2. Consultando i Registri dei Tumori si evince che attualmente il carcinoma prostatico
nei Paesi Occidentali è il secondo tumore maschile più frequente:
nei Paesi della Comunità Europea presenta un tasso di incidenza di 55 casi su
100.000 individui e un tasso di mortalità di 22,6 decessi su 100.000 individui;
in alcuni Paesi, quali Stati Uniti e nei Paesi Scandinavi rappresenta il tumore
addirittura più frequente fra i maschi.
3. La diagnosi si effettua mediante:
• esame digito-rettale( DRE)
• Agobiopsia prostatica
• Dosaggio del PSA sierico
• Ecografia trans-rettale (TRUS)
Attuali strategie diagnostiche
il più adatto come test di screening
per considerazioni complessive di
costi e facilità di esecuzione.
Tuttavia manca di un’adeguata
accuratezza diagnostica in assenza
di sintomi, poiché è un biomarker
organo-specifico, ma non tumore-
specifico.
Caratteristiche Marker tumorale in diagnosi precoce
•Sensibilità, presente in tutti i pazienti con una determinata patologia
•Specificità, tipico del tumore e assente nei tessuti non neoplastici
4. Come reso noto negli ultimi mesi sulla rivista “Nature”, sono state
avviate delle ricerche volte all’individuazione dei metaboliti che
distinguono le patologie benigne, il carcinoma alla prostata e le sue
metastasi nella forma avanzata. Da campioni di tessuto prostatico,
siero e urine, sono stati isolati metaboliti che distinguono il cancro
alla prostata rispetto il tessuto prostatico benigno. Di questi
metaboliti 6 sono risultati di particolare interesse, perché i loro
livelli sono stati superiori nel tessuto metastatico. In particolare la
SARCOSINA in urina è stata vista come biomarker per la
progressione del cancro.
5. La sarcosina
E’ un derivato metilato dell’amminoacido glicina.
CAMBIAMENTI dei LIVELLI di SARCOSINA
riflettono
SVILUPPO e PROGRESSIONE del cancro alla prostata
N
H
COOH
6. Obiettivo del lavoro di tesi :
Sviluppo di un metodo ‘easy’ per la determinazione della sarcosina in urina
Punto di partenza: metodo che ha portato all’individuazione della sarcosina
Iniettare nel GC-MS campione di urine da analizzare previa derivatizzazione.
Procedura lunga e laboriosa,
Impiego di solventi organici inquinanti
Sangue
Tessuto
prostatico
urine
Benigno
carcinoma
metastatico
Preparazione campione:
1. Estrazione sequenziale in fase organica
2. Liofilizzazione
3. Risolubilizzazione
4. Dissecamento
5. derivatizzazione in ambiente anidro (N2)
dopo 24 ore dal dissecamento
separazione/ rilevazione GC-MS
Spettri di massa
1. Identificazione picco
2. Analisi quantitativa
7. Necessità di sviluppare un metodo alternativo:
sul campione di urina tal quale,
Più rapido ed efficiente,
Ecologico.
Sul campione di urina da esaminare previa derivatizzazione.
Scelta del metodo:
8. Esposizione fibra al campione
In spazio di testa (HS-SPME)
analiti volatili
matrici problematiche
In immersione diretta
analiti meno volatili
Deterioramento fibra più rapido.
equilibrio tra fasi eterogenee
t ads
Introduzione fibra iniettore GC
Desorbimento termico.
Intrododuzione analita in colonna cromatografica
Metodo SPME-GC-MS
9. Sviluppo del metodo SPME-GC-MS/MS.
I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici
SCOPO: rendere gli amminoacidi volatili, quindi investigabili tramite GC-MS.
Metodo scelto: COOHR
NH2
HN
O
OR2
R
OR1
O
Alchil cloroformiato
Alcool/py
Temperatura ambiente
(2 min)
amminoacido N-alcossicarbonilestere
• CH3OH/isobutil cloroformiato
• isobutanolo / isobutil cloroformiato
• etanolo/ etil cloroformiato
N
O
OEt
OEt
O
Etil cloroformiato
Etanolo/py
Temperatura ambiente
(2 min)
sarcosina sarcosina derivatizzata
N
H
COOH
Estratto con SPME
10. II-Valutazione del tempo di reazione, treaz
Da prove su una soluzione di 1mg/L di sarcosina
treaz 2min
5 min
10 min
15 min
20 min
La resa della reazione non aumenta oltre.
I -Derivatizzazione amminoacidi in campioni biologici
11. III-Scelta programmata di temperatura forno GC
Prove direttamente in urina 50 mg/L di sarcosina .
sarcosina
alanina
T(°C) v (°C/min) Hold
(min)
50 0 10
210 20 5
280 30 2
50 75 100 125 150 175 m/z
0%
25%
50%
75%
100%
44
56
72 88
102
116
130
143
164
189
N
H
COOH H2N COOH
sarcosina alanina
T(°C) v (°C/min) Hold
(min)
70 0 5
210 8 2
280 60 2
Spettro di massa EI full scan
13.5 14.0 14.5 15.0 15.5 16.0 16.5minutes
0
5
10
15
20
25
30
kCounts
0
10
20
30
40
50
60
kCounts
0
10
20
30
40
50
60
70
kCounts
0
10
20
30
40
50
kCounts
A
B
C
D
Rs= 0,84
Rs= 1,2
Rs= 1,8
Rs= 1,5
12. IV-Scelta della fibra e del tempo di adsorbimento analisi SPME in immersione .
Scopo: escludere a priori le fibre meno efficienti e inserire nell’Experimental
Design solo una fibra.
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
2 min 5min 10 min 20 min
Kcount
tads fibra Polyacrilato
0
50000
100000
150000
200000
250000
2 min 5 min 10 min 20 min
Kcount
tads fibra CAR/ DVB
0
100000
200000
300000
400000
500000
2 min 5 min 10
min
20min
Kcount
tads fibra DVB/ CAR/ PDMS
0
100000
200000
300000
400000
2 min 5 min 10 min 20 min
Kcount
tads fibra PDMS/DVB
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
2
min
5
min
10
min
20
min
Kcount
t ads fibra PDMS
0
100000
200000
300000
400000
500000
Kcount
13. In immersione, precoce deterioramento della fibra;
La piridina è la probabile causa.
Analisi SPME in spazio di testa
Le condizioni di estrazione però cambiano ⇒
V-Valutazione fibra in head-space
0
50000
100000
150000
200000
bianca
azzurra
grigia
rosa
rossa
Area
fibra
tads=20 min
14. In head-space n° di molecole adsorbite dalla fase stazionaria correlato
rapporto volume campione/volume vapore spazio di testa.
VI-Valutazione volume campione
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
3 ml 4 ml 5 ml
Area
3 ml
4 ml
5 ml
15. VII-Analisi in spettrometria tandem (MS/MS):
Scopo: aumentare sensibilità e selettività del metodo
isolamento ione caratteristico dell’analita
Frammentazione
Ioni figli caratteristici
Corrente ionica ioni figli
• si annulla il problema interferenti
• aumenta il rapporto segnale/rumore.
Picco base spettro in EI full scan e CI full scan
17. VIII - Ottimizzazione parametri HS-SPME tramite “Experimental Design”
Le analisi SPME sono sensibili ai seguenti parametri:
• fibra
• tempo di desorbimento
• tempo di adsorbimento
• temperatura di desorbimento
• temperatura di adsorbimento
• presenza di Sali
• pH
Poco importante,
analita non sensibile alla temperatura
Già scelta
Non valutato • allungamento tempi di analisi
• range di pH della fibra 1-7⇒
variazioni di pH solo verso valori acidi, ma presenza di
funzione amminica ⇒ nessun miglioramento analitico
4parametri da studiare
18. Scopo: individuazione variabili più significative
20 prove sperimentali
CI-MS/MS
Fibra poliacrilato
Variazione 4 parametri SPME prescelti
Ottimizzazione parametri SPME
2 possibilità:
Approccio univariato
Approccio multivariato Experimental Design
variabili sono fatte variare contemporaneamente
•Singolo effetto di ogni variabile
• Interazioni tra variabili
adeguatamente progettate :
massima infomazione con
minimo numero
di prove.
-Tempo
- costi
20. Valutazione LOD/LOQ
Sulla base del risultato ottenuto in CI-MS/MS
Il calcolo è stato eseguito secondo le indicazioni IUPAC /Commissione American Chemical Society
sulla chimica analitica ambientale:
SRB = segnale di un bianco e
σRB = deviazione standard segnale bianco.
Ottenuti analizzando 3 volte
un bianco.
LOD = 0,9 µg/L e LOQ =1,7 µg/L.
paragonabili ai valori riportati nel lavoro di Nature
21. Conclusioni:
E’ stato sviluppato un metodo per la determinazione quantitativa della sarcosina.
Metodologia: estrazione analita campione di urina tal quale tramite SPME in spazio di
testa dopo rapido processo di derivatizzazione ed analisi CI-MS/MS .
Risultati raggiunti:
•Rispetto dell’ambiente (senza solventi organici)
• sensibilità e specificità ( MS/MS)
• Riduzione tempi preparazione campione rispetto lavoro su Nature.
• Analisi conclusa in 45 min.
Hinweis der Redaktion
Tre sono i metodi disponibili:
Anidride trifluoroacetica/ n-butanolo
acilazione ed esterificazione in 2 step
Agenti silanizzanti (BSTFA o MTBSFA)
contemporanea silanizzazione delle funzioni acida e basica in 30 min
Entrambi mezzi non acquosi / Talte
Acilazione/esterificazione
in pochi secondi
in mezzi acquosi
Tamb
6 ml di volume non sono stati valutati, perché analisi head-space non può essere praticamente realizzata. Inevitabilmente la fibra viene immersa nel campione.
Come agiscono queste variabili e come interagiscono tra di esse
Con prove
Nome programma.
Bianco urina (dovrebbe essere senza sarcosina), in urina c’è sarcosina, quindi si valuta il segnale immediatamente successivo alla sarcosina.