Vectores YACs (Cromosoma artificial de levadura; Yeast Artificial Chromosome), BACs (Cromosoma Atificial Bacteriano, Bacterial Artificial Chromosome) y PACs (Cromosoma artificial derivado del fago P1).

1. Vectores YACS,BACs y
PACs.

2. Propósito de YACs,BACs y PACs
• Las técnicas convencionales de ADN recombiante
plásmidos, cósmidos o cromosomas virales tienen la
capacidad de integrar ADN exógeno de hasta unas 100
kb,permitiendo así el análisis y manipulación de un
organismo cuya información genética es compacta.
• Existe una serie de fenómenos moleculares que
implican fragmentos de ADN aún más grandes, como,
por ejemplo, progresión de procesos tumorales
malignos.
• Por otra parte, el interés creciente en la construcción
de mapas físicos de cromosomas en el camino hacia la
secuenciación de genomas complejos.

3. YACs

4. YAC: Cromosoma Artificial de
Levadura
• Descrito por primera vez en 1983 por Murray y Szostak.
• Fue el primer sistema de clonaje de fragmentos
grandes de ADN.
• Se utilizan por su capacidad de albergar grandes
fragmentos de ADN de 100 kb-1 Mb.
• Ventajas esperadas:
-Menor número de clones suponiendo rapidez en análisis
y manipulación.
-Mayor número de secuencias representadas y menor
número de errores y discontinuidades en un mapa físico.

5. YAC: Cromosoma Artificial de
Levadura
• Los plásmidos bacterianos no son buenos vectores para
hospedadores eucariontes como las levaduras, porque
las secuencias de ADN procariontes y eucariontes
utilizan diferentes orígenes de replicación.
• ¿Qué es YAC?
-Son grandes pedazos de ADN que contienen los
componentes necesarios que permiten propagarse junto
con los otros cromosomas de célula de levadura en la
levadura.
-Estos cromosomas artificiales llevan a cabo
normalmente la replicación de ADN eucarionte y la
expresión de genes en las células de levadura.

6. • Para que un segmento de ADN pueda funcionar como
un cromosoma eucariótico éste debe contener un
origen de replicación, una secuencia centromérica y
dos secuencias teloméricas.
• Construcción
-CEN4, como centrómero de levadura (procedente del
cromosoma 4 de Saccharomyces cerevisiae) que permite
la correcta segregación cromosómica.
-TEL,como secuencia telomérica (procedente de
Tetrahymena) capaz de ser convertida en telómeros
funcionales por la telomerasa de S.cerevisiae que permite
la independiencia del cromosoma.
-ARS1,como origen de replicación (secuencia de
replicación autónoma 1 de S.cerevisiae)

7. 11463 BP

9. Puede ser
propagado en E.coli
o en Sacharomyces
cerevisiae

10. Ventajas
Más de 10,000 pb-1,000,000 pb
Son vectores de gran capacidad a la hora de generar
genotecas de organismos complejos y preparar la
secuenciación
Para generar el ADN recombinate se usa el mínimo de
enzimas de restricción y ADN ligasa
Los YAC se comportan como cromosomas de levadura
normales
 Resultaron útiles en la fase temprana del Proyecto
del Genoma Humano donde se usaron para
construir mapas físicos completos de todos los
cromosomas humanos.
 Se utiliza para el análisis de la estructura de la
heterocromatina.
La mayor parte del ADN de las zonas heterocromáticas
se encuentran en grandes bloques de secuencias
repetidas y es difícil de clonar debido a su inestabilidad
en E.coli.
 Tienen una ventaja sobre los cromosomas
artificiales bacterianos en la que puedan ser
usados para expresar proteínas eucarióticas que
requieren modificación postraduccional
 El clonaje en YACs permitirá aislar regiones
cromosómicas completas de distintas especies o
distintos individuos de la misma especie,de forma
que pueda ser posible el análisis comparativos.
DESVENTAJAS
INESTABILIDAD: Manipulación recombinante de YACS esta
generada en levadura por laboriosos y usualmente
requieres YACs ser transferidos a E.coli para su
subsecuente manipulación.
QUIMERISMO: La secuencia del ADN clonado no
corresponde a una sola región genómica sino a múltiples
que sucede debido a la recombinación de dos o más YAC.
Además puede haber supresión de segmentos o
reordenación de segmentos genómicos .La incidendia del
quimerismo es alta de 50%.
El ADN del YAC es difícil de purificar intacto.
La recombinación de levadura es muy potente y siempre
activo, y por lo tanto puede generar delecciones y otros
reordenamientos en un YAC
La manipulación de los YAC recombinantes que se generan
en la levadura es laborioso y por lo general requiere YAC
para ser transferidos a E. coli para la manipulación
posterior.

11. BAC: Cromosoma Artificial Bacteriano
Un cromosoma artificial bacteriano; es un sistema de
clonación para aislar ADN genómico basado en el
plásmido F-factor usando bacterias Escherichia coli.

12. BAC: Cromosoma Artificial Bacteriano
• Se desarrollaron en 1992 por Shizuya et al.
• vector usado para clonar fragmentos de ADN (de 100 a
300 kb de tamaño; media de 150 kb)
• BAC integra las características del factor F. El factor F es
el único factor de fertilidad de la E. coli, también tiene
la capacidad de integrarse en el cromosoma bacteriano
y de liberarse.
• Su gran utilización se debe a su notable capacidad, su
gran estabilidad y su bajo porcentaje de quimerismo.
• Son muy utilizados como vectores de clonación para la
construcción de genotecas genómicas

13. • Un BAC típico consta de:
*OriS: origen de replicación del factor F
*repE: control de la replicación del plásmido
*parA, B, C: control de la replicación, mantienen el
número de copias limitado a 1 ó 2 por célula. Reduce la
posiblidad de recombinación entre los fragmentos de
ADN insertados en el plásmido.
*CMr: cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) (gen de
resistencia a cloranfenicol)
• Dos sitios de clonación con HindIII y Bam HI
• Varios sitios de restricción G+C por ejemplo Notl,Sfil

14. Ventajas Desventajas
Estos
vectores permiten inserciones genómicas de hasta 300
kb de tamaño
que se mantenga de forma estable
Menor capacidad de inserción de ADN.
 Desprovistos de una alta proporción de clones
quiméricos o reordenados durante varias
generaciones.
 Debido a que el ADN insertado se mantiene en el
genoma bacteriano durante los ciclos repetidos de
replicación, la información no se pierde.
los clones parecen ser estables a lo largo
muchas generaciones; Sin embargo, esto no ha sido
probado para diferentes regiones del genoma.
Estas moléculas de ADN circular son fácilmente aislados
del ADN del hospedero mediante una lisis alcalina
(Birnboim y Doly, 1979)
Falta de la selección positiva de los clones que contienen
insertos.
La transformación de E.coli es por electroporación Número bajo de copias, un
muy bajo rendimiento de ADN en comparación con YACs.
Aplicaciones:
 Se utilizan con éxito en la cartografía física y
proyectos de clonación posicional.
 Vector ideal para la elaboración de genotecas
eucarióticas
Carece de genes reporteros relevantes y la ausencia de
los genes cuya expresión puede ser seleccionada para
células eucariotas .

15. PAC: Cromosoma Artificial derivado del fago
P1.
Es un sistema de clonación para aislar ADN genómico
basado en el plásmido F-factor,como en BACs,pero
también contiene algunos elementos del sistema de
clonación del bacteriofago P1

16. PAC: Cromosoma Artificial derivado
del fago P1.
• Desarrollado por Ioannou et al. en 1994
• Sistema de clonación en E.coli
• Los clones de PAC se generan por
electroporación.
• vector usado para clonar fragmentos de ADN
(100-300 kb, promedio 150 kb)

17. • P1 replicon-es el origen de replicación usado
para propagación de una sola copia,
• Lytic replicon-ofrece replicon multicopia
cuando, es una característica útil para la
amplificación de ADN. está regulada por el
promotor del operón de la lactosa y se apaga si
la célula huésped lleva un represor lacI.
• pUC19-confiere resistencia a penicilina
• LoxP-secuencia corta de nucleotidos usado por
recombinanción homologa LoxP-Cre
• KanR- selección bacterias que incorporaron y
recircularizaron el vector
• SACBII- levansucrasa: selección de bacterias con
vector+inserto (levansucrasa en medio con 5%
sacarosa: levan : letal para E. coli)
• pUC19 es útil para la multiplicación preparativa
del vector vacío por la E. coli, ella protege la
bacteria contra la expresión del gen sacB
En la ausencia de un inserto clonado, el
promotor de E. coli conduce el gen SacB11
que convierte la sacarosa exógeno a levan,
que es tóxico para E. coli. Esta característica
proporciona una selección positiva para
insertos clonados.

18. Procedimiento
• La clonación de insertos en el
vector pCYPAC-2 comienza con la
escisión por ScaI,que destruye el
inserto de pUC19
• La digestión con BamHI genera el
unico sitio de clonación y
después del tratamiento con
fosfatasa (para reducir la
autoligación del vector)
• Se eliminan los pequeños
fragmentos ScaI/BamHI.
• El ADN genómico se digirió
parcialmente con Sau3A o Mbol,
se selecciona el fragmento a
clonar del gel de electroforesis.

19. VENTAJAS
Raramente quimérico
Tienen inserciones muy estables y no borran secuencias
La modificación se produce directamente en E.coli,eliminando
la necesisas de la transferencia de ADN
Aplicaciones
 cartografía física
 proyectos de clonación posicional
 Estudio de terapia de fagos
 Estudios científicos centrándose en como los antibióticos
actúan sobre bacterias particulares.
Las moléculas de ADN circulares son fácilmente aislados de la
sede de fondo genómico en una lisis alcalina clásica
preparación de plásmido (Birnboim y Doly, 1979)
su origen de una sola copia de replicación y
la selección positiva de los transformantes que contiene
insertos que utilizan el SacBII
gen. El origen de una sola copia de replicación asegura estable
y fiel
propagación de plásmidos grandes, con comparativamente
bajas frecuencias de deleciones
u otros reordenamientos
Desventajas
Origen de replicación en copia única, por
lo que es difícil de obtener ADN

20. YAC BAC PAC
Hospedero Saccharomyces
cerevisiae
Escherichia coli DH10B Escherichia coli DH10B
Método de
transformación
Transformación de
esferoplastos
Electroporación Electroporación
AND Lineal Circular,superenrrollado Circular,superenrrollado
Tamaño maximo del
inseto
1 Mb ~300 kb ~300 kb
Selección del vetor Falta de Triptofano o
uracilo en el medio de
crecimiento.
Cloramfenicol Kanamicina
Enzima de restricción EcoRI HindIII Mbol o Sau3A
Purificación intacta del
insert
Relativamente difícil Fácil Fácil
Apareamiento del clon Si No No
Secuenciación directa
del insert
Difícil Relativamente fácil Relativamente fácil
Grado de quimerismo Varía de librería a
librería pero puede ser
tan alto como 50%.
Muy bajo Muy bajo