schmidt-2016

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schmidt-2016

  1. 1. Originalien Ophthalmologe DOI 10.1007/s00347-016-0259-z © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016 C. Schmidt1 · S. Fabinyi2 · S. Rehfeldt1 · S. Klöpzig1 · V. Jentzen1 · J. Bohrisch1 · A. Messner2 · J. Storsberg1 1 Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung IAP, Potsdam-Golm, Deutschland 2 HumanOptics AG, Erlangen, Deutschland Nichtantagonistische Wirkungsweise des intrastromalen Krumeich- Kornearings in einem experimentellen Gewebekultursystem Die Zahl an Hornhauttransplantationen steigt jährlich, gleichzeitig aber mangelt es an der Verfügbarkeit von Spenderge- weben hoher Qualität [6, 18]. Ein An- satz zur Verbesserung dieser Situation ist beispielsweise die Anwendung geeigne- ter chirurgischer Verfahren, um den bei Transplantationen anfallenden Gewebe- ausschuss der Spenderhornhäute zu ver- ringern [3]. Zur Verlängerung der Über- lebenszeit des Transplantats ist außer- dem eine Reduzierung von Immunreak- tionen, die in direktem Zusammenhang mit der Ausbildung von Neovaskularisa- tionen stehen [20], zu erstreben. Lässt man die Aspekte der Indikatio- nen und chirurgischen Verfahren außer Acht und konzentriert sich stattdessen auf das Einsetzen des Spendergewebes in die Wirtshornhaut, so erfordern die je- weilsunterschiedlichenBrechungseigen- schaften von Spender- und Empfänger- hornhaut eine bestimmte, unveränderli- che Positionierung des Spendermaterials während seiner gesamten Lebensdauer. Dies trägt wesentlich zu einer Reduzie- rung von optischen Artefakten, wie z. B. einem Astigmatismus, bei [4, 12, 14]. Teile der Arbeit wurden auf dem Kongress der European Association for Vision and Eye Research (EVER) im Oktober 2015 in Nizza, Frankreich,präsentiert. Eine Methode zur stabilen Fixierung des Spendergewebes in der Hornhaut des Empfängers stellt das Einbringen eines intrastromalen kornealen Rings in das Interface zwischen Transplantat und verbleibendem Gewebe dar [8]. Aller- dings besteht in der Literatur – unter der Annahme, dass die untersuchten Kohorten und Materialen zwischen den unterschiedlichen Studien vergleichbar sind – keine Einigkeit über den Effekt, den ein legierter Ring aus Cobalt (Co), Chrom (Cr), Molybdän (Mo) und Titan (Ti) in der klinischen Anwendung mit sich bringt. Auch ist kein zugrunde lie- gender Wirkmechanismus offensichtlich [1, 8, 9]. Positive Effekte, die auf den Einsatz des intrastromalen Rings (bestehend aus Tab. 1 Katalognummer,ReinheitsgradundGrößenbereich derPartikel dereinzelnen Kompo- nenten derKrumeich-Ring-Legierung nach Angaben desHerstellers (Goodfellow,BadNauheim, Deutschland) Katalognummer Material Reinheit (%) Partikelgröße (µm) CO006011 482-522-92 Cobalt 99,9 50–100 CR006025 034-654-92 Chrom >99 38–45 MO006011 802-109-88 Molybdän >99,9 55–355 TI006020 051-375-01 Titan 99,5 <150 69,5 % Cobalt, 24 % Chrom, 4,5 % Mo- lybdän und 2 % Titan) zurückzuführen sind, beschrieben Krumeich und Dun- cker [9] in einer prospektiven, rando- misierten Studie, in der 179 konsekutive Augen, die denintrastromalenkornealen Ring erhielten(nachfolgend als Gruppe 1 bezeichnet), und 101 konsekutive Augen ohne Ring (nachfolgend als Gruppe 2 be- zeichnet) untersucht wurden. Die Auto- ren beobachteten innerhalb von 48 Mo- naten Immunreaktionen mit einer Häu- figkeit von 1,14 % in Gruppe 1 verglichen mit 7 % in Gruppe 2. Der Unterschied erwies sich als statistisch relevant (p = 0,02;Log-Rank-Test).ZudemgebenKru- meich und Duncker an, dass bei 18 Au- gen mit Ring oberflächliche Vaskularisa- tionen in 1 bis 1,5 Quadranten am Ring Der Ophthalmologe
  2. 2. Originalien 10% DMSO 24h Inkubation 100x Mag. 24h Inkubation + Medium Kontrolle 100x Mag. 2h Inkubation + Medium Kontrolle + MTT 100x Mag. Abb. 1 8 Höhere Konzentrationen deraus den einzelnen Komponenten derKrumeich-Ring-Legierung vorbereiteten Extrakte verändern dieZell- morphologie unddas Erscheinungsbildvon dunkelblauem Tetrazolium- Metabolit-Präzipitat. Die Umsetzung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium Bromid(MTT)wurde als metabolischerMarkerheran- gezogen. Gezeigt sindhierrepräsentative mikroskopischePhasenkontrast- bilder(100-fache Vergrößerung)dermenschlichen dermalen mikrovasku- lären Endothelzellen von erwachsenen Spendern (HMVEC)Kulturen vorder Zugabe derjeweiligen Extrakte,nach 1TagKontakt mitden Extrakten und nach Beendigung des MTT-Tests vorderZelllyse undBestimmung deropti- schen Dichte. HMVEC wurden derWachstumsmediumkontrolleausgesetzt. HMVECmenschlichedermalemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachse- nen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid 24h Inkubation 100x Mag. Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 % 24h Inkubation + Cr- Extrakt 100x Mag. 24h Inkubation + Cr- Extrakt + MTT 100x Mag. Abb. 2 8 HMVEC wurden Chrom ausgesetzt.Nähere Erläuterungen s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzel- len von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium Bromid stopptenund nicht darüber hinaus in das Transplantat wuchsen. Als dritten Punkt, der die Annahme eines durch den Ring positiven hervorgebrachten Effekts un- terstützt, berichtendie Autorenvoneiner Transplantatüberlebensratevon98,8 %in Gruppe1und93 %inGruppe2miteinem statistischsignifikantenUnterschiedzwi- schen den Gruppen (p = 0,021; Kaplan- Meier-Schätzung). In scharfem Kontrast hierzu bringen Birnbaum et al. [1] den Einsatz des in- trastromalen kornealen Rings mit nega- tiven Auswirkungen in Zusammenhang. Die Autoren untersuchten Patienten mit Fuchs-Endotheldystrophie oder Kerato- konus, davon 10 Patienten, die den Ring erhielten (nachfolgend als Gruppe 1 be- zeichnet), und zur Kontrolle 10 Patien- ten ohne intrastromalen kornealen Ring. Die mittlere Nachuntersuchungszeit be- trug 27,6 ± 5,3 Monate. Birnbaum et al. geben an, dass bei 3 Patienten aus Grup- pe 1 das Hornhauttransplantat abgesto- ßen wurde, wobei bei 1 Patienten da- von zusätzlich tief liegende Vaskulari- sationen im Spendergewebe festgestellt wurden (p = 0,047). Allerdings räumen die Autoren ein, dass eine Kausalität zwi- schen dem Einbringen des Rings und der beobachteten Immunreaktion nicht ausdrücklich hergestellt werden konnte. Eine der schwerwiegendsten Immunre- aktionen wurde entlang einer tiefen Neo- vaskularisierung beobachtet, die in das Transplantat unterhalb des Rings verlief. Um die scheinbar widersprüchlichen Aussagen, wie der beiden oben diskutier- ten Studien, in Einklang zu bringen, ist ein gründliches Verständnis der Zellbio- logie an der Grenzfläche zwischen dem Krumeich-Ring und dem umgebenden Gewebe erforderlich. Für eine Vereinfa- chung des Versuchsmodells berücksich- tigten wir veröffentlichte und somit bis- lang nicht angefochtene Anhaltspunkte, die bei der Entwicklung von Neovaskula- risationen die Notwendigkeit eines un- verminderten Stoffwechsels von Endo- thelzellen, höchstwahrscheinlich der Mi- krovaskulatur, vermuten lassen [2, 7, 11, 15, 17]. Aus diesem Grund war es Ziel dieser Studie, experimentell den Nachweis zu bringen, ob der intrastromale Krumeich- RingmessbarezytotoxischeVeränderun- gen auf primäre menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen von er- wachsenenSpendern(HMVEC)bewirkt. Material und Methoden Metalle und Beschichtungs- verfahren Die einzelnen Bestandteile der Kru- meich-Ring-Legierung [9] wurden von der Firma Goodfellow (Bad Nauheim, Deutschland) bezogen. Angaben zu Reinheit und Größenbereich der Parti- kel sind in . Tab. 1 zusammengefasst. Der Ophthalmologe
  3. 3. Zusammenfassung · Abstract Ophthalmologe DOI 10.1007/s00347-016-0259-z © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2016 C. Schmidt · S. Fabinyi · S. Rehfeldt · S. Klöpzig · V. Jentzen · J. Bohrisch · A. Messner · J. Storsberg Nichtantagonistische Wirkungsweise des intrastromalen Krumeich-Kornearings in einem experimentellen Gewebekultursystem Zusammenfassung Hintergrund. Das intrastromale Einbringen des Krumeich-Kornearings zwischen Trans- plantat und verbleibendem Hornhautgewebe scheint eine periphere, oberflächliche und überflüssige Vaskularisation der Spenderhornhaut zu verhindern. Fragestellung. Ziel dieser Arbeit war es, zytotoxische Effekte des Krumeich-Rings mittels einer Gewebekultur aus primären menschlichen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen von erwachsenen Spendern (HMVEC) zu untersuchen. Material und Methoden. Im Wachstums- medium lösliche Extrakte der einzelnen Komponenten der Krumeich-Ring-Legierung wurden vorbereitet. Anschließend wurden HMVEC für 1 Tag zu diesen Extrakten in 3-facher Ausführung gegeben, und es folgten Untersuchungen mit dem 3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT)-Reagens. Weiter wurden HMVEC für 5 Tage auf dem Krumeich-Ring und auf Polypropylen (PP)-Plättchen, die mit den einzelnen Bestandteilen der Krumeich- Ring-Legierung beschichtet waren, gezüchtet. Anschließend wurde eine Doppelvitalfärbung mit Fluoresceindiacetat(FDA)/Propidiumiodid (PI) durchgeführt. Ergebnisse. Die MTT-Tests zeigten, dass höhere Dosen der Extrakte die Viabilität der HMVEC reduzieren, während hingegen hochverdünnte Extrakte aus Molybdän (Mo)- Pulver die Stoffwechselaktivitätvon HMVEC zu steigern schienen. Verglichen mit den Titan (Ti)- und Chrom (Cr)-beschichteten Plättchen, zeigte die Anfärbung mit FDI/PI nur wenige lebende HMVEC auf den Cobalt (Co)- und Mo- beschichtetenPP-Plättchen. Lebende HMVEC schienen nach 5 Tagen Inkubationszeit am Krumeich-Ring zu haften. Diskussion. Unsere Ergebnisse belegen, dass derKrumeich-Ring keine zytotoxischen Effekte in unserem Untersuchungsmodell zeigte. Höhere Verdünnungen von mediumlöslichen Molybdänpulver-Extrakten erhöhen die metabolische Aktivität von HMVEC. Schlüsselwörter Krumeich · Biomaterial · Legierung · Zytotoxizität · Vaskularisation Non-antagonistic influence of Krumeich’s intrastromal corneal ring in an experimental tissue culture system Abstract Background. Intrastromal insertion of Krumeich’s corneal ring between graft and residual host corneal tissue appears to impair preripheral, superficial and superfluous vascularization of donor corneal tissue. Objectives. The purpose of this study was to investigate the cytotoxic effects of Krumeich’s ring using tissue cultures composedof primary human dermal microvascularendothelial cells from adult donors (HMVEC). Materials and methods. Soluble growth me- dium extracts of the individual components of Krumeich’s ring alloy were prepared and HMVEC were exposed to these extracts in triplicate for 1 day followed by investigation with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT) assays. Furthermore, HMVEC were cultured for 5 days on either Krumeich’s ring or polypropylene (PP) discs coated with individual components of the Krumeich’s ring alloy followedby double vital staining with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI). Results. The MTT assays revealed that higher doses of the extracts appeared to reduce the viability of HMVEC, while highly diluted extracts of molybdenum (Mo) powder appeared to increase the metabolic activity of HMVEC. The FDA-PI staining showed only a few live HMVEC on either cobalt (Co) or Mo-coated PP discs, compared to the respective titanium (Ti) and chromium (Cr) counterparts. Viable HMVEC appeared to attach to Krumeich’s ring after a 5-day incubation period. Conclusion. The results confirm that Krumeich’s ring does not exert measurable cytotoxic effects in our chosen assay system. High dilutions of medium-soluble Mo powder extracts appear to increase the metabolic activity of HMVEC. Keywords Krumeich · Biomaterial · Alloy · Cytotoxicity · Vascularization Der intrastromale Krumeich-Ring wur- de von der Firma HumanOptics AG (Erlangen, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Polypropylen (PP) wurde von der Firma Borealis, Lutherstadt-Wittenberg, Deutschland (Bezeichnung: BormedTM ; Bestellnummer HD850) bezogen. Eine Spritzgussmaschine (Haake Minijet; Fir- ma Thermo Electron, Osterode am Harz, Deutschland) wurde für die Herstellung der PP-Plättchen herangezogen. Zellen, Medien und Extraktions- verfahren Wir verwendeten primäre menschli- che mikrovaskuläre Endothelzellen von erwachsenen Spendern (abgekürzt als HMVEC; Life Technologies, Darmstadt, Deutschland; Bestellnummer 011-5C) mit dem Zellkulturmedium 131 (Life Technologies; Bestellnummer M-131- 500) und einem Wachstumszusatz (Life Technologies; Bezeichnung: Bestellnum- mer S-005-25) nach Empfehlung des Herstellers. Die Subkultivierung der Zel- len erfolgte, indem die Monoschicht mit einer Mg2+ /Ca2+ -freien, phosphatgepuf- fertenKochsalzlösung gespültund beiei- ner befeuchteten Atmosphäre, bestehend aus 95 % Luft und 5 % medizinischem Kohlendioxid (Linde, Berlin, Deutsch- land, Laparox®), in einem Brutschrank bei 37 °C inkubiert wurde. Alle Ge- webekulturmaterialien wurden von der Firma TPP (Faust Lab Science, Klettgau, Deutschland) bezogen. Der Ophthalmologe
  4. 4. Originalien 24h Inkubation 100x Mag. Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 % 24h Inkubation + Co-Extrakt 100x Mag. 24h Inkubation + Co-Extrakt + MTT 100x Mag. Abb. 3 8 HMVEC wurden Cobalt ausgesetzt. Nähere Erläuterungen s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzel- len von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium Bromid 24h Inkubation 100x Mag. Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 % 24h Inkubation + Mo- Extrakt 100x Mag. 24h Inkubation + Mo- Extrakt + MTT 100x Mag. Abb. 4 8 HMVEC wurden Molybdän ausgesetzt.Nähere Erläuterungen s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe- nyltetrazolium Bromid Für die Herstellung löslicher Extrakte der Metallpulver wurden 1 g Metallpul- ver und 4 g Wachstumsmedium (Me- dium 131 mit mikrovaskulärem Wachs- tumszusatz)ineinesterile,50mlfassende Glasflasche gegeben. Der Deckel wurde geöffnet, um einen Gasaustausch mit der befeuchteten Atmosphäre aus 95 % Luft und 5 % Kohlendioxid im Inkubations- schrank für 48 h bei 37 °C zu ermög- lichen. Alle 12 h wurde die Suspension aus Metallpulver und Wachstumsmedi- umvorsichtigimUhrzeigersinnfür5sge- schwenkt. Am Ende der Extraktionszeit wurde die Suspension in ein konisches Zentrifugenröhrchen überführt und bei Raumtemperatur für 15 min mit 3000 Umdrehungen pro Minute in einer Ge- webekulturzentrifuge zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wurde durch einen 0,2 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF)- Filter filtriert und bei 4 °C bis zur An- wendung gelagert. Die Extrakte eines un- beschichteten PP-Plättchens wurden ge- nauso wie oben beschrieben vorbereitet. MTT-Tests und Statistik Der MTT-Test beruht auf der Fähigkeit lebender Zellen, das 3-(4,5-Dimethyl- thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT) zum schwer löslichen Formazan zu reduzieren. Für den MTT- Test verwendeten wir unverdünnte Ex- trakte (bezeichnet als 100 % Extrakt), Gemische aus 1 Volumen Extrakt und 1 Volumen Wachstumsmedium (be- zeichnet als 50 % Extrakt), Gemische aus 1 Volumen Extrakt und 4-fachem Volumen Wachstumsmedium (bezeich- net als 20 % Extrakt) und Gemische aus 1 Volumen Extrakt und 9-fachem Vo- lumen Wachstumsmedium (bezeichnet als 10 % Extrakt). Alle Lösungen wurden in 1,5 ml Mikroreaktionsgefäßen herge- stellt. Die Ausführung des MTT-Tests erfolgte mit dem von der Firma LGC Standards GmbH, Wesel, Deutschland, bezogenen System (Bestellnummer 30- 1010K) exakt nach den Angaben des Herstellers. Wir trugen in jede Vertiefung einer 96-Loch-Platte 100 μl Zellsuspension (104 HMVEC im Wachstumsmedium) ein und züchteten die Zellen für einen Tag. Nachdem Fotos aufgenommen worden waren, wurden 100 μl des je- weiligen Extrakts hinzugefügt, und die Zellen wuchsen für einen weiteren Tag. Nach erneuter Dokumentation wurde 10 μl MTT-Reagens pro Vertiefung zu den Zellen hinzugefügt, und die Platten wurden für 2 h im Brutschrank inku- biert. Nach weiteren Fotoaufnahmen wurden kolorimetrische Messungen der optischen Dichte des solubilisierten Prä- zipitates mittels eines Sunrise-ELISA- Lesegerätes der Firma TECAN, Crails- heim,Deutschland,vorgenommen.Dazu wurden 100 μl Detergens pro Vertiefung zugegeben und die abgedeckte Platte für 3 h im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Negativkontrolle wurde die optische Dichte bei 570 nm (Refe- renz bei 750 nm gemessen) von Proben mit Wachstumsmedium erhaltenen op- tischen Dichten abgezogen. Die Umsetzung von MTT wurde als metabolischer Marker herangezogen. Dazu wurde die optische Dichte am Ende des MTT-Experiments von Zellen auf PP-Plättchen als relative metabo- lische Aktivität willkürlich auf 100 % festgelegt. Vor der Beurteilung der opti- Der Ophthalmologe
  5. 5. 24h Inkubation 100x Mag. Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 % 24h Inkubation + Ti-Extrakt 100x Mag. 24h Inkubation + Ti-Extrakt + MTT 100x Mag. Abb. 5 8 HMVECwurdenTitanausgesetzt.NähereErläuterungens..Abb.1. HMVECmenschlichedermalemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachse- nen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid 24h Inkubation 100x Mag. Extrakt 100 % 50 % 20 % 10 % 24h Inkubation + PP- Extrakt 100x Mag. 24h Inkubation + PP- Extrakt + MTT 100x Mag. Abb. 6 8 HMVEC wurden Polypropylen ausgesetzt. Nähere Erläuterungen s. . Abb. 1.HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen von erwachsenen Spendern,MTT 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphe- nyltetrazolium Bromid schen Dichte des aufgelösten Materials wurde eine Phasenkontrastdokumenta- tion der exponentiell wachsenden Zellen durchgeführt, und zwar vor der Zugabe der Extrakte sowie nach der kolorime- trischen Entwicklung des MTT-Tests. Die relative Stoffwechselaktivität wurde ermittelt, indem die optischen Dichten der Negativkontrolle von der optischen Dichte, die aus den Tests mit auf PP- Plättchen erhalten wurden, von den korrespondierenden Werten von metall- beschichteten PP-Plättchen abgezogen. Das Zellgift Dimethylsulfoxid (DM- SO) diente in einer Endkonzentration von 10 % als interne Kontrolle für die- se Prüfreihe. Alle Experimente wur- den in 3-facher Ausführung durch- geführt. Die Mittelwerte der relativen Stoffwechselaktivität wurden mit un- korrigierter Standardabweichung (posi- tiver und negativer Fehlerbalken einer ungepaarten Student-t-Test-Analyse) in einem Balkendiagramm dargestellt. Eine Wahrscheinlichkeit einer doppelseitigen Wahrscheinlichkeit einer Annahme der Null-Hypothese (p-Wert) ist tabellarisch aufgeführt, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant im Vergleich der Ergebnisse angesehen wurde. Wachstum von HMVEC auf metallbeschichteten PP-Plättchen Zur Beurteilung der Auswirkungen der Krumeich-Ring-Legierung bzw. der ein- zelnenMetallkomponentenwurdennach der Desinfektion der Plättchen mit Etha- nol 8,4 × 104 HMVEC auf die metall- beschichteten PP-Plättchen gesetzt und zusammen mit unbeschichteten PP- Plättchen als Kontrolle für 5 Tage in 12-Loch-Platten inkubiert. Alle 48 h erfolgte ein Mediumwechsel. Die Anfär- bung mit Fluoresceindiacetat (FDA) und Propidiumiodid (PI) erfolgte wie in der Literatur beschrieben [5]. Hierfür wur- den 1,2 ml Ringer-Lösung (Rekonstitu- tion von gebrauchsfertigen Tabletten für 500 ml Lösung; Firma Thermo Scientific Oxoid, Hampshire, UK; Bestellnummer BR0052G) ergänzt, um final 100 μg FDA (Sigma, Hamburg, Deutschland; Bezeichnung: cat # F738-5G; 5 mg/ml in Aceton gelagert) und 10 μg PI (Sigma, Hamburg, Deutschland; Bezeichnung: cat # P4170-10MG; 500 μg/ml Stamm- lösung in Ringer-Lösung) zu enthalten. Die so erhaltene Färbelösung wurde frisch mit den Zellen für 10 s inkubiert. Im Anschluss folgte eine fotografische Dokumentation. Ergebnisse Der 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyl-2H-tetrazolium Bromid (MTT)-Versuch beruht auf der Re- duktion von MTT zu einem unlöslichen purpurnen Formazan mit einer maxi- malen optischen Dichte bei 570 nm in vitalen Zellen. Tote Zellen besitzen diese Fähigkeit nicht. Die Anzahl der lebenden Zellen, die Konzentration des eingesetzten MTT, die Länge der Inku- bation von Zellen mit MTT sowie deren metabolische Aktivität haben Einfluss auf die Ergebnisse in diesem Versuch. Werden gleiche Mengen lebender Zellen und ein Überschuss an MTT verwendet sowie gleichbleibende Inkubationsdau- ern, kann anhand der optischen Dichte des solubilisierten Formazan ein Rück- schluss auf die metabolische Aktivität deruntersuchtenZellengezogenwerden. Der Ophthalmologe
  6. 6. Originalien Abb. 7 8 Beschichtung derPlättchen mit Metallpulver. a Beschichtung undFixierung des Metallpul- versaufdemPP-Plättchen.Vonlinksnachrechts:MetallpulveraufeinemfrischvorbereitetenPP-Plätt- chen,welchesaufeinemGlasobjektträgerliegt(links).DasMetallpulverwurdedannmiteinemLabor- spatel gleichmäßig auf demPlättchen verteilt (Mitte),bevoreinMetallring miteinemDurchmesser von 1,5 cm überdas Plättchen gesetztwurde (rechts).b Erwärmung desPlättchens undPressen des Metallpulvers auf das Plättchen.DerGlasobjektträgermitdem metallbeschichteten Plättchenund demRingwurdesolangeaufeinerHeizplatte(130°C)platziert,bisderäußereRanddesopakenPlätt- chens durchscheinendwurde.Dann wurde ein ca.120 g zylindrischesMassestückverwendet,umdas Pulverfür15 s auf das Plättchen zudrücken.Im Anschluss wurde das heiße PlättchenunterderLast des Massestücks auf Raumtemperaturabgekühlt.c Beispielevon fertig beschichtetenPlättchen mit Metallpulver Zuerst versuchten wir mittels einer Tetrazolium-Untersuchung herauszu- finden, ob einzelne Komponenten der Krumeich-Ring-Legierung die Viabili- tät von HMVEC beeinflussen [10, 16]. Dazu brachten wir, wie bereits oben be- schrieben, die exponentiell wachsenden HMVEC für einen Tag mit im Wachs- tumsmedium löslichen Extrakten der einzelnen Bestandteile der Krumeich- Ring-Legierung in Kontakt. Während Wachstumsmedium, bezeichnet als Me- diumkontrolle, welches in der gleichen Weise wie Metallpulver behandelt wur- de, weder die Zellmorphologie noch die Stoffwechselaktivität beeinträchtigte, führtedieErgänzungdesWachstumsme- diums bis zu einerEndkonzentrationvon 10 % DMSO zu einer Veränderung in der zellulären Morphologie und reduzierte das Erscheinungsbild des Bodensatzes aus blauem Tetrazolium-Salz-Metabo- lit erheblich. Somit konnten wir im Rahmen der Untersuchung metabolisch aktive und inaktive Zellen ausmachen (. Abb. 1, 2, 3, 4, 5 und 6). Zur Vorbereitung der im Durchmes- ser 1,5 cm großen und 1 mm dicken Plättchen wurde Polypropylen in einer Spritzgussmaschinebei235°Cfür10sge- schmolzen.DieFormherstellungfandbei 110 °C, einem anfänglichen Einspann- druck von 40 MPa und einem Nach- spritzdruck am Ende des Verfahrens von 25 MPa statt. Es wurden keine signifikanten Verän- derungen, weder was die Zellmorpholo- gie noch das Auftreten eines dunkelblau- en Präzipitats aus Tetrazolium-Salz-Me- tabolit anbelangt, festgestellt. Um Einflüsse der PP-Plättchen aus- zuschließen, wurden weiter die Extrak- te von 2 einzelnen PP-Plättchen in 2 unabhängigen Experimenten analysiert (. Abb. 7a, b). Um diese Ergebnisse zu untermauern, wurden HMVEC für 5 Tage auf mit den einzelnen Bestandteilen der Krumeich- Ring-Legierung beschichteten PP-Plätt- chen und dem Krumeich-Ring selbst ge- züchtet. Die auf diese Weise vorbereiteten PP- Plättchen wurden zur Beschichtung mit Metallpulver einzeln auf einen Glasob- jektträger gelegt. Das Metallpulver wur- de dabei mit einem Spatel gleichmäßig auf dem Plättchen verteilt. Anschließend wurde ein Metallring mit einem Durch- messer von 1,5 cm um das Plättchen gelegt (. Abb. 8a). Der Glasobjektträger mit dem metallbeschichteten PP-Plätt- chen wurde dann auf eine Heizplatte (130 °C) gelegt, bis der äußere Rand des opaken PP-Plättchens schmolz, was an- hand des veränderten Erscheinungsbil- des von opak zu transparent beurteilt wurde. Im Anschluss wurde ein zylin- drisches Massestück von 120 g auf das Plättchen gestellt und auf Raumtempe- ratur abgekühlt (. Abb. 8b, c). In unseren ErgebnissenhabenunverdünnteExtrakte der PP-Plättchen keinen Einfluss auf die Stoffwechselaktivität von HMVEC. Wir beobachteten, dass eine stärkere Verdün- nung des Molybdänextrakts im Wachs- tumsmedium die Viabilität von HMVEC im Vergleich zu der relevanten Ti- bzw. Co-Untersuchung statistisch signifikant erhöhte (10 % Extrakt, Mo-Ti-Vergleich: p = 0,0271 bzw. Mo-Co-Vergleich: p = 0,0118). Der Vergleich 10 % Extrakt Mo- CrliefertezwareinenstatistischenTrend, war jedoch nicht statistisch signifikant (p = 0,0592; . Abb. 8d). Eine vitale Zellschicht auf dem Refe- renzmaterial wurde detektiert (. Abb. 9a, b). Keine lebenden Zellen wurden auf den mit Cobalt bzw. Molyb- dän beschichteten PP-Plättchen detek- tiert (. Abb. 9c, d). Im Gegensatz dazu wurden lebende Zellen, wenn auch in verringerter Dichte, auf den mit Chrom und TitanbeschichtetenPlättchenausge- macht (. Abb. 9e, f). Eine stabile, vitale, einschichtige HMVEC-Besiedlung des Krumeich-Rings lag vor (. Abb. 9g). Daher schlussfolgern wir, dass der intrastromale korneale Krumeich-Ring keine messbaren zytotoxischen Einflüsse auf primäre menschliche mikrovasku- läre Endothelzellen von erwachsenen Spendern ausübt. Diskussion Die anfänglichen Bemühungen um ein tieferes Verständnis derzugrunde liegen- Der Ophthalmologe
  7. 7. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 100% 50% 20% 10% RelaƟveStoffwechselakƟvität[%] ExtraktkonzentraƟon Titan Cobalt Chrom Molybdän Polypropylen Experiment p-Wert 10% Mo-Co 0,0118 Mo-Cr 0,0592 Mo-Ti 0,0271 20% Mo-Co 0,0001 Mo-Cr 0,0004 Mo-Ti 0,0715 50% Mo-Co 0,0001 Mo-Cr 0,0001 Mo-Ti 0,0001 100% Mo-Co 0,6184 Mo-Cr 0,0003 Mo-Ti 0,0021 a ba b c d Abb. 8 8 Höhere Konzentrationen derExtrakte, die aus den einzelnen Bestandteilen derKrumeich-Ring-Legierung vorbe- reitet wurden, scheinen die Stoffwechselaktivitätvon HMVECzu beeinflussen. DieUmsetzung von MTT (.Abb. 1, 2, 3, 4, 5 und 6)wurde als metabolischerMarkerherangezogen.Dazu wurde die optische DichteamEnde desMTT-Experiments von . Abb. 1, 2, 3, 4, 5 und 6von Zellen auf PP-Plättchen als relative metabolischeAktivitätwillkürlich auf 100% festge- legt.Die relative Stoffwechselaktivitätwurde entsprechendden Angaben in Materialien undMethoden ermittelt.Gezeigt sindhierdie kolorimetrischen Dichten alsErgebnisvon Expositionenvon HMVECmit den mediumlöslichen Extrakten von PP-Plättchen (a,b)undden einzelnen Bestandteilen derKrumeich-Ring-Legierung (c).AlleExperimentewurden in 3-facher AusführungdurchgeführtundinFormvonMittelwertenundunkorrigierterStandardabweichung,dargestelltalspositiveund negative Fehlerbalken, in das Diagrammeingetragen.d TabellarischeDarstellung derWahrscheinlichkeiteinerdoppelseiti- gen Wahrscheinlichkeit einerAnnahmederNull-Hypothese(p-Wert)imRahmen einerungepaarten Student-t-Test-Analyse derdargestellten Vergleiche.p-Werte von unterhalb 0,05 sindals statistischsignifikantangesehen. HMVECmenschliche der- malemikrovaskuläreEndothelzellenvonerwachsenenSpendern,MTT3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid Der Ophthalmologe
  8. 8. Originalien Gewebekulturschale PP- Plättchen TitanChrom Cobalt Molybdän Krumeich-Ring a b c d e f g 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm 200 µm200 µm Abb. 9 8 HMVEC haften an undwachsen auf demintrastromalen kornealenKrumeich-Ring.Darge- stelltsindhierHMVEC,dieaufdemReferenzmaterial(aZellkulturkunststoffschale,bPP-Plättchen)den einzelnen Komponenten des Krumeich-Rings (c,d,e,f)unddem Krumeich-Ring selbst(g)wachsen. Lebende Zellen sind grün undrote Zellen sind rot angefärbt. Der Maßstabsbalken entspricht200 μm. HMVEC menschliche dermale mikrovaskuläre Endothelzellen von erwachsenenSpendern Abb. 10 8 OptischesErscheinungsbildderExtrakteausTitan-,Chrom-,Mo- lybdän- undCobaltmetallpulververglichen mitdemWachstumsmedium. Von linksnach rechts: Titan-,Chrom-,Molybdän- undCobaltmetallpulver verglichen mit dem WachstumsmediumnachderFiltrierung durch einen 0,2 μm PVDF-FilterundvorderBenutzung im MTT-Test.MTT 3-(4,5-Dime- thylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromid den Zellbiologie waren motiviert durch die scheinbare Unstimmigkeit in veröf- fentlichten Arbeiten bezüglich der Aus- wirkungen des intrastromalen kornealen Krumeich-Rings auf das Gewebe der Pa- tienten [1, 9]. Als Studienobjekt wurden primäre menschliche dermale mikrovas- kuläre Endothelzellen von erwachsenen Spendern (HMVEC) ausgewählt, da die publizierten Ergebnisse die Vermutung nahelegen, dass die Entstehung von Neo- vaskularisationen von einem unbeein- trächtigtenStoffwechselderEndothelzel- len abhängt [19]. Unsere Ergebnisse unterstützen die Annahme, dass der intrastromale Kru- meich-Kornearing die Viabilität von HMVEC nicht beeinflusst. Eine höhere Verdünnung von Molybdänmetallpul- ver, welches in das Wachstumsmedium eingegeben wurde, erhöht die Stoff- wechselaktivität von HMVEC. Außer- dem haften und wachsen HMVEC am Krumeich-Ring. Während unsere Er- gebnisse in Einklang mit der Annahme sind, dass keine negativen Auswirkun- geninunseremModellsystemaufgedeckt werden, sind weitere Versuchsdurchfüh- rungen erforderlich, um die scheinbare Unstimmigkeit in der Literatur bezüg- lich der nach dem klinischen Einsatz des intrastromalen Krumeich-Rings be- schriebenen Wirkungen zu lösen [1, 9]. Als mögliche Erklärung für dieses Phänomen wird die noch nicht voll- ständig verstandene Biochemie von Molybdän in menschlichen Zellen vor- geschlagen, (s. hierzu Plitzko et al. [13] und die darin enthaltenen Referenzen). Die Ergebnisse des MTT-Tests sind jedoch im Lichte von Limitierungen des MTT-Tests zu sehen: Verbindungen, die den pH des Mediums verändern, sowie die Sensitivität der untersuchten Zellen gegenüber den eingesetzten Materialien müssen berücksichtigt werden. Die ein- gesetzten dermalen Zellen sind hier als Modell für die stromale Umgebung des Ringes in der Kornea hinreichend als Studienobjekt, jedoch nicht direkt auf die stromale Umgebung der Kornea in Patienten übertragbar. Weiterhin ist von besonderer Relevanz, dass in unseren Untersuchungen eine Farbänderung des Mediums nach Erstellung von löslichen Extrakten von Metallpulvern beobachtet wurde (. Abb. 10). Weitere Untersu- chungen sind daher notwendig, um die beobachteten Phänomene mit den oben genannten Limitierungen einerseits auf die zugrunde liegenden zellbiologischen Mechanismen zurückzuführen und an- dererseits durch weitere Modellversuche auf eine breitere Basis zu stellen. Zudem sind die Zeiträume in die Überlegungen einzubeziehen. In dieser Studie wurden Inkubationen über 5 Tage betrachtet, während der Ring über Jahre im Patien- ten verbleiben kann. Fazit für die Praxis 4 Der intrastromale korneale Kru- meich-Ring übt keine messbaren zytotoxischen Auswirkungen auf HMVEC aus. 4 Eine höhere Verdünnung von Molyb- dänextrakten im Wachstumsmedium erhöht die Viabilität von HMVEC. Der Ophthalmologe
  9. 9. Korrespondenzadresse Dr. J. Storsberg Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung IAP 14476 Potsdam-Golm, Deutschland joachim.storsberg@iap.fraunhofer.de Einhaltung ethischer Richtlinien Interessenkonflikt. C.Schmidt,S.Rehfeldt,S.Klöp- zig,V.Jentzen,J.BohrischundJ.Storsberggeben an,dasskeinInteressenkonfliktbesteht.A.Messner istVorstandsvorsitzenderundGeschäftsführerder HumanOpticsAG,derHerstellerindesKrumeich-Kor- nearings.S.FabinyiistMitarbeiterinderHumanOptics AG.AlleanderenAutorengebenan,dasssiekeiner OrganisationoderEinrichtungzugehörigsind,die einfinanziellesodernichtfinanziellesInteressean ProduktenoderMaterialienhat,diehierdiskutiert werden. DieserBeitragbeinhaltetkeinevondenAutoren durchgeführtenStudienanMenschenoderTieren. Literatur 1. Birnbaum F, Schwartzkopff J, Böhringer D et al (2011)Theintrastromalcornealringinpenetrating keratoplasty-long-term results of a prospective randomizedstudy.Cornea30:780–783 2. Cantelmo AR, Brajic A, Carmeliet P (2015) Endothelial metabolism driving angiogenesis: emerging concepts and principles. Cancer J 21:244–249 3. Chu HS, Hsieh MC, Chen YM et al (2014) Anterior corneal buttons from DSAEK donor tissue can be storedinoptisolGSforlateruseintectoniclamellar patchgrafting.Cornea33:555–558 4. FaresU,SarhanAR,DuaHS(2012)Managementof post-keratoplasty astigmatism. J Cataract Refract Surg38:2029–2039 5. Jones KH, Senft JA (1985) An improved method to determine cell viability by simultaneous staining with fluorescein diacetate-propidium iodide. J HistochemCytochem33:77–79 6. Keenan TD, Jones MN, Rushton S et al (2012) Trends in the indications for corneal graft surgery in the United Kingdom: 1999 through 2009. Arch Ophthalmol130:621–628 7. Kilarski WW, Samolov B, Petersson L et al (2009) Biomechanical regulation of blood vessel growth duringtissuevascularization.NatMed15:657–664 8. Krumeich JH, Daniel J (1999) Perforating ke- ratoplasty with an intracorneal ring. Cornea 18:277–281 9. Krumeich JH, Duncker G (2006) Intrastromal cornealringinpenetratingkeratoplasty:evidence- basedupdate4yearsafterimplantation.JCataract RefractSurg32:993–998 10. Kupcsik L (2011) Estimation of cell number based on metabolic activity: the MTT reduction assay. MethodsMolBiol740:13–19 11. Liu W, Schultz KM, Zhang K et al (2014) In vivo corneal neovascularization imaging by optical-resolution photoacoustic microscopy. Photoacoustics2:81–86 12. McNeill JI, Wessels IF (1989) Adjustment of single continuous suture to control astigmatism after penetrating keratoplasty. Refract Corneal Surg 5:216–223 13. Plitzko B, Ott G, Reichmann D, Henderson CJ, Wolf CR, Mendel R, Bittner F, Clement B, Havemeyer A (2013) The involvement of mitochondrial amidoxime reducing components 1 and 2 and mitochondrial cytochrome b5 in N-reductive metabolism in human cells. J Biol Chem288:20228–20237 14. Riddle HK Jr, Parker DA, Price FW Jr (1998) Management of postkeratoplasty astigmatism. CurrOpinOphthalmol9:15–28 15. Sholley MM, Ferguson GP, Seibel HR et al (1984) Mechanisms of neovascularization. Vascular sprouting can occur without proliferation of endothelialcells.LabInvest51:624–634 16. Sieuwerts AM, Klijn JG, Peters HA, Foekens JA (1995) The MTT tetrazolium salt assay scrutinized: howtousethisassayreliablytomeasuremetabolic activity of cell cultures in vitro for the assessment of growth characteristics, IC50-values and cell survival.EurJClinChemClinBiochem33:813–823 17. Staton CA, Reed MW, Brown NJ (2009) A critical analysisofcurrentinvitroandinvivoangiogenesis assays.IntJExpPathol90:195–221 18. Tan JC, Holland SP, Dubord PJ et al (2014) Evolving indicationsforandtrendsinkeratoplastyinBritish Columbia, Canada, from 2002 to 2011: a 10-year review.Cornea33:252–256 19. Vandekeere S, Dewerchin M, Carmeliet P (2015) Angiogenesis revisited: an overlooked role of endothelial cell metabolism in vessel sprouting. Microcirculation22:509–517 20. Zheng Y, Lin H, Ling S (2011) Clinicopathological correlation analysis of (lymph) angiogenesis and cornealgraftrejection.MolVis17:1694–1700 Der Ophthalmologe

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