2. Что такое генотерапия?
― Направленное внедрение нового
генетического материала (ДНК, РНК) в клетки
с терапевтическими целями
• Первые попытки генотерапии –
1989
• Первая одобренная методика
генотерапии – 2004
• По-прежнему экспериментальная
область медицины на начальной
стадии развития
3. 1. Полигенные – за развите отвечает большое
количество генов. Невысокая
пенетрантность мутаций (<<100%).
Значительный вклад окружающей среды.
– сердечно-сосудистые
– онкологические
– диабет
– алкоголизм
– шизофрения
Генетические (наследственные)
заболевания
4. Генетические (наследственные)
заболевания
2. Моногенные – за развитие заболевания
отвечает один дефектный ген. Высокая
пенетнраность мутаций (до 100%).
Известно более 3,000 моногенных
заболеваний – основных кандидатов на
лечение при помощи генной терапии.
– муковисцидоз
– болезнь Хантингтона
– болезнь Тея-Сакса
– серповидноклеточная анемия
– фенилкетонурия
5. Подходы к исправлению генов
• Вставка нормальной копии гена в геном в
неспецифической позиции
• Замена мутантного гена на нормальный
при помощи гомологичной рекомбинации
• Репарация при помощи селективной
обратной мутации
• Усиление экспрессии гена
• Блокировка экспрессии гена
6. Классический пример:
Муковисцидоз
• Возникает при наличии 2 дефектных
копий гена cystic fibrosis transmembrane
conductance (CFTR)
• В норме осуществляет транспорт ионов
хлора через клеточную мембрану
• Если клетка не может выводить ионы
хлора, она поглощает воду, чтобы снизить
их концентрацию
• Это приводит к образованию плотной клейкой слизи в бронхах,
поджелудочной железе, кишечнике, а также на других слизистых
• Вся существующая терапия носит симптоматический характер
7. Генотерапия муковисцидоза
• Распыление в дыхательные пути
специальных векторов с
«нормальной» ДНК
• Дорогое лечение
• Требуется постоянное
применение
• Не доказана эффективность
9. Процесс генотерапии
1. Для лечения выбирается и
синтезируется
«терапевтический» ген
(полезная нагрузка) со
вспомогательными
последовательностями ДНК
2. ДНК вставляется в вектор,
осуществляющий её перенос
3. С помощью вектора ДНК
переносится в клетки пациента
4. В клетке функционирует
исправленный вариант гена,
который передается дочерним
клеткам при делении
10. Генотерапия
(по стадии)
• Соматическая генотерапия – терапия
соматических клеток пациента, подвергшихся
заболеванию. Не передается по наследству.
• Фетальная (пренатальная) генотерапия (in utero) –
терапия плода.
• Генотерапия половых клеток (гамет) родителей.
Передается по наследству. Не применяется у
людей.
11. Подходы к генотерапии
• ex vivo Клетки извлекаются из организма, подвергаются
лечению, а затем возвращаются в организм
• in situ Вектор со «здоровой» ДНК инъецируется локально в
больные ткани
• in vivo Вектор со «здоровой» ДНК инъецируется в кровоток
12. Ex vivo gene therapy
1. У больного отбираются клетки из пораженной ткани
2. Клетки трансфецируют и культивируют
3. Измененные клетки вводят в организм пациента
13. Ex vivo gene therapy
Преимущества Недостатки
Специфичность Время- и трудозатраты
Высокая эффективность
трансфекции
Инвазивно
Контаминация
Не все клетки можно
выращивать
15. In vivo gene therapy
• Введение генетических конструкций напрямую в ткани и органы без отбора
клеток пациента.
• Некоторые органы не подходят для ex vivo
• Трудности с доставкой в целевые ткани. Используются как векторы для
доставки, так и прямые инъеккции в ткани.
16. In vivo gene therapy
Преимущества Недостатки
Дешево Неспецифично
Неинвазивно
Низкая эффективность
трансфекции
Меньше риск контаминации
20. Мишени для генотерапии
Эндотелий Может секретировать
терапевтический белок в кровоток
Пример: фактор свертывания при
гемофилии
Кожный
эпителий
Можно использовать маленький
кусок кожи для выращивания
большого трансплантата. Способен
секретировать терапевтический
белок
22. Легкие Пример: лечение муковисцидоза
аэрозолем
Нервная
ткань
Не делятся
Пример: генотерапия
фибробластов для синтеза
нейротрансмиттеров
Раковые
опухоли
Около половины типов мишеней
для генотерапии
• Suicide gene therapy
• Вакцины, облегчающие узнавание
иммунной системой
Мишени для генотерапии
23. Stable vs. Transient Gene Transfer
• Stable Gene Transfer: достигается за счет
интеграции ДНК в геном или репликации
эписомальной ДНК в клетке.
– Стабильный эффект
– Встраивается в случайных местах (нарушение
важных генов)
• Transient Gene Transfer: ДНК не встраивается в
геном клетки и будет потеряна при ее делении
– Быстро теряется (необходимо повторное
лечение)
– Не приводит к мутациям
25. Вектор
―средство доставки ДНК в клетки пациента
Функции:
1. Защита ДНК
2. Доставка к определенным типам клеток
3. Простое и дешевое производство в
больших количествах
4. Возможность осуществлять регуляцию
генов интереса
26. Идеальный вектор
• Полезная нагрузка: 1-2 гена
• Направленность: определенный тип клеток
• Иммунный ответ: отсутствует
• Стабильность: не мутирует
• Производство: легко производить в
больших количествах
27. Векторы
Вирусные
• В процессе эволюции
адаптировались к
доставке своих генов в
клетки хозяина
• Специфичность к
определенному типу
клеток
• Стабильность
• Вызывают иммунный
ответ
• Цитотоксичны
Невирусные
• Не вызывают иммунного
ответа (возможно
многократное введение)
• Неспецифичные
• Низкая эффективность
29. Невирусные векторы
• Голая ДНК
Прямая инъекция ДНК (плазмида) в ткани.
Требуется много ДНК.
Тимус, скелетная и сердечная мскулатура
• Генная пушка
ДНК на поверхности частиц золота (1-3 мкм)
30. • Липосомы
Искусственные липидные сферы с
растворенной ДНК внутри.
Дешевле вирусов, нет иммунного
ответа.
Надо в 100-1000 раз больше ДНК,
чем для вирусов.
Для определенных тканей (легкие).
Невирусные векторы
32. Вирусные векторы
• Идеальный механизм доставки чужеродной
ДНК в клетку
• Используются модифицированные вирусы
не способные размножаться в клетках
человека
35. Вирусные векторы
Ретровирус
Длительный эффект
Инфицирует только делящиеся клетки
Лентивирус ВИЧ
Разновидность ретровирусов
Способен инфицировать неделящиеся
клетки
Аденовирус Простуда
Большие гены
Временный эффект
Аденоассоциированный
вирус
Маленькие гены
Длительный эффект
Герпес
Длительный эффект
Инфицирует нервные клетки
36. Ретровирусы
• ssRNA
• Инфицируют только делящиеся клетки, так
как не способны проникнуть через ядерную
мембрану
Подходят для терапии раковых клеток
43. Аденоассоциированные вирусы
• ssDNA
• Не является патогенным
• Инфицирует делящиеся и неделящиеся
клетки
• Встраивают свою ДНК преимущественно в
одном положении на 19 хромосоме
45. Вирус простого герпеса
• dsDNA
• Инфицирует нервные клетки
• Не встравивается в геном, но способен
сохраняться в течение долгого времени
• Высокая емкость
• Цитотоксичен
• Способен активировать
герпес пациента
48. Типы векторов
Retrovirus Herpes
Simplex V
Adenovirus AAV Lipos
ome
DNA Polymer
Integration Yes Non Non Yes Non
Expression Stable Transient Transient Stable Transient
Transfection Efficient Efficient Efficient Low Low
Immune
Response
Yes Yes High No Yes Yes or
No
No
В общем вирусные векторные системы демонстрируют большую
эффективнсоть трансфекции, однако есть риск регенерации вируса
дикого типа, иммунного ответа, образования раковой опухоли.
52. Генотерапия для усиления эффекта химиотерапии
(Suicide Gene Therapy)
DEAD
CANCER
CELL
CANCER
CELL
Virus injects
gene encoding
enzyme X
Cancer cell
expresses
enzyme X
Patient is treated with pro-drug
Enzyme X changes pro-drug
into active drug
53. Генотерапия для восстановления функции
онкосупрессоров
APOPTOSIS!
CANCER CELL
NO p53 tumor
suppressor!!!
Virus injects
gene for p53
Cancer cell expresses normal p53
P53 activates
apoptotic
pathway
55. First human gene therapy
• Ashanti de Silva (4 years old) with
severe combined immunodeficiency
(SCID) treated in 1990 at NIH in
Maryland
• Lack functioning immune system
because of defect in gene called
adenosine deaminase (ADA), which
is involved in metabolism of dATP
(nucleotide precursor used for DNA
synthesis)
• Normal gene cloned into vector introduced into nonpathogenic
retrovirus
56. First human gene therapy success!
• Ex vivo approach used
• T cells isolated from blood
• Multiple treatments required
• Within a few months, T cell numbers
increased
• After 2 years, ADA enzyme activity was
high
• She is currently enjoying a healthy life
57. Risks of Gene Therapy
• 18-year-old Jesse Gelsinger died during a
clinical trial in 1999
• Complications related to adenovirus vector
that was used
• Ornithine transcarbamylase deficiency
(affects ability to break down dietary amino
acids)
• 1st person to die as a result of gene therapy
• He died from multiple organ failures 4 days
after starting the treatment. His death is
believed to have been triggered by a severe
immune response to the adenovirus carrier.
59. Bubble Boy Syndrome
• 2002 год – лечение группы из 10 пациентов
с использованием ретровирусов
• Лечение было успешным
• У 2 из 10 развилась лейкемия
60. Проблемы генотерапии
1. Зачастую непродолжительный эффект (из-
за нестабильности терапевтической ДНК,
быстрого размножения клеток)
2. Риск иммунного ответа
3. Вирусы могут вызывать побочные эффекты
(токсичность, иммунный ответ, онкология,
возврат к патогенности)
4. ДНК может передаться в половые клетки
5. Мультигенные заболевания
61. Immune System Complications
• Immune and Inflammatory responses
– Immune system designed to attack foreign invaders
– Shutting defense system down risks further advance of
illness
– Difficulty for gene therapy to be repeated
62. Viral Vectors
• Virus could be transmitted from the patient
to other individuals
• Could disrupt vital genes, causing another
disease or a predisposition to cancer
