%接种量接
的高渗液中 ,在 28 ℃恒温水浴酶解 2h,每隔 15m in 振荡 1 次 入发酵培养基中 , 26 ℃ 28 ℃、 r/m in ～180 r/m in 避光振
～ 160
以利于细胞壁消化及原生质体的释放。酶解结束后 , 用无 荡条件下培养 14d ～15d。每 24h 取发酵上清液测其产碱
菌脱脂棉柱过滤 , 离心收集沉淀并用 01 7mol /L KCl 洗涤离 量 ,确定原始菌株和诱变株的产碱规律 。
心 ( 4000 r/m in、 in ) 2 ～3 次 ,最后得到的原生质体溶液在
5m 将诱变菌株的二级种子分别以 10% 、 、 、 、
15% 20% 25%
[5 ]
血球计数板上进行计数 , 4 ℃冷藏待用 。 30%的接种量接入发酵培养基中 , 25 ℃～28 ℃、 r/m in ～
160
11 1 原生质体的诱变与再生
23 180 r/m in 避光振荡条件下培养 14d ～15d。每 24h 取发酵
在通风橱中用 pH61 的 PBS 将亚硝基胍的四氢呋喃
0 上清液测其产碱量 。
饱和液稀释成 1 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶
10 1 20 1 200 1 2000 的 4 个不同浓 2 结果与讨论
度 。向盛有 01
5mL 原生质体悬浮液的 EP 管中加入 01
1mL 21 液体菌丝体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响
1
不同浓度的亚硝基胍溶液 ,于 27 ℃避光反应 30m in。各管 在探索 C laviceps paspa li strain 3101 的菌丝体培养条
分别加入 01
5mL 01
7mol /L 的 KCl 溶液混匀 , 4000 r/m in 离 件及在该条件下产生的菌丝体对原生质体形成的影响时 ,
心 5m in,洗涤终止诱变 ,弃上清 , 重复洗涤 2 次后用 01
5mL 使用了豌豆汁 、
MYG、 M、
CY PDA 4 种培养基 ,结果见表 1。
01
7mol /L 的 KCl溶液悬浮原生质体 。
表 1 液体培养基对菌丝体生长及原生质体形成的影响
分别取未诱变和诱变后的原生质体 01
1mL 涂布到黄
Ta b le 1 1 Effe c t o f liqu id m e d ium o n m yce lia g row th a nd p ro top la s t
豆汁再生平板上 , 用黑布包裹平板在恒温培养箱中 27 ℃ fo rm a tio n
静置培养 5d ～7d 后观察结果 。 项目 豌豆汁液体培养基 MYG CYM PDA
菌丝体生长状况
11 1 高产菌株的筛选
++++ ++ ++ ++
24
原生质体数量 ++++ ++++ ++ +
将再生的单菌落接种到初筛培养平板上 , 于 27 ℃培 正常 , 正常 ,
原生质体形态 正常 ,圆球形 小 ,畸形
养 10d ～13d。根据麦角碱类物质具有荧光反应的特性 , 圆球形 圆球形
:“ + ”
注 的多少表示生长状态或数量的多少 。
将菌株置于紫外灯下观察荧光 ,根据荧光强度差异筛选高
产菌株 ,如此反复筛选 2 ～4 次 。将初筛选出的菌株于盛 从表 1 可见 ,用豌豆汁液体培养基培养的菌丝体长势
有 50mL 发酵培养基的试管中发酵培养 , 27 ℃、 r/m in
180 最好 ,用其制备的原生质体数量最多 ,形态最好 ,故选用豌
振摇培养 11d ～15d 后 , 取发酵上清液进行总碱测定 。取 豆汁液体培养基培养菌丝体 。
发酵复筛得到的高产菌株进行连续传代培养 ,选取稳定的 21 再生培养基对原生质体再生的影响
2
高产菌株
[6 ]
。 原生质体失去了细胞壁的保护 , 极其脆弱 , 因而其再
用 Van2 法测定总碱含量 , 取发酵菌液经 4000r/mim
Urk 生条件十分苛刻 。其中再生培养基是一个重要的方面 。

3. 2009 年 第 6 期
研究报告 中
国 酿 造 总第 207 期
85
在实验中 ,将原生质体接种到 RMYG、 M、
RCY RPDA、
黄豆 21 发酵筛选结果
4
汁培养基中 ,结果见表 2。 液体菌丝体培养基制备的原生质体悬浮液 (数量级为
8
表 2 原生质体在不同再生培养基上的再生情况 10 )用不同浓度的亚硝基胍处理 ,将诱变后的原生质体涂布
Ta b le 2 1 The re ge ne ra tio n o f p ro top la s ts o n d iffe re n t m e d ium s 到黄豆汁培养基上再生后 ,初筛选取荧光反应强的菌株进行
RMYG RCYM RPDA 黄豆汁培养基
发酵复筛 ,结果 (表 3)可见 ,亚硝基胍浓度为 1 ∶ 时 ,经过多
10
+ - - ++++
:“ + ”
注 的多少表示生长状态或数量的多少 ,“ - ”
表示没有再生菌 轮诱变处理其高产菌株 A22 的产碱率达到 12001
5 244mg /L。
落生成 。 经过连续传代培养 ,其麦角碱的产率较稳定 。
从表 2 可见 ,由豌豆汁液体培养基制备的原生质体在 表 3 亚硝基胍对麦角酰胺产生菌原生质体的诱变
黄豆汁培养基上再生数量最多 , 再生效果最好 , 故再生培 Ta b le 3 1 Effe c t o f N TG o n m u ta tio n o f C. p a sp a li p ro top la s t p ro duc ing
lyse rg ic a c id am ide
养基应选用黄豆汁培养基 。
处理时间 / 诱变存活率 / 产碱率 /
21 不同浓度的亚硝基胍处理后的再生情况
3 NTG浓度
m in %
菌株数 突变株
(mg L - 1 )
・
1∶
2000 30 201
8 400 D1 22 6671
073
1∶
200 30 151
6 400 C1 23 7511
22
1∶
20 30 121
8 400 B2 24 7751
61
1∶
10 30 101
5 400 A2 25 12001
244
将得到的高产菌株 A2 2 和原始菌株 B10 的胞内 、
5 胞
外和总碱产量变化进行比较 ,结果见图 3。
A、 、 、 分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和溶液按
B C D
1∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶
10 1 20 1 200 1 2000 梯度稀释诱变后在再生培养基上生长情况
图 1 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生结果
F igu re 1. Effe c ts o f the d iffe re n t co nce n tra tio n N TG o n the re ge ne ra 2
tio n o f p ro tap la s ts
1 为原始菌株 ; 2 为高产菌株
实验用 4 个浓度梯度亚硝基胍进行诱变 , 由图 1 可以 图 3 原始菌株和诱变菌株胞内 、
胞外总碱产量比较
看出 ,随着浓度的增加 ,再生的菌落急剧减少 ,表明亚硝基 F igu re 3. Com p a riso no f in tra ce llu la r a nd e xtra ce llu la r e rgo t a lka lo id
胍对原生质体具有杀伤作用 ,取浓度为 21 × 个 /mL 的
8
5 10 co nce n tra tio n be tw e e n o rig ina l s tra in a nd m u ta ge n s is s tra in
原生质体悬浮液 01
1mL 涂布平板 ,不同浓度的平板再生菌 由图 3 可见 ,诱变后得到的高产菌株胞外的麦角碱产
落数量见图 2。 率比原始菌株提高了约 19 倍 , 胞内的产碱率提高了约 12
倍 ,麦角总碱产率为 11
6g/L 左右 。
21 原始菌株 B10 与诱变菌株 A2 2 发酵曲线比较
5 5
用亚硝基胍对雀稗麦角菌的原生质体进行诱变筛选
得到的高产菌株胞外总产碱量和单位产碱量都比原始菌
株有了明显的提高 ,结果见图 4。
21 不同接种量对诱变菌株 A2 2 胞外产碱率的影响
6 5
麦角菌发酵周期较长 ,合适的接种量可以在提高产量
的前提下有效地缩短发酵周期 。在实验室前期工作确定
[3 ]
A、 、 、 分别为用磷酸缓冲液将亚硝基胍的四氢呋喃饱和
B C D 的最佳发酵条件 基础上 ,着重对接种量进行了研究 。由
溶液按 1 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 、 ∶ 进行梯度稀释后的浓度
2000 1 200 1 20 1 10
图 5 可以看出 , 接种量为 20% 、
发酵第 12d 时产碱率达到
图 2 原生质体在不同浓度的亚硝基胍处理后再生数量比较
最大值且发酵周期最短 ,在保证产碱率前提下可以缩短发
F igu re 2. Com p a riso n o f p ro tap la s ts re ge ne ra tio n qua n tity
a fte r tre a te d by d iffe re n t co nce n tra tio n N TG 酵时间 。

4. 2009 No. 6
86 S e ria l No. 207 C h ina B rew ing Research Report
影响原生质体形成的因素很多 ,如培养基成分会直接
影响菌丝细胞壁的构成 ,从而使细胞壁对酶的敏感性发生
相应的变化 ,影响原生质体的释放 。此外菌丝体的菌龄 、
渗透压稳定剂的种类 、 值 、
pH 酶解温度和酶解时间等因素
及渗透压稳定剂的种类和 pH 值也是影响原生质体释放
[9 ]
的重要因素 。
影响原生质体诱变后再生的因素主要是再生培养基
的成分 ,有些研究表明用 RMYG 培养基本再生可得到大
量再生菌落 , 但实验用 RMYG 培养基未得到再生菌落 。
在探索再生 培养 基 的条 件 时 , 尝试 了几 种 再生 培 养基
( RCY 、
M RPDA、
黄豆汁再生培养基 ) , 发现原生质体在黄
豆汁再生培养基上再生效果最好 。
接种量的选择对缩短麦角菌的发酵周期非常重要 , 即
在不影响产碱量的前提下如何使菌体密度在最短时间内
达到最大 ,从而缩短麦角菌的发酵周期 。本实验表明 , 当
接种量为 20%时 ,麦角碱达到最大产量所用的时间最短 ,
且产碱量最高 。因此本实验选择 20%的接种量 。
图 4 原始菌株与诱变菌株胞外 (A ) 胞外单位产碱量 (B ) 产碱量 不同浓度的 NTG进行诱变处理均能得到稳定的高产
F igu re 4. C u rve s o f (A ) 、 xtra ce llu la r(B ) e rgo t a lka lo id p ro duc tio n by
e
o rig ina l s tra in a nd m u ta ge n s is s tra in 菌株 ,国内用麦角菌的原生质体进行诱变育种的报道较
少 ,通过上述研究 , 找到了一条快速 、
有效提高麦角酰胺产
率的途径 。在对得到的高产菌株的发酵条件进行优化后 ,
麦角碱的总产碱量达到 11 /L 左右 , 为工业发酵生产麦
6g
角碱类药物奠定了基础 。
参考文献 :
[ 1 ] 刘志国 ,王亚林 ,赵静国 , 等 . 雀稗麦角菌产麦角碱发酵条件的优化
[ J ]. 化学与生物工程 , 2004 ( 2) : 18 2 1
21
[ 2 ] 朱 ,王 ,朱慧新 , 等 . 50mL 管摇床培养暨 24 孔板法筛选麦
平 全
角菌突变株 [ J ]. 微生物通报 , 2000, 27 ( 3) : 192 2 1
194
1 为 25%接种量 , 2 为 30%接种量 , 3 为 10%接种量 ,
[ 3 ] 陈江源 ,代江红 ,刘志国 ,等 . 麦角酰胺产生菌原生质体的紫外诱变
4 为 15%接种量 , 5 为 20%接种量 。
育种 [ J ]. 化学与生物工程 , 2005 ( 7) : 33 2 1
35
图 5 不同接种量对菌株 A2 - 5 产碱率的影响
F igu re 5. Effe c ts o f d iffe re n t ino cu lum s o n p ro duc tivity o f e rgo t [ 4 ] SR IKRA I S, ROBBERS JE. Methods for mutation and selection of the
a lka lo id s by s tra in A2 2 5 Ergot Fungus [ J ]. App l Environ M icrob, 1983, 45 ( 4) : 1165 21169.
[ 5 ] BO ICHENKO LV , ZELENKOVA NF, AR I BASAROV MU , et a l Op 2
N .
3 讨论 tim ization of Conditions for Storage and Cultivation of the Fungus C lavi2
雀稗麦角菌细胞是多核的 ,一般培养条件下不易产生 ceps sp. , a p roducer of the Ergot A lkaloid A g roclavine [ J ]. App l B iochem
分生孢子 ,本文用溶壁酶处理菌丝体制备原生质体 , 然后 M icrob, 2003, 39 ( 3) : 294 2299.
[ 6 ] 何惠霞 , 朱 平 , 李焕娄 . α2 角隐亭产生菌的原生质体诱变育种
麦
以不同浓度的亚硝基胍对原生质体进行诱变处理 ,通过初
[ J ]. 真菌学报 , 1996, 15 ( 3) : 215 2 1
219
筛和复筛选出高产碱量的菌株 。 [ 7 ] 袁 ,杨庆尧 . 麦角隐亭产生菌的营养条件 [ J ]. 南京师范大学学
萍
进行菌丝体培养时 ,雀稗麦角菌在豌豆汁培养基中菌 报 , 1996, 19 ( 3) : 63 2 1
68
[ 8 ] 王亚林 ,赵静国 ,熊万斌 . 产碱麦角菌发酵培养基的研究 [ J ]. 武汉工
丝体生长情况较好 。实验以豌豆汁培养基在 27 ℃、 r /
180
业学院学报 , 2003, 22 ( 2) : 1 23.
m in 摇床避光振荡培养菌丝体 7 d ～8d, 将其作为一级种 [ 9 ] 龚淑俐 ,邓放明 ,陈力力 . 金针菇原生质体制备的研究 [ J ]. 现代食品
子转接到新鲜豌豆汁培养基中继续培养 2d ～3d, 发现菌 科技 , 2006, 23 ( 4) : 54 2 1
57
丝体连在一起呈放射状 、
长势好 , 由其制备的原生质体呈 [ 10 ] 钱秀萍 ,冯慧琴 ,杨庆尧 . 用琼脂柱筛选麦角隐亭产碱菌株 [ J ]. 微
生物学报 , 1997, 37 ( 1) : 76 2 1
78
圆球形 、
体积大 、
数量多 , 在黄豆汁培养基上再生效果好 ,
[ 11 ] DAN IEL G PANACC I NE, CHR ISTI E MC. Abundant Resp irable
. O N
故实验菌丝体的培养选取豌豆汁液体培养基 ,以其培养的 Ergot A lkaloids fron the common A irborne Fungus A spergillus fum igatus
二级种子作为原生质体制备的材料 。 [ J ]. App l Environ M icrob, 2005, 71 ( 6) : 3106 23111.