1. Identificación de un tipo
celular en los órganos
periféricos de ratón:
«Células Dendríticas»
Equipo 6
Sara Hernández Xico
Carlos Manuel Malpica Márquez
Greysi Gutiérrez Porras

2. Identification of a novel cell type in
peripheral lymphoid organs of mice
 Autor: Ralph M. Steinman
 Morfología, cuantificación y distribución en el tejido.
 The Rockefeller University, New York.
 Laboratorio de Zanvil A. Cohn
 Artículo recibido para su publicación él 19 de enero de 1973.
 Revista Journal of Experimental Medicine

3. Premio Nobel de medicina 2011
Los aportes de los
premiados iniciaron un
camino que condujo al
replanteo de aspectos
esenciales de la respuesta
inmune.
 El 50% del premio fue concedido a Ralph M. Steinman por el
descubrimiento de las células dendríticas.
 El 50% restante fue otorgado a Bruce A. Beutler y Jules A. Hoffman,
por sus descubrimientos relativos a la activación de la inmunidad
innata.

4. Un poco de historia…
• Realizó sus estudios de grado en la
Universidad McGill de Montreal.
 Ralph M. Steinman, Premio Nobel de
Medicina 2011.
• Doctorado en Medicina en 1968 en la
Universidad de Harvard.
 Descubrimiento de las células
dendríticas y la caracterización de su
papel en la inmunidad adaptativa.
• Completó su formación médica como
residente interno del Hospital General de
Massachusetts.
 Inmunólogo canadiense, murió tres
días antes del anuncio del Premio
Nobel.
• Recibió galardones por sus
investigaciones sobre células dendríticas,
tales como el Premio Albert Lasker para la
Investigación Médica Básica (2007).
• Fue miembro de la Academia Nacional de
Ciencias de los Estados Unidos en el 2001.
Ralph M.
Steinman

5. Su lucha contra el cáncer…
 Steinman murió de cáncer de páncreas.
 Luchó su cáncer mediante el uso de
Un documento que publicó a
principios de este año en el
terapias experimentales con sus
Journal of Clinical Oncology
describe descubrimientos.
una vacuna de células
dendríticas en glioma avanzado,
una forma agresiva de cáncer
cerebral. Nueve de las 22
personas que la recibieron
estuvieron vivas un año después y
sin signos de progresión, una
rareza en un cáncer tan grave
como éste.
 Como todas las vacunas contra el
cáncer, ha sido un reto conseguir la
inmunoterapia con células dendríticas
para destruir tumores en las personas.
Él tenía una gran fe en las
células dendríticas
 El objetivo es activar selectivamente ciertas células T que se adaptan mejor para
apuntar el cáncer.
Creía que establecerían la
inmunidad, y que curaría el
 Una de las dificultades es que las células dendríticas de cada persona son
diferentes, por lo que las vacunas deben ser personalizadas, cáncer.
haciéndolas costosas
y requieren mucho trabajo para producirse.

6.  Hoy sabemos, gracias a Steinman y colaboradores, que las células
dendríticas son responsables, de activar linfocitos T vírgenes y también de
orquestar la respuesta adaptativa hacia microbios, tumores y antígenos
propios e imponer un perfil determinado de respuesta T efectora.
En este contexto, no es
exagerado asumir que las
células dendríticas, aun
cuando pertenecen a la
 Las células dendríticas son capaces de sensar señales de peligro en tejidos
periféricos, migrar hacia órganos linfáticos secundarios (ganglios linfáticos,
bazo) y activar linfocitos T.
inmunidad innata,
 A su vez, estas células son responsables de cambiar el curso de la respuesta
constituyen el “motor” y
“cerebro” de la inmunidad
inmune adaptativa, merced a su capacidad de liberar citoquinas que
inducen la diferenciación de células T CD4 hacia perfiles T efectores
particulares.
adaptativa.
 Cada uno de estos perfiles inmunológicos pone en juego diversos
mecanismos inmunitarios frente al desafío con diferentes patógenos (virus,
bacterias, parásitos y hongos) y al desarrollo de tumores.

7. En 1973, en un trabajo publicado
en la revista Journal of
Experimental
Medicine (Identification of a novel
cell type in peripheral lymphoid
organs of mice)
identificó, células con
morfología y funcionalidad
diferente a otras poblaciones
celulares de bazo de ratón, a
las cuales bautizó con el
nombre de “células dendríticas”

8. Introducción
 Durante el curso de las observaciones sobre las células de bazo de
ratón que se adhieren a superficies de cristal y de plástico, estaba
claro que esta población era muy heterogénea.
 Además de fagocitos mononucleares, granulocitos y linfocitos,
notaron células estrelladas con propiedades distintas de las
anteriores.
 En el trabajo se caracterizan propiedades funcionales in vitro, así
como su localización y propiedades in situ.

9. Materiales y métodos
 Ratones outbred mantenidos en la Universidad Rockefeller
 Suspenciones de células individuales de bazo se prepararon en dos
formas generales.
Método 1
 1.- el método manual involucraba tomar el bazo con pinzas finas en
un medio a temperatura ambiente , además por aspiración varias
veces en una pipeta Pasteur y se transfirieron a un tubo Falcon.
 Los restantes grupos de tejido se dejaron sedimentar durante 5
minutos.

10.  El sobrenadante se aspiró y se centrifugó durante 10 min a
temperatura ambiente.
 El sedimento de células se resuspendieron en medio de 199 a 10%
de suero de ternera fetal ([FCS] se calentó durante 30 minutos a 56 °
C; Medio 199 y FCS se obtuvieron de Grand Island Biological
Company, Grand Island, NY).
 Se suplementó con 100 U / ml de penicilina.

11. Método 2
 Otro método de recolección de células de bazo (fragmentos por sí
solos, o fragmentos y células individuales) fue con colagenasa
clostridial durante 15 min en un baño de agua a 37 ° C, sin
agitación.
 La pequeña cantidad de tejido no digerido residual se dejó
sedimentar, y luego la suspensión sobrenadante, de una sola célula
se aspiró, se centrifugó, se lavó y se resuspendió en medio de
cultivo como se describió anteriormente.
 Las alícuotas de la suspensión de células se cultivaron en
cubreobjetos de vidrio o de plástico en cajas de Petri durante 1 hora
a 37 ° C.

12.  Las células no adherentes se eliminaron con cuatro a cinco lavados
de Medio 199 con remolino de las placas de cultivo entre lavados.
 Un procedimiento más vigorosa incluye el uso de un único lavado
en la que el chorro de fluido de lavado se dirige con una jeringa
directamente en la monocapa de células adherentes, en vez de a un
lado del recipiente de cultivo.
 Las células adherentes fueron examinadas inmediatamente o
después de un nuevo cultivo en medio 199-10% FCS a 37 ° C.

13. En otros órganos…
 Células adherentes de la cavidad peritoneal y medula ósea fueron
cosechadas como se ha descrito previamente.
 Células de exudado peritoneal se obtuvieron a partir de ratones
inyectados durante 3 días por vía intraperitoneal de tioglicolato.
 Timo, ganglios linfáticos, el hígado, las placas de Peyer, y el intestino
fueron interrumpidas por el procedimiento enzimático descrito para el
bazo.

14. Microscopía de contraste de fase
 Examen con microscopio de contraste de fases se realizó en células vivas
cultivadas en cámaras de Sykes-Moore, o en las muestras fijadas por 5
minutos a temperatura ambiente en 1,25-2,5% glutaraldehído, tamponado
con cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4.
 Observaciones sobre las células vivas se registraron en película negativa
Kodak Plus X, no. 7231, utilizando una serie de 500 aparatos
cinefotomicrográficos.

15. Procedimientos de tinción
 Tinción vital para las mitocondrias y los lisosomas se obtuvo mediante la
aplicación de Janus verde y rojo neutro, respectivamente, a concentraciones
de 1: 10.000 (mg / ml de medio 199) durante 1 minuto a temperatura
ambiente.
 Cubreobjetos fijos en metanol absoluto se tiñeron con Giemsa, mientras que
la solución de formaldehído al 4% en agua se utiliza para los procedimientos
de ácido periódico de Schiff y hematoxilina-eosina.
 0,1% de azul de toluidina en tampón fosfato 0,1 M, pH 6,2, se utiliza para
teñir los ácidos nucleicos de células fijados con glutaraldehído después del
tratamiento con ribonucleasa (RNasa 0,5 mg / ml) en 0,1 M de fosfato, pH
7,0, para 2 horas a 37 ° C.

16.  Varios tinciones histoquímicas se aplicaron a células fijadas 5 min en
1,25% de glutaraldehído incluyendo: fosfatasa ácida (16);
dependiente de magnesio adenosina trifosfatasa (ATPasa); Azul de
Prusia de Perls para el ion férrico; y la técnica de Graham y de
Karnovsky para la peroxidasa.
 También se utilizó el método de Kaplow para la peroxidasa.

17. Microscopía Electrónica
 Muestras para microscopía electrónica se prepararon de dos formas
 1.- Fijados en glutaraldehído células se rasparon de cubreobjetos y se
cosechan como una pastilla como se describe previamente. El
sedimento se fijó posteriormente durante 15 minutos en una mezcla
de tetróxido de osmio-glutaraldehído frío seguido de tinción en
bloque durante 15 minutos con 0,5% de acetato de uranilo magnesio
en solución salina, pH 5,0.
 2.- Alternativamente las células fueron procesadas por completo en
cubreobjetos previamente recubiertos con carbono vaporizado. El
método fue idéntico a la de Ross, excepto que el glutaraldehído 2,5%
en tampón de cacodilato 0,1 M, pH 7,4, fue el fijador.

18. RESULTADOS

19. Morfología de las células de ratón bazo
adherentes
 Observaciones de contraste de fase:
 Como se ha señalado por otros autores , de 10 50% de las células nucleadas
en el bazo del ratón se adhieren a las superficies de cristal y de plástico
después de 60 minutos a 37 ° C.
 Varios tipos de células nucleadas, así como las células que mueren, restos de
células, glóbulos rojos y plaquetas, se pueden distinguir por microscopía de
contraste de fase de las preparaciones de células adherentes fijados en
glutaraldehído.
 Granulocitos maduros, pueden ser reconocidos por su contenido en
pequeños gránulos de fase densa (neutrófilos) o más grandes gránulos
refringentes (eosinófilos). Los mielocitos menos maduros son células
grandes, con un contorno irregular, y contienen numerosos gránulos de fase
densa agrupados sobre una zona de Golgi clara y núcleo oval o en forma de
riñón.

20.  Las células linfoides también se adhieren al vidrio y generalmente
asumen formas circulares con superficies de células lisas.
 Linfocitos pequeños poseen una cromatina densa y una alta
relación núcleo citoplasma.
 Linfocitos grandes tienen un núcleo más refringentes y más
citoplasma, en el que uno puede discernir muchos, orgánulos
grandes, circulares de fase densa.
 Las células plasmáticas, también son reconocidas por sus núcleos
característicos excéntricos y zonas de Golgi claras.

21.  Los fagocitos mononucleares que contienen núcleos en forma de riñón
están presentes en diversos grados de diferenciación que van desde los
monocitos a macrófagos grandes complejos.
 La superficie de los monocitos se alborotó, y gránulos citoplasmáticos y
vesículas son con frecuencia en una posición perinuclear.
 Los macrófagos también tienen una superficie de volantes, pero exhiben
un mayor número de orgánulos citoplasmáticos: vesículas de pinocitosis,
lisosomas, mitocondrias filamentosas, fagocitado objetos, y las inclusiones
refráctiles.
 Con frecuencia, los macrófagos están cubiertas con linfocitos, glóbulos
rojos, y las células muertas que forman racimos que sólo puede ser
interrumpido por lavado vigoroso.

22. Además de granulocitos,
linfocitos y fagocitos
mononucleares, hay una
cuarta variedad de
adherente, de células
nucleadas cuyas
características
morfológicas son
bastante diferentes.

23. El proceso de identificación
Primeramente es descrito en el articulo acerca de la identificación de las células
conocidas como : linfocitos, granulocitos y fagocitos mononucleares y por ultimo se
menciona que es identificada una célula de adhesión cuyas características morfológicas
son distintas a las demás

24. Características
 El citoplasma de estas células grandes se dispone en seudópodos de
varias formas , longitudes y números , esto resulta en diferentes formas
para la célula , que pueden ser , estrelladas , alargadas bipolares hasta
dendríticas

25.  La mayoría de los seudópodos son largos , y uniformes en anchura , poseen
terminaciones contundentes y también eran apreciables procesos espinosos.
 El citoplasma de estas células contiene muchos gránulos circulares largos y de fase
densa , steinman menciono que en la superficie de esta célula no se encontraban
vesículas visibles y había muy poco material fagocitado , también no se había
asegurado su capacidad de activar endocitosis.
 El núcleo de la célula dendrítica es muy largo y posee una forma contorneada , su
membrana nuclear esta conformada por una línea densa de fase uniforme , su
nucleoplasma es translucido exceptuando zonas de largas masas cromatinas
generalmente opuestas a la membrana.

26.  Dadas las características morfológicas se llego a la conclusión que la célula
dendrítica puede adquirir diversos tipos de formas , y que existían
normalmente en los tejidos de adhesión en proporciones de población en un
rango de 5 – 50% en las células del bazo del ratón

27. Colorantes
 Para los diversos métodos de identificación se usaron
colorantes específicos para diversos tipos de tinción.
 Colorantes vitales: los organelos esféricos de fase densa que
llenan los seudópodos de las células dendríticas pueden ser
teñidos de manera natural con verde de janus estas son las
mitocondrias , mientras que lisosomas se tiñen con rojo
neutral

28.  Colorantes histológicos de células de adhesión fijadas :
el núcleo y citoplasma de las células dendríticas se tiñe
débilmente tras la aplicación de diversas tinciones
básicas como lo pueden ser :azul de toluidina ,
GIEMSA y hematoxilina , que pueden ser identificadas
tras la fijación con glutaraldehido, metanol o
formaldehido , esto haciendo uso de un microscopio
de contraste de fases

29.  Colorantes histoquímicos: las células dendríticas difieren en el procedimiento de tinción
de otros macrófagos , primero por el contenido de sus granulos y su localización ,
localización de algunas enzimas como ATPasa en la membrana de la cual la célula
dendrítica carece , la tercera diferencia es la respuesta al azul de Prusia que tiñe a
muchos macrófagos y a la celula dendrítica no

30. La identificación
 Para la identificación de la célula dendrítica se
realizo en base a métodos de microscopia de
contraste de fase y campo claro así como
microcinematografía , Las observaciones
realizadas en la célula dendrítica demostraron
sus cualidades respecto a las de otros
macrófagos cuando son preparados de la
misma forma

31. Movimiento
 El protoplasma de la célula dendrítica se
mueve hacia atrás y adelante en una manera
pulsátil , también su núcleo encaja en los
confines de los seudópodos , la célula
constantemente saca y retrae pequeñas
dendritas citoplasmas en largos periodos ,
formas y orientación

32. Microscopia electrónica
 Se identifico a la célula dendrítica en secciones delgadas de la población
celular , esto en base a criterios de estudios de contraste de fase
 Entre las observaciones realizadas se encontró que :
 Posee una superficie celular suave desprovista de micro proyecciones y
lagunas
 El citoplasma contiene grandes mitocondrias con cristae bien desarrollada
y secciones cortas de RER
 La región perinuclear es pequeña y contiene al aparato de Golgi , asi como
cuerpos membranosos y multivesiculares

34.  Largos micro túbulos radian desde la región perinuclear desde el eje de los seudópodos
 Se observan microfilamentos cerca del plasmalemma
 Ribosomas relativamente menores en numero
Diferencias:
 Superficie celular
 Mitocondrias numerosas y pequeñas
 Aparato de Golgi hipertrofiado

35. Distribución tisular de células dendríticas
Célula Dendrítica
 Dendritic Cell – De la palabra
griega Árbol (por sus
ramificaciones)
 Ratón atímico desnudo

36. 1.0-1.6% de la
población total
de células
nucleadas

37.  Suspensiones de células individuales de diversos órganos.
 Las células se cultivaron durante 1 h en cubreobjetos de vidrio. Después del lavado, se contó el
número de células dendríticas adherentes por triplicado. Cada valor comprende datos de al menos
cuatro ratones.

38. “Es concebible que la totalidad de la población de
células dendríticas del bazo se limita a pulpa blanca”
 El porcentaje de células dendríticas fue
consistentemente mayor (1.5-6 veces) en pulpa
blanca frente a pulpa roja.
 El bazo tiene ambas pulpas y es difícil separarlas,
ya que la pulpa roja se encuentra distribuida en
hebras estrechas a lo largo de los nódulos pulpa
blanca.
 Porcentajes similares en hembras y machos.

39.  Las DC no se encontraron en timo. Similares en contorno y morfología nuclear.
 Citoplasma diferente
 Las mitocondrias filamentosas, gránulos pequeños de fase densa (lisosomas).

40. Células dendríticas
Órganos
linfoides
periféricos
* Bazo
* Placas de Peyer
* Ganglios linfáticos
Microscopia de
contraste de fase
Características
* Núcleo refractante
* Mitocondria grande
* Vesículas de pinocitosis
* Abundantes lisosomas
* Núcleo adherente
* Procesos citoplasmáticos
Criterios morfológicos después de la
adhesión y difusión sobre superficies de
vidrio o plástico.
Célula reticular
(Primitiva)
No específico,
cualquier célula
que tiene
procesos
citoplasmáticos
largos
Microscopia
electrónica

41. Generalidades
 Ralph M. Steinman
Características morfológicas
 Núcleo grande
 Refringentes
 Retorcida en forma
 Nucléolos pequeños (normalmente dos)
 A diferencia de los macrófagos no participan en la endocitosis activa
 Órganos linfoides periféricos

42. Referencias
 http://news.sciencemag.org/2011/10/new-nobelist-used-his-discovery-battle-his-cancer
 http://www.scielo.org.ar/scielo.php?pid=S0025-
76802011000800016&script=sci_arttext