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ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN
Junio 2010 Vol.15 · Nº1




                          REVISTA




                                            Complejo huso meiótico-placa metafásica



                                            ACTUALIDAD                                      DEBATE
                                            Proteómica del espermatozoide humano.           Es necesario considerar los intentos previos.
                                            Metabolómica y reproducción humana.             Auditorías para el 100% de los Centros.
                                                                                            Transparencia no siempre es sinónimo de
                                            ARTÍCULOS                                       honestidad.
                                            Efecto del proceso de vitrificación sobre la
                                                                                            La nueva vía del Registro de Actividad
                                            estructura del huso meiótico y organización
                                                                                            de la SEF: El aumento de la calidad.
                                            cromosómica en ovocitos humanos en
                                            metafase II.
                                                                                            FORMACIÓN CONTINUADA
                                            Las variantes cromosómicas afectan la           Impronta genómica y reproducción asistida.
                                            calidad embrionaria.
                                                                                            AGENDA
                                            AULA JOVEN                                      NOTICIAS
                                            Relación entre los patrones pronucleares y la   NORMAS DE PUBLICACIÓN
                                            calidad embrionaria según criterios asebir.
Revista Asebir junio 2010
Í N D I C E

                                                                                    Junio 2010 Vol. 15 · Nº1

                                                                                  EDITA
                                                                                  Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción
                                                                                  (ASEBIR).

                                                                                  EDITORES Y DIRECTORES CIENTÍFICOS
                                                                                  Marga Esbert - Barcelona
                                                                                  Jorge Cuadros - Madrid

                                                                                  COMITÉ EDITORIAL
                                                                                  Presidente:
                                                                                  Dr. Manuel Ardoy Vilches




SUMARIO
                                                                                  HOSPITAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN - Madrid
                                                                                  Vicepresidenta y RRPP:
                                                                                  Dra. Carmen Ochoa Marieta
                                                                                  CER. CLINICA COTERO - Santander
SUMARIO                                                        Pág.               Secretaría y RRPP:
                                                                                  Dra. Montserrat Boada Palá
                                                                                  INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS - Barcelona
EDITORIAL                                                                     3
                                                                                  Tesorería y Relaciones con la Industria:
Reconocimiento de la Embriología Clínica                                          Dr. Fernando Marina Rugero
Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy                      INSTITUTO DE REPRODUCCION CEFER - Barcelona
Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica
                                                                                  Vocalía de Grupos de Interés e Investigación:
                                                                                  Dr. Josep Santaló Pedro
ACTUALIDAD                                                                    5   UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA - Bellaterra
Proteómica del espermatozoide humano
Rafael Oliva Virgili, Josep Maria Estanyol, Sara de Mateo López,                  Vocalía de congresos:
Judit Castillo Corullón, José Luis Ballescà Lagarda.                              Dra. María José Torelló Ybañez
                                                                                  HOSPITAL QUIRÓN BARCELONA - Barcelona
Metabolómica y reproducción humana                                                Dra. Yolanda Mínguez Royo
Imma Sánchez Ribas, Francisco Domínguez, Carlos Simon                             IVI MADRID - Madrid
                                                                                  Vocalía de Docencia y formación continuada:
ARTÍCULOS                                                                 14      Dr. Ignacio Santiago Álvarez Miguel
Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso                  INST. EXTREMEÑO REPRODUCCIÓN ASISTIDA –IERA -Badajoz
meiótico y organización cromosómica en ovocitos humanos
                                                                                  Dr. Josu Franco Iriarte
en metafase II                                                                    CENTRO SANITARIO VIRGEN DEL PILAR - San Sebastian
Cristina Costana Duque, Javier Alfonso, Rita Cervera, Ana Monzó,
Vicente Montañana, Miodrag Stojkovic, Alberto Romeu                               Dr. Juan Manuel Moreno García
                                                                                  CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante
Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria                         Vocalía Página Web:
Mireia Poveda, Teresa Rubio, Isabel Ochando, Laura Gil, Manuel                    Dr. Juan Manuel Moreno García
Lloret, José Jesús López-Gálvez, Antonio Urbano, Juan Manuel                      CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante
Moreno, Joaquín Rueda                                                             Vocalía de publicaciones:
                                                                                  Dr. Jorge Martín Cuadros Fernández
AULA JOVEN                                                                25      CLÍNICA FIV-MADRID - Madrid
Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria
                                                                                  Dra. Marga Esbert Algam
según criterios asebir                                                            IVI BARCELONA - Barcelona
Marta Brossa, Xènia Blanch, Marta Antich
                                                                                  La Revista de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biología
DEBATE                                                                    30      de la Reproducción) está indexada en la base de datos Latindex
Es necesario considerar los intentos previos                                      y en la base de datos ICYT, de ciencia y tecnología, del Consejo
Auditorías para el 100% de los Centros                                            Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de España y ha
                                                                                  sido aceptada para su inclusión en Índice Médico Español
Transparencia no siempre es sinónimo de honestidad
                                                                                  (IME), la base de datos de Biomedicina del CSIC.
La nueva vía del Registro de Actividad de la SEF: El aumento de la calidad.
                                                                                  PUBLICIDAD Y COLABORACIONES
FORMACIÓN CONTINUADA                                                      36      Secretaría ASEBIR
Impronta genómica y reproducción asistida                                         C/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª
                                                                                  28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94
Cristina Camprubí
                                                                                  www.asebir.com · asebir@asebir.com
AGENDA                                               42                           DISEÑO, MAQUETACIÓN E IMPRESIÓN
NOTICIAS                                             43                           GÓBALO: Gráfica · Web · Multimedia · Consultoría
INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN 44                           C/ Castillo de Fuensaldaña 4, Oficina 213
                                                                                  28232 · Las Rozas · Madrid
                                                                                  Tfno - Fax.: 91 626 39 74
Imágenes de la portada: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa     www.gobalo.es · info@gobalo.es
metafásica en oocitos humanos (Imagen superior) y configuración anormal (Imagen   Depósito legal: M-18873-1996
izquierda). Cortesía de Duque et al. pp:14-17.                                    ISSN: 1136-4424
                                                                                  Soporte válido: 78-R-CM
Revista Asebir junio 2010
E D I T O R I A L
                                                                                        Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                          3


RECONOCIMIENTO DE LA EMBRIOLOGÍA CLÍNICA

Han pasado ya más de 30 años desde el nacimiento de Louise Brown. Desde aquellos días hasta hoy, la Reproducción Humana
Asistida, sobre todo la Embriología Clínica, ha experimentado enormes cambios. Han surgido nuevas alternativas, y otras se han
visto muy modificadas; y lo mejor de todo es que el cambio, la evolución, continúa.

La reproducción humana asistida y, sobre todo, aquello que nos ocupa: la Embriología, ha terminado ocupando un campo de
características propias y bien definidas dentro del panorama sanitario. Resulta difícil pensar que algún gestor de sanidad de las
diferentes autonomías pueda dudar de que esta atención sanitaria deba estar incluida en su cartera de servicios.

Muchos son los cambios que han consolidado un campo propio y específico para la Embriología Clínica. Tan sólo por enumerar
algunos:

-Aparición constante de alternativas terapéuticas específicas.

-Desarrollo de diferentes técnicas de diagnóstico. Tanto propias como traídas de otros tipos de laboratorios.

-Consolidación de la gestión del laboratorio de reproducción humana asistida, con características diferenciales del resto de
laboratorios.

-Implantación de la reproducción humana asistida en la cartera de servicios habitual del sistema sanitario Español

-Posibilidades docentes propias y de formación práctica, cada vez más asequibles.

-Desarrollo de investigación propia, junto con una gran cantidad de alternativas de intercomunicación científica.

-Existencia de diversas asociaciones científicas exclusivas de este campo.

-Desarrollo legislativo específico de forma habitual, no sólo a nivel nacional

-Un impacto incuestionable en la sociedad: natalidad, partos múltiples, preservación de la fertilidad, parejas homosexuales... La
reproducción humana asistida ha pasado al espectro de lo habitual.

A pesar de todo esto, hay una parcela esencial que se continúa dejando de lado: el reconocimiento específico, propio y oficial de
un ejercicio profesional, el de la Embriología Clínica. Consecuencia de este paso sería la definición de responsabilidades y funciones,
y por tanto la planificación de esquemas formativos. No cabe duda alguna, el principal beneficiario de tal reconocimiento sería el
propio paciente, tanto por la seguridad como por la calidad asistencial que recibiría.

A muchos nos cuesta pensar qué razones llevan a los responsables del Estado a mantener en una situación de casi parada un
reconocimiento que parece tan lógico a los profesionales cercanos a la reproducción humana asistida. Sin embargo, por nuestra
parte sí que ha habido un esfuerzo continuado. Podemos hacer un breve resumen.

Uno de los primeros pasos fue la Cualificación de Especialista en Reproducción Asistida Humana, emitida durante un breve periodo
de tiempo por el COB. Tras el escaso éxito de ésta, y pasado algún tiempo, surgió la posibilidad de que al profesional del Laboratorio
de Reproducción Humana Asistida se le reconociera una de las especialidades reguladas en el RD 1163/2002, que afectaba a biólogos,
químicos y bioquímicos. La solicitada mayoritariamente fue la de Análisis Clínicos. La respuesta oficial la conocemos todos, un
rotundo NO. De esta respuesta hubo dos consecuencias claras:

-Nosotros aprendimos que NO éramos asimilables como parte de una especialidad previa. Por tanto, sin lugar a dudas, el
reconocimiento pasaba por algo más exclusivo y específico.

-El ministerio no podía seguir mirando hacia otro lado durante más tiempo. Era demasiado obvio, tenía una enorme cantidad de
expedientes denegados encima de la mesa y todos tenían algo en común, trabajaban en reproducción humana asistida.

Tras esto, empezamos diferentes reuniones con el ministerio. Una de las primeras cosas que quedaron bien claras era la
imposibilidad, por el momento, de una especialidad propia. Máxime cuando la intención es disminuir el número de las que hay. Una
opción ofrecida fue la posibilidad de valorar el formar parte de las ramas, troncalidades, que pasarán a formar parte de un tronco
común, el del Laboratorio Clínico. Tal y como pasará con las hasta ahora existentes de forma individual: Análisis Clínico, Bioquímica
Clínica... Esta opción fue trabajada, y se presentó a la correspondiente Dirección General del Ministerio de Sanidad una propuesta
de programa formativo de troncalidad en Embriología Clínica. Ésta la podéis obtener en la Web de ASEBIR.
E D I T O R I A L

4


    Si bien actualmente las troncalidades no se han ultimado, parece complejo que se vayan a incluir más campos del conocimiento que
    los ya aceptados como especialidad, aunque seguimos trabajando en ello con el ministerio y con las comunidades autónomas,
    intentando hacer llegar el asunto al Consejo Interterritorial. Pero el ministerio nos propone una vía alternativa que ayudaría a
    fundamentar pasos ulteriores, un Certificado en Embriología Clínica que fuera valorado y emitido por ASEBIR; máxime cuando es
    conocedor del proceso de certificación de la ESHRE.

    Sin olvidar el resto de los caminos abiertos, la vía principal de evolución por la que se ha optado, y prácticamente la única que el
    ministerio deja como viable a corto-medio plazo, es este certificado. Sabemos que su relevancia dependerá de qué apoyos o
    reconocimientos oficiales pueda llegar a tener, así como de la consideración personal que se le otorgue. Por el momento, la Dirección
    General de Ordenación profesional, Cohesión del SNS y Alta Inspección del Ministerio de Sanidad y Política Social ha dado un visto
    bueno a un esquema de Certificación en Embriología Clínica de ASEBIR. Éste tiene varias fases, y en la actualidad se está procediendo
    a su desarrollo y puesta en marcha, tal y como se está informando a los socios.

    La apuesta es arriesgada, sobre todo cuando la incertidumbre de saber a qué puerto nos hará llegar es grande. Pero el mensaje es
    claro, si algo podemos decir en el presente, es que la Embriología Clínica ha madurado lo suficiente como para reclamar un lugar
    propio.

    Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy
    Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica.
A C T U A L I D A D
                                                                                                             Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                                              5


PROTEÓMICA DEL ESPERMATOZOIDE HUMANO

Rafael Oliva Virgili1, Josep Maria Estanyol2, Sara de Mateo López1, Judit Castillo Corullón1, José Luis Ballescà Lagarda3
1
  Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic de Barcelona, y Laboratorio de Genética
Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona.
2
  Unitat de Proteòmica, Serveis de Suport a la Recerca, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona
3
  Institut Clínic de Ginecología Obstetricia i Ginecologia, Hospital Universitari Clínic de Barcelona
e-mail: roliva@ub.edu
Fecha recepción: 16 abril 2010
Fecha aceptación: 18 abril 2010



LA   TRANSICIÓN     NUCLEOHISTONA-                      Mientras que la mayor parte del genoma                   organizados por protamina y en las
NUCLEOPROTAMINA Y ORGANIZACIÓN DEL                      de espermatozoide (alrededor de 85-                      regiones genómicas organizadas por las
DNA EN EL NÚCLEO DEL ESPERMATOZOIDE                     95%) está fuertemente empaquetado en                     histonas no es al azar. Estudios recientes
                                                        forma de estructuras toroidales,                         basados en el análisis del genoma
La espermatogénesis es uno de los                       también es importante tener en cuenta                    paterno asociado a cada uno de estos
procesos que conlleva cambios más                       que alrededor del 5-15% del DNA de los                   dominios mediante microarrays, han
radicales en la estructura de la                        espermatozoides está organizado por                      permitido llegar a la conclusión básica
cromatina hasta dar lugar al                            proteínas histonas, muchas de las cuales                 de que las regiones asociadas a
espermatozoide maduro (Mezquita,                        son     variantes     específicas    del                 nucleohistona se hallan asociadas con
1985; Oliva and Dixon, 1991). De forma                  espermatozoide (Fig. 1) (Gatewood et                     las regiones reguladoras de genes, lo
progresiva primero se desensambla la                    al., 1987; Oliva, 2006; Balhorn, 2007).                  que implica la existencia de marcas
estructura nucleosómica presente en las                 Se ha propuesto que las estructuras                      epigenéticas con una función potencial
espermatogonias, espermatocitos y                       toroidales de la nucleoprotamina, cada                   en el desarrollo embrionario (Arpanahi
espermátidas      redondas,      y    es                una con aproximadamente 50 kb de ADN,                    et al., 2009). En otro estudio reciente,
reemplazada transitoriamente por las                    podrían estar ancladas a la matriz                       basado en secuenciación genómica
proteínas de transición y por último por                nuclear a través del DNA entre toroide y                 masiva, se ha detectado que las regiones
las protaminas (Mezquita, 1985; Oliva                   toroide (Shaman et al., 2007).                           asociadas a nucleosomas están
and Dixon, 1991; Oliva, 2006; Balhorn,                  Actualmente se sabe que la distribución                  significativamente enriquecidas en los
2007) (Fig. 1).                                         de los genes en las regiones genómicas                   genes importantes para el desarrollo,
                                                                                                                 incluidos los genes imprintados, los
                                                                                                                 microRNAs, los genes Hox, y los
                                                                                                                 promotores de la transcripción de genes
                                                                                                                 del desarrollo y de factores de
                                                                                                                 señalización (Hammoud et al., 2009).
                                                                                                                 Además, se ha demostrado que las
                                                                                                                 modificaciones de histonas (H3K4me2,
                                                                                                                 H3K27me3)         se     localizan      en
                                                                                                                 determinados loci correspondientes con
                                                                                                                 genes del desarrollo, y que los
                                                                                                                 promotores asociados a genes del
                                                                                                                 desarrollo se hallan hipometilados en el
                                                                                                                 espermatozoide, pero son metilados
                                                                                                                 durante la maduración (Hammoud et al.,
                                                                                                                 2009).

                                                                                                                 Además de estas marcas epigenéticas
                                                                                                                 determinadas por la distribución
                                                                                                                 diferencial de los genes en los dominios
                                                                                                                 asociados a la nucleohistona y a la
                                                                                                                 nucleoprotamina, hay otros tipos de
Figura 1. Representación esquemática de los cambios de la cromatina que ocurren durante la
                                                                                                                 información epigenética potencialmente
espermatogénesis. El lado izquierdo de la figura representa los cambios celulares durante la                     transmitida por el núcleo del
espermatogénesis y primeras fases del desarrollo embrionario. El lado derecho de esta figura representa          espermatozoide. Una de las más
los cambios de la cromatina que tienen lugar durante la transición nucleohistona a nucleoprotamina en la         conocidas y contrastadas es la
espermiogénesis y en las fases iniciales del desarrollo embrionario. Los cambios celulares en el lado
izquierdo de esta figura corresponden aproximadamente a las estructuras de la cromatina y actividades
                                                                                                                 metilación del DNA (Reik et al., 2001).
indicadas en el lado derecho. Las histonas están representadas en color rojo y el DNA se marca como líneas       Más recientemente, la identificación de
azules. Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.                                                        los RNAs presentes en el espermatozoide
A C T U A L I D A D
    Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano.
6


    y la demostración de su transferencia al      al., 2008; 2009). Una cuestión crucial es                los precursores de protamina en un
    oocito abren la posibilidad de un papel       si estos factores de transcripción y las                 subconjunto de los pacientes (de Yebra
    de éstos en la fecundación (Ostenmeyer        proteínas recientemente identificados                    et al., 1998; Bench et al., 1998). Además
    et al., 2004). Otra fuente de información     en los núcleos representan vestigios del                 de estos estudios en pacientes
    epigenética potencial podría ser la           proceso de la espermatogénesis o bien                    subfértiles, la expresión de protaminas
    presencia de otras proteínas en el núcleo     están marcando algunas regiones del                      también se ha estudiado en respuesta al
    del espermatozoide, además de las             genoma paterno y poseen una función                      estrés térmico y se ha descrito que
    histonas y de las protaminas (Oliva et        epigenética (Oliva et al., 2008; 2009;                   episodios de fiebre alta se correlacionan
    al., 2009).                                   Rousseaux et al., 2008).                                 con la aparición de precursores de
                                                                                                           protamina P2 y con un aumento en la
    La primera evidencia de la presencia de       Anomalías en el contenido de protamina                   proporción de las histonas entre los 33 y
    proteínas en el espermatozoide que            en pacientes subfértiles fueron ya                       39 días después de la hipertermia
    podían resultar cruciales para el             descritas hace más de 20 años (Balhorn                   (Evenson et al., 2000).
    desarrollo del embrión fue el hallazgo de     et al., 1988). Posteriormente, otros
    que en los seres humanos y en la mayoría      estudios confirmaron la relación entre                   Los resultados del contenido de
    de los mamíferos (con la excepción del        un contenido anormal de protaminas y                     protaminas y de histonas se han
    ratón), el centrosoma se hereda de            alteraciones en los parámetros                           correlacionado con alteraciones en la
    forma paterna (Chatzimeletiou et al.,         seminales en estos pacientes infértiles                  integridad del DNA y con los resultados
    2008). También se ha demostrado que           (de Yebra et al., 1993; Mengual et al.,                  de reproducción asistida (Bizarro et al.,
    variantes de histonas presentes en el         2003; Aoki et al., 2005). Una de las                     1998; Nasr-Esfahani et al., 2005; Aoki et
    espermatozoide contribuyen a la               causas potenciales de alteraciones en la                 al., 2006; Torregrosa et al., 2006;
    formación de la cromatina cigótica en         relación de protaminas (P1/P2) puede                     Domínguez-Fandos et al., 2007; de
    humanos y que los procesos                    encontrarse en un procesamiento                          Mateo et al., 2008; Aitken and de Yuliis
    epigenéticos, implementados durante la        anormal de protamina 2 e incremento de                   et al., 2010).
    espermatogénesis, permiten distinguir
    el pronúcleo paterno en el embrión (van
    der Heijden et al., 2008; de Mateo et al.,
    2010). Diversas proteínas adicionales
    presentes en los espermatozoides
    podrían estar también relacionadas con
    el desarrollo embrionario (Martínez-
    Heredia et al., 2006; de Mateo et al.,
    2007).

    Más recientemente, el análisis
    proteómico       de      las    proteínas
    identificadas en los espermatozoides
    maduros ha proporcionado algunos
    resultados inesperados. Por ejemplo,
    hay factores de transcripción, proteínas
    de unión al DNA y proteínas implicadas
    en el metabolismo de la cromatina en
    células que son transcripcionalmente
    inactivas (Oliva et al., 2008; 2009). Los
    catálogos correspondientes a los
    proteomas de espermatozoide humano
    ya están disponibles (Martínez-Heredia
    et al., 2006; Baker et al., 2007; Oliva et
    al., 2009). Es notable la presencia           Figura 2. Estrategias disponibles para el estudio del proteoma del espermatozoide.
    de proteínas como la histona
                                                  La extracción típica de protaminas a partir de espermatozoides consistente en la reducción de los puentes
    acetiltransferasa y deacetilasa, histona      disulfuro de las protaminas con ditiotritol (DTT) / hidrocloruro de guanidina, seguido de la extracción con
    metiltransferasa, metiltransferasa del        0,5 M HCl, precipitación y purificación de las proteínas y su separación mediante electroforesis en gel de
    ADN, la topoisomerasa, helicasa, factores     poliacrilamida ácido (izquierda). Con esta estrategia es posible visualizar las proteínas nucleares
                                                  mayoritarias: una banda proteica prominente correspondiente a la protamina 1 (P1) y un conjunto de
    de transcripción, zinc fingers, proteínas
                                                  bandas correspondiente a la familia de la protamina 2 (P2). Para analizar el proteoma total es posible
    homeobox, proteínas cromodominio,             recurrir a la electroforesis bidimensional de las proteínas del espermatozoide. Para ello se suele recurrir a
    proteínas centrosómicas, y la telomerasa      una primera dimensión a través de isoelectroenfoque, separando las proteínas atendiendo a su punto
    en       las    células      que      son     isoeléctrico (pI), seguido de una segunda dimensión a través de electroforesis en gel de poliacrilamida –
                                                  SDS, que separa a las proteínas por su peso molecular aparente. La identificación de las proteínas se realiza
    transcripcionalmente inertes y que
                                                  entonces a través de espectrometría de masas. Una última estrategia mucho más robusta consiste en la
    tienen al menos el 85% de su DNA              generación inicial de péptidos, seguida de su separación mediante cromatografía líquida e identificación
    empaquetado por protaminas (Oliva et          mediante espectrometría de masas (derecha). Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.
A C T U A L I D A D
                                                                                           Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                                7


Identificación de proteínas del              muestras distintas. Un método es el 2D-           implicados, como resultar de utilidad en
espermatozoide y de sus alteraciones a       DIGE que se basa en el marcado                    el diagnóstico, pronóstico, y desarrollo
través de técnicas proteómicas.              diferencial utilizando fluorocromos de            de nuevas estrategias terapéuticas.
                                             las proteínas extraídas del control (por
Esencialmente se han utilizado dos           ejemplo con verde) y de las células               AGRADECIMIENTOS
alternativas diferentes para el estudio      experimentales (por ejemplo con rojo).
proteómico de los espermatozoides a          Esto es seguido de su mezcla y                    Subvencionado en parte gracias al
través de espectrometría de masas (MS):      separación en la misma 2D, lo que                 proyecto del Ministerio de Ciencia y
1) electroforesis bidimensional (2D)         permite detectar las proteínas                    Tecnología (BFU2009-07118), Fondos
seguida de la identificación por MALDI-      aumentadas o disminuidas observando               FEDER a R.O.
MS o cromatografía líquida LC-MS/MS, y       la desviación de la fluorescencia hacia
2) la digestión inicial de proteínas para    uno de los fluorocromos (Baker et al.,            REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
generar péptidos, seguido por su             2005; Oliva et al. ,2008). Otra
separación y análisis LC-MS/MS (Oliva et     alternativa es la cuantificación y                Aitken RJ, De Iuliis GN. On the possible
al., 2009; Baker and Aitken et al., 2009).   comparación de la abundancia relativa             origins of DNA damage in human
La primera alternativa implica               de las distintas proteínas en geles               spermatozoa. Mol Hum Reprod. 2010;16:3-13.
generalmente la separación de las            independientes. Estrategias más
proteínas utilizando isoelectroenfoque y     recientes desarrolladas se basan en el            Aoki VW, Emery BR, Liu L, Carrell DT.
es seguida por una electroforesis en gel     marcado isotópico no radioactivo de las           Protamine levels vary between individual
de poliacrilamida en presencia de SDS        muestras problema y control (Baker et             sperm cells of infertile human males and
(SDS-PAGE) para separar las proteínas        al., 2009; Oliva et al., 2009).                   correlate with viability and DNA integrity. J
en una segunda dimensión en función de                                                         Androl. 2006;27:890-898.
su peso molecular (Fig. 2).                  La primera descripción del potencial de
                                             análisis proteómico 2D en el estudio de           Aoki VW, Liu L, Carrell DT. Identification and
Esta alternativa ha sido ampliamente         defectos en espermatozoides se realizó            evaluation of a novel sperm protamine
utilizada en el pasado, permitiendo          en un paciente con un fallo reiterado de          abnormality in a population of infertile
identificar muchas proteínas presentes       fecundación en técnicas de fecundación            males. Hum Reprod. 2005;20:1298-1306.
en el espermatozoide (Com et al., 2003;      in vitro (Pixton et al., 2004). El
Pixton et al., 2004; Martínez-Heredia et     proteoma de este paciente mostró 20               Arpanahi A, Brinkworth M, Iles D, et al.
al., 2006; 2009). Pero de las dos            diferencias en comparación con los                Endonuclease-sensitive regions of human
alternativas, la capacidad de análisis de    controles y se consiguió identificar              spermatozoal chromatin are highly enriched
la generación inicial de péptidos y su       varias      proteínas      diferenciales.         in promoter and CTCF binding sequences.
análisis mediante LC-MS/MS es muy            Posteriormente se ha conseguido                   Genome Res. 2009;19:1338-1349.
superior. Por ejemplo, a través de 2D y      identificar proteínas diferenciales en
MALDI-TOF o LC-MS/MS es posible              pacientes          astenozoospérmicos,            Baker MA, Aitken, RJ. Proteomic insights
identificar hasta unos pocos cientos de      oligozoospérmicos y en pacientes con              into spermatozoa: critiques, comments and
proteínas (de Mateo et al., 2007;            alteraciones en el contenido de                   concerns. Expert Rev Proteom. 2009; 6:691-
Martínez-Heredia et al., 2008), mientras     protaminas o en la integridad del DNA             705.
que con la generación inicial de péptidos    (Baker et al., 2005; de Mateo et al.,
seguido de LC-MS/MS es posible llegar a      2007; Oliva, 2007; Martínez-Heredia et            Baker MA, Reeves G, Hetherington L, Muller
identificar hasta alrededor de 1000          al., 2009; Botta et al., 2009; Siva et al.,       J, Baur I, Aitken RJ. Identification of gene
proteínas diferentes (Baker et al., 2007;    2010). La proteómica se ha aplicado               products present in Triton X-100 soluble and
Oliva et al., 2009).                         también al estudio de los antígenos               insoluble fractions of human spermatozoa
                                             inmunogénicos presentes en los                    lysates using LC-MS/MS analysis. Proteomics
Actualmente el catálogo más amplio de        espermatozoides, tanto con el fin de              Clin Appl. 2007; 1:524-532.
las proteínas presentes en el                comprender la esterilidad inmunológica
espermatozoide humano se ha                  como para identificar posibles                    Baker MA, Witherdin R, Hetherington L,
conseguido a través de LC-MS/MS con          candidatos inmuno-anticonceptivos                 Cunningham-Smith        K,     Aitken     RJ.
1056 productos génicos identificados y       (Oliva et al. ,2009).                             Identification     of      post-translational
es complementario al obtenido                                                                  modifications that occur during sperm
mediante 2D e identificación de las          La aplicación de las técnicas de                  maturation using difference in two-
proteínas (de Mateo et al., 2007; Baker      proteómica en andrología y en biología            dimensional gel electrophoresis. Proteomics.
et al., 2007; Oliva et al., 2009). Además    reproductiva se halla en sus inicios, pero        2005; 5:1003-1012.
de la generación de catálogos de las         los datos disponibles hasta la fecha ya
proteínas, la proteómica se ha aplicado      indican su enorme potencial. Es                   Balhorn R, Reed S, Tanphaichitr N. Aberrant
también a la identificación de la            previsible que en un futuro permitan una          protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of
presencia de anomalías en pacientes          disección molecular de las distintas              infertile human males. Experientia. 1988;
estériles. Existen diversas estrategias      causas de esterilidad masculina,                  44:52-55.
para analizar el contenido diferencial de    permitiendo tanto la identificación de
proteínas presentes en dos o más             los mecanismos fisiopatogénicos                   Balhorn R. The protamine family of sperm
A C T U A L I D A D
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8


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METABOLÓMICA Y REPRODUCCIÓN HUMANA
Imma Sánchez Ribas12, Francisco Domínguez2, Carlos Simon3.
1
  IVI Barcelona, Fundación IVI, Embryomics, 2Embryomics, 3 IVI Valencia, Fundación IVI



INTRODUCCIÓN                                    análisis cualitativo y cuantitativo de            Sin embargo, con las -Ómicas tenemos
                                                proteínas y metabolitos, respectivamente,         una situación de acercamiento
Uno de los mayores retos en el campo de         en una célula, un organismo o una                 inductivo, donde no hay una hipótesis
la reproducción humana es la selección          muestra bajo distintas condiciones, con la        real, y la estrategia es generar esta
de los embriones más apropiados a               finalidad de obtener un perfil                    hipótesis desde los datos obtenidos,
transferir. Hasta la fecha, en los ciclos       comprensible de todas las proteínas y             provocando un descubrimiento del
de Fecundación In Vitro, la evaluación          metabolitos de esa célula, organismo o            conocimiento y pudiendo a posteriori
morfológica sigue siendo el método de           muestra. Los metabolitos de bajo peso             testar estas nuevas hipótesis de la forma
asesoramiento utilizado para escoger el         molecular representan el producto final           tradicional. El diseño experimental es
mejor embrión o blastocisto, pero este          de procesos de regulación celular, y por lo       muy importante en el acercamiento
método de selección es altamente                tanto revela la respuesta de los sistemas         inductivo, porque determinará qué
subjetivo y su modesto poder predictivo         biológicos a una variedad de influencias          experimentos nos van a dar la
y la variabilidad inter- e intra-               genéticas, nutricionales y ambientales            información que estamos buscando. La
observador limita su valor.                     (Singh and Sinclair, 2007)                        estrategia en la que un algoritmo elige
                                                                                                  qué experimentos hacer es conocida
Además, seleccionar el mejor embrión a          Aunque la metabolómica es obviamente              como “aprendizaje activo” y es la
transferir no sólo significa escoger el         complementaria a la genómica y                    estrategia de elección. Para ello
embrión que nos va a dar más                    proteómica, tiene ventajas especiales.            debemos       contar    con     sistemas
posibilidades de embarazo, sino que             La tabla número 1 recoge las ventajas             informáticos de alta complejidad
también es crucial escoger aquel                del estudio del metaboloma en                     (Waidyanathan, 2003; Goodacre, 2004)
embrión que nos va a aumentar la tasa           comparación con el del transcriptoma y
de recién nacido vivo en casa.                  el proteoma (Dunn and Ellis, 2003).               ¿QUÉ ES LA METABOLÓMICA?

Actualmente, lo más novedoso en el              CAMBIO EN LAS ESTRATEGIAS DE                      Existe un debate activo en la comunidad
estudio de la embriogénesis son las             GENERACION DE HIPÓTESIS                           científica sobre la definición exacta de
técnicas -Ómicas. Son disciplinas que                                                             metaboloma. Fue definido por primera vez
estudian los eventos e interacciones de las     Las -Ómicas están transformando el                por Oliver y cols. (1988) como el
estructuras celulares y sus procesos, desde     método de investigación. El obtener tal           complemento cuantitativo de todas las
el DNA hasta la función biológica; es decir,    grado de información ha implicado un              moléculas de bajo peso molecular que se
desde los genes hasta los metabolitos.          cambio en el ciclo del conocimiento. En el        encuentran en las células en un estado
Todos los procesos que contribuyen en el        ciclo del conocimiento tradicional, el            fisiológico particular o de desarrollo. Otra
                                                                                                  definición sustenta que el metaboloma
                                                                                                  consiste en sólo aquellas moléculas
                                                                                                  pequeñas y nativas que están participando
                                                                                                  en reacciones metabólicas generales y que
                                                                                                  son requeridas para el mantenimiento,
                                                                                                  crecimiento y funcionamiento de la célula
                                                                                                  (Beecher et al., 2003).

                                                                                                  En     términos       generales,       por
                                                                                                  metabolómica (Nicholson et al., 1999;
                                                                                                  Fiehn et al., 2002) se entiende la
                                                                                                  obtención, de una manera simultánea y
                                                                                                  global, de perfiles correspondientes a
                                                                                                  múltiples      concentraciones          de
                                                                                                  metabolitos y de sus fluctuaciones
fenotipo pasan a través de este complejo        conocimiento previo se utilizaba para             sistémicas y celulares en respuesta a
sistema, y la Genómica, Transcriptómica,        construir una hipótesis para ser testada          fármacos, dieta, genética, estilo de vida,
Proteómica y Metabolómica intentan              experimentalmente. El experimento                 entorno y estímulos, de forma que sea
comprender cómo un embrión crece y              producía datos que daban consistencia o           posible caracterizar los efectos adversos
cuáles son sus indicadores de éxito.            no a la hipótesis inicial. Es decir, la           y beneficiosos de esas interacciones.
                                                hipótesis era el punto de partida. El
Las tecnologías   proteómica y                  acercamiento, por tanto, era hipotético-          La metabolómica busca una descripción
metabolómica han desarrollado el                deductivo.                                        analítica de muestras biológicas
A C T U A L I D A D
     Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.
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     complejas, e intenta caracterizar y          De todas ellas, las tecnologías más          biológico o clínico y explicar los
     cuantificar todas las moléculas              empleadas       para      el      análisis   mecanismos bioquímicos relacionados
     pequeñas de ese tipo de muestras. Sin        metabolómico son la espectrometría de        con los cambios observados, y así
     embargo, medir el metaboloma es un           masas, que generalmente incluye un           ampliar el conocimiento existente.
     reto analítico considerable. Esto es         paso de separación cromatográfica, y la
     debido a la naturaleza lábil de los          espectroscopia de RMN, dado que ambas        ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM O MS) Y
     metabolitos, el rango ampliamente            plataformas proporcionan una amplia          RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
     dinámico y diverso de muchos de ellos,       información          estructural         y
     la complejidad química y heterogénea de      conformacional sobre múltiples clases        Tanto la EM como la RMN se emplean de
     los mismos, la falta de técnicas             químicas en un procedimiento analítico       forma rutinaria en los estudios
     analíticas automatizadas que puedan          único. Las dos técnicas poseen               metabolómicos.
     medir cuantitativamente un gran              diferentes ventajas y desventajas desde
     número de metabolitos de estructura          el punto de vista técnico, y suelen          La EM es una herramienta de análisis
     desconocida, el rendimiento de las           ofrecer información complementaria           metabólomico muy poderosa, ya que
     mediciones y la naturaleza elaborada de      (Lenz et al., 2007). Ambos métodos           provee una única mezcla de sensibilidad,
     los protocolos de extracción (Whitfield      proporcionan información sobre un            rapidez, calidad y análisis potencialmente
     et al., 2004).                               amplio conjunto de metabolitos, sin tener    cuantitativo de una gran cantidad de
                                                  que preseleccionar qué analitos deben ser    metabolitos. Puede ser usada sola o en
     PLATAFORMAS DE ANÁLISIS                      detectados. Esto nos permite diseñar         combinación con otras técnicas de
                                                  experimentos       basados       en     el   cromatografía. Los análisis de EM
     Todos estos desafíos deben ser               razonamiento inductivo para generar          requieren una preparación exhaustiva de
     abordados por la plataforma de análisis      nuevas hipótesis, siendo una vía             la muestra y una extracción de la misma
     empleados. Las plataformas para las          potencial de        descubrimiento de        utilizando solventes orgánicos que
     medidas del metaboloma deben ser             conocimiento a través del holismo.           pueden provocar la pérdida de algunos
     imparciales, sensibles y con una gran        Además, los dos métodos pueden               compuestos.
     capacidad de análisis de alto                emplearse para identificar las estructuras
     rendimiento para discriminar un gran         de los metabolitos, y para medir las         La RMN es una técnica no destructiva, no
     número de metabolitos. A pesar del gran      concentraciones relativas y absolutas.       invasiva, y que no modifica el equilibrio
     éxito en el desarrollo de la tecnología                                                   biológico,     y    proporciona      una
                                                                                               información detallada sobre las
     Fig 1.
                                                                                               estructuras moleculares en solución.
                                                                                               Además la espectroscopia de RMN es una
                                                                                               técnica muy fiable para las aplicaciones
                                                                                               metabolómicas que requieren un alto
                                                                                               grado de reproducibilidad.

                                                                                               Ambas técnicas permiten la detección
                                                                                               simultánea de un amplio rango de
                                                                                               metabolitos estructuralmente diversos y
                                                                                               la detección en bajas concentraciones de
                                                                                               los mismos.

     metabolómica, aún no es posible              OBJETIVOS DE LA METABOLÓMICA                 Es importante tener en cuenta que, sea
     analizar con una única plataforma                                                         cual sea el origen de las muestras,
     analítica la diversidad de metabolitos       Todos los estudios metabolómicos dan         deben evitarse fuentes potenciales de
     complejos. La Fig. 1 indica las distintas    lugar a un conjunto de resultados            artefactos durante el proceso de
     tecnologías      para     el     análisis    complejo, que requiere un software           recogida de las muestras biológicas, con
     metabolómico de muestras, así como las       específico para su visualización y           el fin de obtener resultados que posean
     características más relevantes de las        métodos          quimiométricos         y    una buena calidad y fiabilidad.
     mismas. El tipo de muestras que se           bioinformáticos para su interpretación.
     analiza mediante estas técnicas son          El objetivo de estos experimentos es         Análisis estadístico multivariable
     biofluidos como orina, plasma o suero        generalmente el de obtener huellas
     previa precipitación de proteínas;           bioquímicas que puedan ser útiles desde      Los métodos de análisis estadístico
     metabolitos intracelulares de plantas,       un punto de vista diagnóstico o de           multivariable proporcionan un medio de
     microbios y animales, previa extracción      clasificación, y, en un segundo lugar, el    optimizar la extracción de la información
     mediante solventes polares y no polares;     de identificar las sustancias que            contenida en los espectros de EM y RMN
     tejidos sin previa o mínima preparación      contribuyen a dicho diagnóstico o            de mezclas complejas. Una vez realizados
     y huellas metabólicas en secreciones         clasificación, ya que éstas conforman un     todos los pasos anteriores, lo que se tiene
     naturales de metabolitos intracelulares      conjunto complejo de biomarcadores           es una serie (uno por muestra) de perfiles
     hacia el volumen extracelular.               que puede ayudar a definir el contexto       multivariable que representan un punto
A C T U A L I D A D
                                                                                          Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                            11


en un espacio K-dimensional, y cuya          emplea para revelar la estructura interna        contienen módulos (B-Bioref-Code,
posición (coordinadas) depende de los        de un conjunto de datos sin que medie            Bruker BioSpin) que permiten la
valores de cada uno de los descriptores (o   ningún tipo de conocimiento previo del           identificación y asignación de metabolitos
metabolitos) que describen el sistema (la    sistema. PLS, sin embargo, es un método          presentes en mezclas complejas. Hay que
muestra). Cuando se trata de analizar una    supervisado para regresión. En este              tener en cuenta que las bibliotecas
serie de perfiles, resulta muy útil la       caso, el objetivo es predecir las                metabolómicas no son completas, y que
aplicación de lo que se denominan            respuestas en un conjunto de datos.              no todos los metabolitos hallados tienen
métodos basados en la proyección. Los        Empleando una barrera de corte, PLS              posibilidad de identificación.
métodos de proyección convierten tablas      puede emplearse también para análisis
de datos multidimensionales en modelos       basados en la clasificación y                    ASESORAMIENTO METABOLÓMICO DE
de dimensionalidad. Esto permite             discriminación (PLS-DA, “Partial Least           CALIDAD EMBRIONARIA
detectar además agrupaciones y               Squares-Discriminant Analysis”).
tendencias, ya que puntos que se                                                              El metabolismo es intrínseco a la salud
encuentran cercanos corresponden a           Identificación de metabolitos                    del embrión, por lo que muchas
perfiles multivariables relativamente                                                         investigaciones se han concentrado en
similares. De forma opuesta, puntos que      Dependiendo del tipo de análisis que se          desarrollar marcadores metabólicos no
se encuentran alejados unos de otros         esté desarrollando, los estudios                 invasivos de capacidad de desarrollo,
presentan descriptores muy diferentes.       metabolómicos pueden requerir la                 como el consumo de oxígeno, reacciones
                                             identificación de los metabolitos                REDOX, el consumo energético a través
Un ejemplo de lo explicado podemos verlo     presentes en las muestras biológicas             de Na+, K+ y ATPasa o el turnover de
en la Figura 2, donde puede apreciarse la    analizadas. Este objetivo puede                  aminoácidos (Houghton et al., 2004).
Fig 2.
                                                                                              Las últimas investigaciones en las
                                                                                              técnicas moleculares están definiendo
                                                                                              perfiles     génicos,       proteicos     y
                                                                                              metabolómicos para intentar detectar
                                                                                              cuál es el ovocito o embrión más hábil,
                                                                                              entendiendo esta habilidad como su
                                                                                              capacidad para implantar (Katz-Jaffe et
                                                                                              al., 2006; Patricio et al., 2007; Brison et
                                                                                              al., 2007; Seli et al., 2007)

                                                                                              Actualmente se están desarrollando
utilidad de esta herramienta para            alcanzarse mediante la comparación entre         técnicas     cuantitativas     para      el
comprender los patrones que subyacen         los desplazamientos químicos obtenidos           asesoramiento      no     invasivo      del
bajo la gran cantidad de información         en los espectros de EM o RMN y aquellos          metabolismo embrionario, y es el objetivo
generada en los estudios metabolómicos.      disponibles en bases de datos como la            de investigaciones actuales el determinar
Quedan patentes las relaciones entre las     MMCD        (Madison       Metabolomics          su valor como predictores de viabilidad
distintas muestras, pudiendo describir       Consortium Database) (Cui et al., 2008))         embrionaria y embarazo (Seli et al., 2007).
agrupamientos, tendencias e influencias.     o la HMDB (Human Metabolome
                                             DataBase) (Wishart et al., 2007).                Seli y col. publicaron en 2007 el primer
Aunque los métodos de proyección             Alternativamente, existen programas              estudio con un enfoque metabolómico
descritos forman la base de los estudios     (p.ej., “Analysis of MIXtures”, AMIX,            para estudiar la viabilidad del embrión
metabolómicos, los análisis estadísticos     Bruker BioSpin) que permiten realizar            humano. Ellos utilizaron como
dependen del tipo de estudio que se esté     todas las etapas descritas anteriormente         plataforma metabolómica de análisis el
desarrollando. Existe una gran variedad      (selección de regiones de interés,               Near-infrared and Raman spectroscopy,
de métodos que pueden emplearse en el        segmentación         del        espectro,        para analizar y comparar el perfil
análisis de datos metabolómicos. La          normalización, análisis estadístico) y que       metabolómico utilizando medios
principal diferencia entre todos ellos es                                                     condicionados        provenientes      de
si se dispone o no de información previa                                                      embriones que implantaron frente a los
                                                                               Fig 3.
sobre la clasificación de muestras en                                                         que no implantaron. Aunque no
clases distintas, o si se sospecha la                                                         encontraron marcadores específicos, si
existencia de nuevas clases. Sin duda                                                         obtuvieron distintos espectros entre
alguna, los métodos más empleados de                                                          ambos grupos, siendo posible diferenciar
análisis    multivariable     son     los                                                     fácilmente ambas poblaciones La Fig 3
denominados PCA (análisis de                                                                  muestra los distintos espectros que
componentes principales (Holmes,                                                              obtuvieron de los medios de cultivo
1998)) y PLS (mínimos cuadrados                                                               embrionario analizados de cada una de las
parciales (Wold et al., 1984)). El PCA es                                                     muestras utilizadas en el estudio (Seli et
un método no supervisado que se                                                               al., 2007).
A C T U A L I D A D
     Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.
12


     El mismo grupo, en 2008, publica la           Fig 4.
     identificación de marcadores de
     viabilidad      utilizando        análisis
     metabolómico mediante NMR, en un
     estudio retrospectivo realizado en 34
     pacientes.      Explican       encontrar
     diferencias      significativas        en
     concentraciones de glutamato entre
     embriones procedentes de embarazos
     y/o partos y embriones procedentes de
     fallo de implantación (Seli et al., 2008).

     Otra aplicación de la metabolómica en el
     campo de la Reproducción Humana es el
     que estamos llevando en el Instituto
     Valenciano de Infertilidad, con el apoyo
     de la Fundación IVI. Nuestro objetivo         muestras procedentes de embriones con         R. Predicting human embryo viability: the road
     es     desarrollar    un    diagnóstico       diagnóstico de aneuploidías se concentran     to non-invasive análisis of the secretome using
     preimplantacional no invasivo con la          en un área distinta.                          metabolomic footprinting. Reproductive
     ayuda de estas nuevas tecnologías.                                                          BioMedicine Online 2007; 15. 296-302.
     Pretendemos encontrar un perfil               DISCUSIÓN
     metabolómico embrionario que nos                                                            Cui Q et al. Metabolite identification via the
     permita discriminar los embriones             El método de evaluación tradicional           Madison Metabolomics Consortium Database.
     normales de los embriones aneuploides,        embrionario tiene una capacidad limitada      Nat Biotechnol 2008; 26: 162-164.
     utilizando el medio de cultivo donde          para seleccionar embriones con desarrollo
     éstos se desarrollan.                         potencial. Hay una clara necesidad de         Dunn W, Ellis D. Metabolomics : current
                                                   mejora en nuestro trabajo diario;             analytical platforms and methodologies.
     La instrumentación de análisis                deberíamos ser capaces de aumentar las        Trends in analytical chemistry 2005; 24: 285-
     metabolómico que estamos utilizando es        tasas de gestación y disminuir el riesgo de   294.
     la Espectrometría de Masas asociada a         gestación múltiple. Actualmente existen
     UPLC. El sistema de UPLC ha sido              nuevas tecnologías en desarrollo para         Fiehn O. Metabolomics – the link between
     diseñado para detectar partículas             conseguir este objetivo, pudiendo ser         genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol
     pequeñas (1,7 mm) y encontrar así             tecnologías que utilicemos en un futuro       2002; 48: 155-71.
     perfiles de alta resolución. Por lo tanto,    como herramientas útiles de selección
     este sistema es óptimo para el análisis       embrionaria, así como tecnologías que         Goodacre R, Vaidyanathan S, Dunn W, Harrigan
     de muestras de alta complejidad, como         nos permitan expandir el conocimiento de      G and Kell D. Metabolomics by numbers:
     nuestros medios de cultivo, debido al         la fisiología embrionaria con el objetivo     acquiring and understanding global
     alto poder de separación metabólica y         de aumentar la eficacia de las Técnicas de    metabolite data. Trends in Biotechnology
     resolución de picos.                          Reproducción Asistida.                        2004; 22: 245-252.

     En los análisis llevados a cabo hasta la      La capacidad de evaluar la producción y       Holmes E, Nicholson J, Nicholls A, Lindon J,
     fecha, hemos observado que el perfil          consumo metabolómico de un embrión            Connor S, Polley S, Connelly J. The
     metabólico de los medios de cultivo           individual nos llevaría a una mejor           identification of novel biomarkers of renal
     de los embriones humanos parece               comprensión de la función celular y           toxicity using automatic data reduction
     discriminar        entre     embriones        fisiología en etapas específicas de la        techniques and PCA of proton NMR spectra of
     cromosómicamente         normales      y      embriogénesis. Por otra parte, este           urine Chemometrics and Intelligent
     anormales, aunque existen limitaciones        enfoque nos ayudaría a mejorar los            Laboratory Systems. 1998; 44: 245-255.
     debidas a la baja cantidad de                 medios de cultivo de embriones y
     metabolitos presentes en las muestras.        podríamos identificar las interacciones       Houghton F, Leese H. Metabolism and
                                                   entre los embriones y el epitelio uterino     developmental      competence     of     the
     La Fig 4 es un score-plot donde cada punto    materno antes de la implantación.             preimplantational embryo. Europ Jour of Obst
     representa un medio de cultivo                                                              Gyn Reprod Bio 2004.115S. S92-S96.
     embrionario, lo que nos permite apreciar      REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
     la relación que hay entre las muestras. La                                                  Johnson HE, Broadhurst D, Goodacre R, Smith
     tendencia observada es que muestras           Beecher,CWW. The human metabolome. In         AR. Metabolic fingerprinting of salt-stressed
     procedentes de embriones diagnosticados       metabolic profiling: its role in biomarker    tomatoes. Phytochemistry 2003; 62: 919-28.
     normales        mediante      diagnóstico     discovery and gene function analysis, 2003.
     preimplantacional para screening de           pp. 311-319.                                  Katz-Jaffe M, Gardner D, Schoolcraft W.
     aneuploidías (PGD-AS) se concentran en                                                      Proteomic analysis of individual human
     un área del diagrama de coordenadas, y        Brison DR, Hollywood K, Arnesen R, Goodacre   embryos to identify novel biomarkers of
A C T U A L I D A D
                                                                                                           Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                                                   13


development and viability. Fertility and             Scott R, Seli E, Miller K, Sakkas D, Scott K, Burns       Urbanczyk-Wochniak E, Luedemann A, Kopka
Sterility 2006;1.                                    D. Noninvasive metabolomic profiling of                   J, Selbig J, Roessner-Tunali U, Willmitzer L,
                                                     embryo culture media using Raman                          Fernie AR. Parallel analysis of transcript and
Kell D et al. (1999). Technological and medical      spectroscopy predicts embryomic reproductive              metabolic profile. EMBO Rep 2003; 4: 989-
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                                                                                                               Waidyanathan S. et al. Explanatory
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                                                     of embryo culture media using Raman and
Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E.                   near-infraread spectroscopy correlates with               Whitfield PD, German A and Noble P.
‘Metabonomics’: understanding the metabolic          reproductive potencial of embryos in women                Metabolomics: and emerging post-genomic
responses of living system to pathophysiological     undergoing in vitro fertilization.Fertyl Steril           tool for nutrition. British Journal of Nutrition.
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biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica
1999; 29: 1181-9.                                    Seli E, Botros L, Sakkas D, and Burns DH.                 Wishart DS, et al. HMDB: the Human
                                                     Noninvasive metabolomic profiling of embryo               Metabolome Database. Nucleic Acids Res.
Oliver SG et al. Systematic functional analysis      culture media using proton nuclear magnetic               2007; 35. D521-D526.
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                                                     fertilization. Fertil Steril 2008; 90: 2183-89.           Linear Regression. The Partial Least Squares
Patricio P, Fragouli E, Bianchi V, Borini A, Wells                                                             (PLS) Approach to Generalized Inverses J Sci
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A R T Í C U L O                                    I

14

     EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA
     DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN
     OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II
     EFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE                                                              AND        CHROMOSOME
     CONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES

     Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2
     1
      Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),
     Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.
     *Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia.
     e-mail: cristinacostana@hotmail.com
     Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010



         RESUMEN
         El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre la
         integridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del huso
         meiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. La
         tasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuración
         normal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica de
         vitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
         15(1):14-17.
         Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica.



         ABSTRACT
         The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle and
         chromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh
         (control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. The
         proportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytes
         showing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
         15(1):14-17.
         Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration



     INTRODUCCIÓN                                    la sincronización donante-receptora en           Los microtúbulos, que conforman el
                                                     ciclos de donación de ovocitos o,                huso meiótico, y los microfilamentos,
     La criopreservación de ovocitos permite         simplemente, en mujeres fértiles que             localizados en el córtex ovocitario, son
     preservar la fertilidad en pacientes que        deseen posponer la maternidad.                   muy susceptibles a la temperatura de
     por diversas etiologías pueden                                                                   enfriamiento (chilling) y a la exposición
     desarrollar un Fallo Ovárico Prematuro          La criopreservación ovocitaria utilizando        a los crioprotectores (Boiso et al.,
     (FOP). Es el caso de exposición a agentes       la técnica de congelación convencional se        2002). Una alteración en estas
     quimio/radioterápicos, enfermedades             considera         un       procedimiento         estructuras podría conducir a una
     autoinmunes o hematológicas, o                  experimental, debido a las bajas tasas de        alineación cromosómica incorrecta
     procesos quirúrgicos potencialmente             supervivencia y gestación y al limitado          previa a la extrusión del corpúsculo
     esterilizantes. La criopreservación             número de recién nacidos logrado (ASRM,          polar, a una segregación cromosómica
     ovocitaria puede emplearse también              2006).        Los     protocolos       de        alterada, fecundación anómala y/o a una
     para evitar la criopreservación de              congelación/descongelación                       elevada incidencia de aneuploidías.
     embriones, para rescatar ciclos                 convencionales conllevan una reducción
     complicados con un síndrome de                  lenta de la temperatura en el tiempo,            La vitrificación combina tasas de
     hiperestimulación ovárica o con                 resultando en el daño de estructuras             enfriamiento del orden de -15.000º C a -
     ausencia de muestra seminal el día de la        vitales de los ovocitos.                         30.000º C por minuto (Liebermann et al.,
     punción-aspiración folicular, para evitar                                                        2003) y concentraciones elevadas de
A R T Í C U L O                                   I
                                                                                           Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                            15


crioprotectores, aumentando de tal           hiperestimulación ovárica controlada              compuestas por medio 199              con
manera su viscosidad que no cristaliza       que incluyó, como frenado hipofisario,            concentraciones decrecientes           de
sino que forma un estado amorfo similar      agonistas de la GnRH en protocolo largo           sacarosa (1.0M y 0.5M).
al vidrio.                                   y como estimulación FSH recombinante.
                                             Los ovocitos se recuperaron por punción           La supervivencia ovocitaria se evaluó
La técnica de vitrificación permite burlar   transvaginal ecoguiada, 36-38 horas               inmediatamente tras la desvitrificación
dos de los factores que limitan el éxito     tras la administración de la hCG. Los             y tras 4 horas de cultivo in vitro,
de la criopreservación: por un lado, el      complejos cúmulo-ovocito fueron                   valorándose la integridad de la zona
proceso conocido como chilling injury        cultivados en medio IVF (Universal IVF            pelúcida, la apariencia del citoplasma y
(Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro,      Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark)              la ausencia de lisis celular.
la formación de cristales de hielo en el     bajo condiciones de cultivo estándar
interior de las células (Mazur, 1984). El    (37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2              Fijación y tinción inmunocitoquímica:
primero se define como el daño               horas de cultivo in vitro, los ovocitos
irreversible tras la exposición de las       fueron incubados con 80 IU/mL                     La fijación de los ovocitos y tinción
células a bajas temperaturas (de + 15º C     hialuronidasa (Hyadase, Medicult,                 inmunocitoquímica del huso meiótico se
a -5º C) antes de que se produzca la         Jyllinge, Denmark) y las células del              realizó siguiendo el protocolo descrito
enucleación del hielo. En consecuencia,      cúmulo fueron eliminadas mediante el              por Lin et al. (2008).
estructuras      celulares     como     el   pipeteado mecánico de los ovocitos. Los
citoesqueleto o las membranas celulares      ovocitos fueron entonces observados               Brevemente,        los    ovocitos    MII
se ven claramente afectadas. El              utilizando un microscopio invertido               desvitrificados y frescos (grupo control)
fenómeno del chilling puede minimizarse      (x200) y los ovocitos MII se identificaron        fueron fijados a 37ºC durante 1 hora en
durante el proceso de vitrificación          por la presencia del primer corpúsculo            una solución de formaldehído al 2% y
mediante el empleo de tasas de               polar.                                            permeabilizados en una solución de
enfriamiento elevadas (Liebermann et                                                           Tritón X-100 al 0.5% durante 30
al., 2003). La velocidad de enfriamiento     Se vitrificaron un total de 12 ovocitos en        minutos a temperatura ambiente. Para
de la muestra va a depender del volumen      estadio de MII recuperados de pacientes           la tinción de la tubulina, los ovocitos se
de la solución de vitrificación, así, a      incluidas en el Programa de Fecundación           incubaron durante 90 minutos a 37ºC en
menor volumen, mayor velocidad de            in vitro del Instituto de Medicina                una solución de anticuerpos primarios
enfriamiento,       aumentando        ésta   Reproductiva (IMER) de Valencia que               anti-α y anti-β tubulina (1/400), seguido
mediante la inmersión directa en             firmaron         el      correspondiente          de 3 lavados y se incubaron durante 120
nitrógeno líquido. Para evitar la            consentimiento informado. Como grupo              minutos a 37ºC en una solución de
formación de cristales de hielo, en la       control (ovocitos MII no vitrificados), se        anticuerpo secundario Alexa 488
técnica de vitrificación se emplean          incluyeron 6 ovocitos procedentes de              (1/200). Para la tinción de
elevadas        concentraciones         de   pacientes pertenecientes al Programa de           microfilamentos, los ovocitos se
crioprotectores (Liebermann et al.,          Fecundación in vitro de la Unidad de              incubaron en una solución de rodamina-
2003), sin olvidar su efecto tóxico para     Reproducción del Hospital Universitario           faloidina durante 60 minutos a
las células. Sin embargo, una                la Fe de Valencia, previa firma del               temperatura ambiente. Finalmente, los
composición            adecuada         de   consentimiento de participación en un             ovocitos fueron montados utilizando
crioprotectores puede solventar los          Proyecto de Investigación desarrollado en         medio de montaje con DAPI y
efectos tóxicos y osmóticos debidos a la     el Centro de Investigación Príncipe Felipe        mantenidos a 4ºC hasta su evaluación.
alta concentración de crioprotectores en     (CIPF) de Valencia y con licencia por parte
la solución de vitrificación. La mezcla de   del Instituto de Salud Carlos III.                Evaluación del huso meiótico:
crioprotectores más utilizada es la
formada por etilenglicol (EG),               Protocolo de vitrificación:                       Para la valoración de los microtúbulos,
dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa.                                                            microfilamentos y cromosomas, se
                                             Para la vitrificación ovocitaria se utilizó       utilizó un microscopio confocal con
El objetivo de este estudio fue evaluar el   el kit comercial de Irvine Scientific con         lasser-scanning (Leica DM IRE 2)
efecto de la criopreservación ovocitaria     el Cryotip™ como contenedor. Los                  equipado con un láser de argón,
mediante la técnica de vitrificación con     ovocitos fueron equilibrados en una               perteneciente al Servicio de Microscopía
un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la       solución compuesta por 7.5 % (v/v) de             Confocal del CIPF de Valencia.
integridad del huso meiótico y la            DMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20%
organización cromosómica en ovocitos         suplemento sustitutivo de suero en                RESULTADOS
humanos Metafase II (MII).                   medio 199. Posteriormente, fueron
                                             expuestos a la solución de vitrificación          Se vitrificaron y desvitrificaron 12
MATERIAL Y MÉTODOS                           compuesta por 15 % (v/v) de DMSO +                ovocitos MII. La tasa de supervivencia
                                             15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa +              fue del 91,6% (11/12). Todos los
Ovocitos MII:                                20% suplemento sustitutivo de suero en            ovocitos que sobrevivieron a la
                                             medio 199 y cargados en el Cryotip™.              desvitrificación      mostraron   una
A todas las pacientes que formaron parte     Para la desvitrificación, los ovocitos            apariencia morfológica normal tras 4
del estudio se les aplicó un protocolo de    fueron expuestos a soluciones                     horas de cultivo in vitro.
A R T Í C U L O                                  I
     Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico.
16


     Se        fijaron     para        tinción     correcta segregación cromosómica y              AGRADECIMIENTOS
     inmunocitoquímica 10 ovocitos MII             evitar así la posible aparición de
     desvitrificados y 6 ovocitos MII frescos.     aneuploidías en el embrión. Aunque sólo         Este estudio ha sido parcialmente
     La tasa de ovocitos informativos fue del      se observaron anomalías en el huso              financiado por el Programa de Medicina
     100% para el grupo control y del 70%          meiótico/cromosomas en el grupo                 Regenerativa del Instituto de Salud
     para los ovocitos desvitrificados. Esta       de ovocitos desvitrificados, las                Carlos III.
     menor tasa de informatividad para             diferencias no fueron estadísticamente
     ovocitos desvitrificados fue debida a         significativas respecto al grupo control        REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
     problemas acontecidos durante la              (frescos). Estos resultados son similares
     tinción, con independencia de la técnica      a los descritos en la bibliografía (Li et       Boiso I, Martí M, Santaló J. A confocal
     de vitrificación.                             al., 2006; Cobo et al., 2008).                  microscopy analysis of the spindle and
                                                                                                   chromosome configurations of human
     En función de la orientación del              La vitrificación utilizando el Cryotip™         oocytes cryopreserved at the germinal
     complejo huso/cromosomas respecto al          como contenedor permite la vitrificación        vesicle and metaphase II stage. Human
     plano focal, se consideró una                 de ovocitos en microvolúmenes (alrededor        Reprod 2002; 17: 1885-1891.
     configuración normal si: a) cuando al         de 1 μL), incrementando la tasa de
     estar orientado de forma paralela al          enfriamiento y minimizando el efecto            Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui
     plano focal el huso presenta una              tóxico de los crioprotectores al disminuir      J, Domingo J, Remohí J. Effect of different
     estructura típica en forma de barril con      su concentración. El mantenimiento de la        cryopreservation protocols on the
     los polos ligeramente señalados y los         integridad del huso meiótico y de la placa      metaphase II spindle in human oocytes.
     cromosomas dispuestos en el ecuador,          metafásica tras la desvitrificación sugiere     Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359.
     b) cuando al estar orientado de forma         que dicha técnica de vitrificación permite
     perpendicular al plano focal el huso          preservar la calidad inicial del ovocito y el   Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y,
     presenta una estructura circular con los      potencial necesario para soportar el            Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocal
     cromosomas orientados en forma de             posterior     desarrollo      embrionario.      microscopic analysis of the spindle and
     círculo y c) cuando al estar orientado de
     forma oblicua al plano focal el huso
     presenta una estructura en forma oval
     (barril acortado) con los cromosomas
     alineados en el ecuador. Por otro lado,
     una configuración anómala del complejo
     huso/cromosomas quedó representada
     por una desorganización parcial o
     completa de los microtúbulos o por una
     dispersión cromosómica o apariencia
     cromosómica aberrante o poco
     condensada. En las Figuras 1 y 2 se
     muestran una configuración normal y
     una       anómala       del      complejo
     huso/cromosomas, respectivamente.

     La proporción de ovocitos con una             Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica.
     configuración normal del huso meiótico
     y una alineación correcta de los
     cromosomas fue del 100% para los
     ovocitos del grupo control y de 85,7%
     para los ovocitos desvitrificados, sin que
     se observaran diferencias significativas
     entre ambos grupos.

     DISCUSIÓN

     En este trabajo se evalúa el efecto de la
     técnica de vitrificación con un sistema
     cerrado     (Cryotip™)       sobre     la
     configuración del huso meiótico y la
     organización cromosómica en ovocitos
     humanos en estadio de MII. La
     integridad de este complejo es
     imprescindible para que se produzca una       Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.
A R T Í C U L O                                   I
                                                                                                Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
                                                                                                                                                17


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oocytes matured in vitro. Fertil Steril 2006;      Reproductive Technology. Ovarian tissue
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Revista Asebir junio 2010

  • 1. ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN Junio 2010 Vol.15 · Nº1 REVISTA Complejo huso meiótico-placa metafásica ACTUALIDAD DEBATE Proteómica del espermatozoide humano. Es necesario considerar los intentos previos. Metabolómica y reproducción humana. Auditorías para el 100% de los Centros. Transparencia no siempre es sinónimo de ARTÍCULOS honestidad. Efecto del proceso de vitrificación sobre la La nueva vía del Registro de Actividad estructura del huso meiótico y organización de la SEF: El aumento de la calidad. cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. FORMACIÓN CONTINUADA Las variantes cromosómicas afectan la Impronta genómica y reproducción asistida. calidad embrionaria. AGENDA AULA JOVEN NOTICIAS Relación entre los patrones pronucleares y la NORMAS DE PUBLICACIÓN calidad embrionaria según criterios asebir.
  • 3. Í N D I C E Junio 2010 Vol. 15 · Nº1 EDITA Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción (ASEBIR). EDITORES Y DIRECTORES CIENTÍFICOS Marga Esbert - Barcelona Jorge Cuadros - Madrid COMITÉ EDITORIAL Presidente: Dr. Manuel Ardoy Vilches SUMARIO HOSPITAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN - Madrid Vicepresidenta y RRPP: Dra. Carmen Ochoa Marieta CER. CLINICA COTERO - Santander SUMARIO Pág. Secretaría y RRPP: Dra. Montserrat Boada Palá INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS - Barcelona EDITORIAL 3 Tesorería y Relaciones con la Industria: Reconocimiento de la Embriología Clínica Dr. Fernando Marina Rugero Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy INSTITUTO DE REPRODUCCION CEFER - Barcelona Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica Vocalía de Grupos de Interés e Investigación: Dr. Josep Santaló Pedro ACTUALIDAD 5 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA - Bellaterra Proteómica del espermatozoide humano Rafael Oliva Virgili, Josep Maria Estanyol, Sara de Mateo López, Vocalía de congresos: Judit Castillo Corullón, José Luis Ballescà Lagarda. Dra. María José Torelló Ybañez HOSPITAL QUIRÓN BARCELONA - Barcelona Metabolómica y reproducción humana Dra. Yolanda Mínguez Royo Imma Sánchez Ribas, Francisco Domínguez, Carlos Simon IVI MADRID - Madrid Vocalía de Docencia y formación continuada: ARTÍCULOS 14 Dr. Ignacio Santiago Álvarez Miguel Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso INST. EXTREMEÑO REPRODUCCIÓN ASISTIDA –IERA -Badajoz meiótico y organización cromosómica en ovocitos humanos Dr. Josu Franco Iriarte en metafase II CENTRO SANITARIO VIRGEN DEL PILAR - San Sebastian Cristina Costana Duque, Javier Alfonso, Rita Cervera, Ana Monzó, Vicente Montañana, Miodrag Stojkovic, Alberto Romeu Dr. Juan Manuel Moreno García CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria Vocalía Página Web: Mireia Poveda, Teresa Rubio, Isabel Ochando, Laura Gil, Manuel Dr. Juan Manuel Moreno García Lloret, José Jesús López-Gálvez, Antonio Urbano, Juan Manuel CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante Moreno, Joaquín Rueda Vocalía de publicaciones: Dr. Jorge Martín Cuadros Fernández AULA JOVEN 25 CLÍNICA FIV-MADRID - Madrid Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria Dra. Marga Esbert Algam según criterios asebir IVI BARCELONA - Barcelona Marta Brossa, Xènia Blanch, Marta Antich La Revista de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biología DEBATE 30 de la Reproducción) está indexada en la base de datos Latindex Es necesario considerar los intentos previos y en la base de datos ICYT, de ciencia y tecnología, del Consejo Auditorías para el 100% de los Centros Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de España y ha sido aceptada para su inclusión en Índice Médico Español Transparencia no siempre es sinónimo de honestidad (IME), la base de datos de Biomedicina del CSIC. La nueva vía del Registro de Actividad de la SEF: El aumento de la calidad. PUBLICIDAD Y COLABORACIONES FORMACIÓN CONTINUADA 36 Secretaría ASEBIR Impronta genómica y reproducción asistida C/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª 28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94 Cristina Camprubí www.asebir.com · asebir@asebir.com AGENDA 42 DISEÑO, MAQUETACIÓN E IMPRESIÓN NOTICIAS 43 GÓBALO: Gráfica · Web · Multimedia · Consultoría INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN 44 C/ Castillo de Fuensaldaña 4, Oficina 213 28232 · Las Rozas · Madrid Tfno - Fax.: 91 626 39 74 Imágenes de la portada: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa www.gobalo.es · info@gobalo.es metafásica en oocitos humanos (Imagen superior) y configuración anormal (Imagen Depósito legal: M-18873-1996 izquierda). Cortesía de Duque et al. pp:14-17. ISSN: 1136-4424 Soporte válido: 78-R-CM
  • 5. E D I T O R I A L Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 3 RECONOCIMIENTO DE LA EMBRIOLOGÍA CLÍNICA Han pasado ya más de 30 años desde el nacimiento de Louise Brown. Desde aquellos días hasta hoy, la Reproducción Humana Asistida, sobre todo la Embriología Clínica, ha experimentado enormes cambios. Han surgido nuevas alternativas, y otras se han visto muy modificadas; y lo mejor de todo es que el cambio, la evolución, continúa. La reproducción humana asistida y, sobre todo, aquello que nos ocupa: la Embriología, ha terminado ocupando un campo de características propias y bien definidas dentro del panorama sanitario. Resulta difícil pensar que algún gestor de sanidad de las diferentes autonomías pueda dudar de que esta atención sanitaria deba estar incluida en su cartera de servicios. Muchos son los cambios que han consolidado un campo propio y específico para la Embriología Clínica. Tan sólo por enumerar algunos: -Aparición constante de alternativas terapéuticas específicas. -Desarrollo de diferentes técnicas de diagnóstico. Tanto propias como traídas de otros tipos de laboratorios. -Consolidación de la gestión del laboratorio de reproducción humana asistida, con características diferenciales del resto de laboratorios. -Implantación de la reproducción humana asistida en la cartera de servicios habitual del sistema sanitario Español -Posibilidades docentes propias y de formación práctica, cada vez más asequibles. -Desarrollo de investigación propia, junto con una gran cantidad de alternativas de intercomunicación científica. -Existencia de diversas asociaciones científicas exclusivas de este campo. -Desarrollo legislativo específico de forma habitual, no sólo a nivel nacional -Un impacto incuestionable en la sociedad: natalidad, partos múltiples, preservación de la fertilidad, parejas homosexuales... La reproducción humana asistida ha pasado al espectro de lo habitual. A pesar de todo esto, hay una parcela esencial que se continúa dejando de lado: el reconocimiento específico, propio y oficial de un ejercicio profesional, el de la Embriología Clínica. Consecuencia de este paso sería la definición de responsabilidades y funciones, y por tanto la planificación de esquemas formativos. No cabe duda alguna, el principal beneficiario de tal reconocimiento sería el propio paciente, tanto por la seguridad como por la calidad asistencial que recibiría. A muchos nos cuesta pensar qué razones llevan a los responsables del Estado a mantener en una situación de casi parada un reconocimiento que parece tan lógico a los profesionales cercanos a la reproducción humana asistida. Sin embargo, por nuestra parte sí que ha habido un esfuerzo continuado. Podemos hacer un breve resumen. Uno de los primeros pasos fue la Cualificación de Especialista en Reproducción Asistida Humana, emitida durante un breve periodo de tiempo por el COB. Tras el escaso éxito de ésta, y pasado algún tiempo, surgió la posibilidad de que al profesional del Laboratorio de Reproducción Humana Asistida se le reconociera una de las especialidades reguladas en el RD 1163/2002, que afectaba a biólogos, químicos y bioquímicos. La solicitada mayoritariamente fue la de Análisis Clínicos. La respuesta oficial la conocemos todos, un rotundo NO. De esta respuesta hubo dos consecuencias claras: -Nosotros aprendimos que NO éramos asimilables como parte de una especialidad previa. Por tanto, sin lugar a dudas, el reconocimiento pasaba por algo más exclusivo y específico. -El ministerio no podía seguir mirando hacia otro lado durante más tiempo. Era demasiado obvio, tenía una enorme cantidad de expedientes denegados encima de la mesa y todos tenían algo en común, trabajaban en reproducción humana asistida. Tras esto, empezamos diferentes reuniones con el ministerio. Una de las primeras cosas que quedaron bien claras era la imposibilidad, por el momento, de una especialidad propia. Máxime cuando la intención es disminuir el número de las que hay. Una opción ofrecida fue la posibilidad de valorar el formar parte de las ramas, troncalidades, que pasarán a formar parte de un tronco común, el del Laboratorio Clínico. Tal y como pasará con las hasta ahora existentes de forma individual: Análisis Clínico, Bioquímica Clínica... Esta opción fue trabajada, y se presentó a la correspondiente Dirección General del Ministerio de Sanidad una propuesta de programa formativo de troncalidad en Embriología Clínica. Ésta la podéis obtener en la Web de ASEBIR.
  • 6. E D I T O R I A L 4 Si bien actualmente las troncalidades no se han ultimado, parece complejo que se vayan a incluir más campos del conocimiento que los ya aceptados como especialidad, aunque seguimos trabajando en ello con el ministerio y con las comunidades autónomas, intentando hacer llegar el asunto al Consejo Interterritorial. Pero el ministerio nos propone una vía alternativa que ayudaría a fundamentar pasos ulteriores, un Certificado en Embriología Clínica que fuera valorado y emitido por ASEBIR; máxime cuando es conocedor del proceso de certificación de la ESHRE. Sin olvidar el resto de los caminos abiertos, la vía principal de evolución por la que se ha optado, y prácticamente la única que el ministerio deja como viable a corto-medio plazo, es este certificado. Sabemos que su relevancia dependerá de qué apoyos o reconocimientos oficiales pueda llegar a tener, así como de la consideración personal que se le otorgue. Por el momento, la Dirección General de Ordenación profesional, Cohesión del SNS y Alta Inspección del Ministerio de Sanidad y Política Social ha dado un visto bueno a un esquema de Certificación en Embriología Clínica de ASEBIR. Éste tiene varias fases, y en la actualidad se está procediendo a su desarrollo y puesta en marcha, tal y como se está informando a los socios. La apuesta es arriesgada, sobre todo cuando la incertidumbre de saber a qué puerto nos hará llegar es grande. Pero el mensaje es claro, si algo podemos decir en el presente, es que la Embriología Clínica ha madurado lo suficiente como para reclamar un lugar propio. Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica.
  • 7. A C T U A L I D A D Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 5 PROTEÓMICA DEL ESPERMATOZOIDE HUMANO Rafael Oliva Virgili1, Josep Maria Estanyol2, Sara de Mateo López1, Judit Castillo Corullón1, José Luis Ballescà Lagarda3 1 Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic de Barcelona, y Laboratorio de Genética Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona. 2 Unitat de Proteòmica, Serveis de Suport a la Recerca, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona 3 Institut Clínic de Ginecología Obstetricia i Ginecologia, Hospital Universitari Clínic de Barcelona e-mail: roliva@ub.edu Fecha recepción: 16 abril 2010 Fecha aceptación: 18 abril 2010 LA TRANSICIÓN NUCLEOHISTONA- Mientras que la mayor parte del genoma organizados por protamina y en las NUCLEOPROTAMINA Y ORGANIZACIÓN DEL de espermatozoide (alrededor de 85- regiones genómicas organizadas por las DNA EN EL NÚCLEO DEL ESPERMATOZOIDE 95%) está fuertemente empaquetado en histonas no es al azar. Estudios recientes forma de estructuras toroidales, basados en el análisis del genoma La espermatogénesis es uno de los también es importante tener en cuenta paterno asociado a cada uno de estos procesos que conlleva cambios más que alrededor del 5-15% del DNA de los dominios mediante microarrays, han radicales en la estructura de la espermatozoides está organizado por permitido llegar a la conclusión básica cromatina hasta dar lugar al proteínas histonas, muchas de las cuales de que las regiones asociadas a espermatozoide maduro (Mezquita, son variantes específicas del nucleohistona se hallan asociadas con 1985; Oliva and Dixon, 1991). De forma espermatozoide (Fig. 1) (Gatewood et las regiones reguladoras de genes, lo progresiva primero se desensambla la al., 1987; Oliva, 2006; Balhorn, 2007). que implica la existencia de marcas estructura nucleosómica presente en las Se ha propuesto que las estructuras epigenéticas con una función potencial espermatogonias, espermatocitos y toroidales de la nucleoprotamina, cada en el desarrollo embrionario (Arpanahi espermátidas redondas, y es una con aproximadamente 50 kb de ADN, et al., 2009). En otro estudio reciente, reemplazada transitoriamente por las podrían estar ancladas a la matriz basado en secuenciación genómica proteínas de transición y por último por nuclear a través del DNA entre toroide y masiva, se ha detectado que las regiones las protaminas (Mezquita, 1985; Oliva toroide (Shaman et al., 2007). asociadas a nucleosomas están and Dixon, 1991; Oliva, 2006; Balhorn, Actualmente se sabe que la distribución significativamente enriquecidas en los 2007) (Fig. 1). de los genes en las regiones genómicas genes importantes para el desarrollo, incluidos los genes imprintados, los microRNAs, los genes Hox, y los promotores de la transcripción de genes del desarrollo y de factores de señalización (Hammoud et al., 2009). Además, se ha demostrado que las modificaciones de histonas (H3K4me2, H3K27me3) se localizan en determinados loci correspondientes con genes del desarrollo, y que los promotores asociados a genes del desarrollo se hallan hipometilados en el espermatozoide, pero son metilados durante la maduración (Hammoud et al., 2009). Además de estas marcas epigenéticas determinadas por la distribución diferencial de los genes en los dominios asociados a la nucleohistona y a la nucleoprotamina, hay otros tipos de Figura 1. Representación esquemática de los cambios de la cromatina que ocurren durante la información epigenética potencialmente espermatogénesis. El lado izquierdo de la figura representa los cambios celulares durante la transmitida por el núcleo del espermatogénesis y primeras fases del desarrollo embrionario. El lado derecho de esta figura representa espermatozoide. Una de las más los cambios de la cromatina que tienen lugar durante la transición nucleohistona a nucleoprotamina en la conocidas y contrastadas es la espermiogénesis y en las fases iniciales del desarrollo embrionario. Los cambios celulares en el lado izquierdo de esta figura corresponden aproximadamente a las estructuras de la cromatina y actividades metilación del DNA (Reik et al., 2001). indicadas en el lado derecho. Las histonas están representadas en color rojo y el DNA se marca como líneas Más recientemente, la identificación de azules. Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones. los RNAs presentes en el espermatozoide
  • 8. A C T U A L I D A D Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano. 6 y la demostración de su transferencia al al., 2008; 2009). Una cuestión crucial es los precursores de protamina en un oocito abren la posibilidad de un papel si estos factores de transcripción y las subconjunto de los pacientes (de Yebra de éstos en la fecundación (Ostenmeyer proteínas recientemente identificados et al., 1998; Bench et al., 1998). Además et al., 2004). Otra fuente de información en los núcleos representan vestigios del de estos estudios en pacientes epigenética potencial podría ser la proceso de la espermatogénesis o bien subfértiles, la expresión de protaminas presencia de otras proteínas en el núcleo están marcando algunas regiones del también se ha estudiado en respuesta al del espermatozoide, además de las genoma paterno y poseen una función estrés térmico y se ha descrito que histonas y de las protaminas (Oliva et epigenética (Oliva et al., 2008; 2009; episodios de fiebre alta se correlacionan al., 2009). Rousseaux et al., 2008). con la aparición de precursores de protamina P2 y con un aumento en la La primera evidencia de la presencia de Anomalías en el contenido de protamina proporción de las histonas entre los 33 y proteínas en el espermatozoide que en pacientes subfértiles fueron ya 39 días después de la hipertermia podían resultar cruciales para el descritas hace más de 20 años (Balhorn (Evenson et al., 2000). desarrollo del embrión fue el hallazgo de et al., 1988). Posteriormente, otros que en los seres humanos y en la mayoría estudios confirmaron la relación entre Los resultados del contenido de de los mamíferos (con la excepción del un contenido anormal de protaminas y protaminas y de histonas se han ratón), el centrosoma se hereda de alteraciones en los parámetros correlacionado con alteraciones en la forma paterna (Chatzimeletiou et al., seminales en estos pacientes infértiles integridad del DNA y con los resultados 2008). También se ha demostrado que (de Yebra et al., 1993; Mengual et al., de reproducción asistida (Bizarro et al., variantes de histonas presentes en el 2003; Aoki et al., 2005). Una de las 1998; Nasr-Esfahani et al., 2005; Aoki et espermatozoide contribuyen a la causas potenciales de alteraciones en la al., 2006; Torregrosa et al., 2006; formación de la cromatina cigótica en relación de protaminas (P1/P2) puede Domínguez-Fandos et al., 2007; de humanos y que los procesos encontrarse en un procesamiento Mateo et al., 2008; Aitken and de Yuliis epigenéticos, implementados durante la anormal de protamina 2 e incremento de et al., 2010). espermatogénesis, permiten distinguir el pronúcleo paterno en el embrión (van der Heijden et al., 2008; de Mateo et al., 2010). Diversas proteínas adicionales presentes en los espermatozoides podrían estar también relacionadas con el desarrollo embrionario (Martínez- Heredia et al., 2006; de Mateo et al., 2007). Más recientemente, el análisis proteómico de las proteínas identificadas en los espermatozoides maduros ha proporcionado algunos resultados inesperados. Por ejemplo, hay factores de transcripción, proteínas de unión al DNA y proteínas implicadas en el metabolismo de la cromatina en células que son transcripcionalmente inactivas (Oliva et al., 2008; 2009). Los catálogos correspondientes a los proteomas de espermatozoide humano ya están disponibles (Martínez-Heredia et al., 2006; Baker et al., 2007; Oliva et al., 2009). Es notable la presencia Figura 2. Estrategias disponibles para el estudio del proteoma del espermatozoide. de proteínas como la histona La extracción típica de protaminas a partir de espermatozoides consistente en la reducción de los puentes acetiltransferasa y deacetilasa, histona disulfuro de las protaminas con ditiotritol (DTT) / hidrocloruro de guanidina, seguido de la extracción con metiltransferasa, metiltransferasa del 0,5 M HCl, precipitación y purificación de las proteínas y su separación mediante electroforesis en gel de ADN, la topoisomerasa, helicasa, factores poliacrilamida ácido (izquierda). Con esta estrategia es posible visualizar las proteínas nucleares mayoritarias: una banda proteica prominente correspondiente a la protamina 1 (P1) y un conjunto de de transcripción, zinc fingers, proteínas bandas correspondiente a la familia de la protamina 2 (P2). Para analizar el proteoma total es posible homeobox, proteínas cromodominio, recurrir a la electroforesis bidimensional de las proteínas del espermatozoide. Para ello se suele recurrir a proteínas centrosómicas, y la telomerasa una primera dimensión a través de isoelectroenfoque, separando las proteínas atendiendo a su punto en las células que son isoeléctrico (pI), seguido de una segunda dimensión a través de electroforesis en gel de poliacrilamida – SDS, que separa a las proteínas por su peso molecular aparente. La identificación de las proteínas se realiza transcripcionalmente inertes y que entonces a través de espectrometría de masas. Una última estrategia mucho más robusta consiste en la tienen al menos el 85% de su DNA generación inicial de péptidos, seguida de su separación mediante cromatografía líquida e identificación empaquetado por protaminas (Oliva et mediante espectrometría de masas (derecha). Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.
  • 9. A C T U A L I D A D Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 7 Identificación de proteínas del muestras distintas. Un método es el 2D- implicados, como resultar de utilidad en espermatozoide y de sus alteraciones a DIGE que se basa en el marcado el diagnóstico, pronóstico, y desarrollo través de técnicas proteómicas. diferencial utilizando fluorocromos de de nuevas estrategias terapéuticas. las proteínas extraídas del control (por Esencialmente se han utilizado dos ejemplo con verde) y de las células AGRADECIMIENTOS alternativas diferentes para el estudio experimentales (por ejemplo con rojo). proteómico de los espermatozoides a Esto es seguido de su mezcla y Subvencionado en parte gracias al través de espectrometría de masas (MS): separación en la misma 2D, lo que proyecto del Ministerio de Ciencia y 1) electroforesis bidimensional (2D) permite detectar las proteínas Tecnología (BFU2009-07118), Fondos seguida de la identificación por MALDI- aumentadas o disminuidas observando FEDER a R.O. MS o cromatografía líquida LC-MS/MS, y la desviación de la fluorescencia hacia 2) la digestión inicial de proteínas para uno de los fluorocromos (Baker et al., REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS generar péptidos, seguido por su 2005; Oliva et al. ,2008). Otra separación y análisis LC-MS/MS (Oliva et alternativa es la cuantificación y Aitken RJ, De Iuliis GN. On the possible al., 2009; Baker and Aitken et al., 2009). comparación de la abundancia relativa origins of DNA damage in human La primera alternativa implica de las distintas proteínas en geles spermatozoa. Mol Hum Reprod. 2010;16:3-13. generalmente la separación de las independientes. Estrategias más proteínas utilizando isoelectroenfoque y recientes desarrolladas se basan en el Aoki VW, Emery BR, Liu L, Carrell DT. es seguida por una electroforesis en gel marcado isotópico no radioactivo de las Protamine levels vary between individual de poliacrilamida en presencia de SDS muestras problema y control (Baker et sperm cells of infertile human males and (SDS-PAGE) para separar las proteínas al., 2009; Oliva et al., 2009). correlate with viability and DNA integrity. J en una segunda dimensión en función de Androl. 2006;27:890-898. su peso molecular (Fig. 2). La primera descripción del potencial de análisis proteómico 2D en el estudio de Aoki VW, Liu L, Carrell DT. Identification and Esta alternativa ha sido ampliamente defectos en espermatozoides se realizó evaluation of a novel sperm protamine utilizada en el pasado, permitiendo en un paciente con un fallo reiterado de abnormality in a population of infertile identificar muchas proteínas presentes fecundación en técnicas de fecundación males. Hum Reprod. 2005;20:1298-1306. en el espermatozoide (Com et al., 2003; in vitro (Pixton et al., 2004). El Pixton et al., 2004; Martínez-Heredia et proteoma de este paciente mostró 20 Arpanahi A, Brinkworth M, Iles D, et al. al., 2006; 2009). Pero de las dos diferencias en comparación con los Endonuclease-sensitive regions of human alternativas, la capacidad de análisis de controles y se consiguió identificar spermatozoal chromatin are highly enriched la generación inicial de péptidos y su varias proteínas diferenciales. in promoter and CTCF binding sequences. análisis mediante LC-MS/MS es muy Posteriormente se ha conseguido Genome Res. 2009;19:1338-1349. superior. Por ejemplo, a través de 2D y identificar proteínas diferenciales en MALDI-TOF o LC-MS/MS es posible pacientes astenozoospérmicos, Baker MA, Aitken, RJ. Proteomic insights identificar hasta unos pocos cientos de oligozoospérmicos y en pacientes con into spermatozoa: critiques, comments and proteínas (de Mateo et al., 2007; alteraciones en el contenido de concerns. Expert Rev Proteom. 2009; 6:691- Martínez-Heredia et al., 2008), mientras protaminas o en la integridad del DNA 705. que con la generación inicial de péptidos (Baker et al., 2005; de Mateo et al., seguido de LC-MS/MS es posible llegar a 2007; Oliva, 2007; Martínez-Heredia et Baker MA, Reeves G, Hetherington L, Muller identificar hasta alrededor de 1000 al., 2009; Botta et al., 2009; Siva et al., J, Baur I, Aitken RJ. Identification of gene proteínas diferentes (Baker et al., 2007; 2010). La proteómica se ha aplicado products present in Triton X-100 soluble and Oliva et al., 2009). también al estudio de los antígenos insoluble fractions of human spermatozoa inmunogénicos presentes en los lysates using LC-MS/MS analysis. Proteomics Actualmente el catálogo más amplio de espermatozoides, tanto con el fin de Clin Appl. 2007; 1:524-532. las proteínas presentes en el comprender la esterilidad inmunológica espermatozoide humano se ha como para identificar posibles Baker MA, Witherdin R, Hetherington L, conseguido a través de LC-MS/MS con candidatos inmuno-anticonceptivos Cunningham-Smith K, Aitken RJ. 1056 productos génicos identificados y (Oliva et al. ,2009). Identification of post-translational es complementario al obtenido modifications that occur during sperm mediante 2D e identificación de las La aplicación de las técnicas de maturation using difference in two- proteínas (de Mateo et al., 2007; Baker proteómica en andrología y en biología dimensional gel electrophoresis. Proteomics. et al., 2007; Oliva et al., 2009). Además reproductiva se halla en sus inicios, pero 2005; 5:1003-1012. de la generación de catálogos de las los datos disponibles hasta la fecha ya proteínas, la proteómica se ha aplicado indican su enorme potencial. Es Balhorn R, Reed S, Tanphaichitr N. Aberrant también a la identificación de la previsible que en un futuro permitan una protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of presencia de anomalías en pacientes disección molecular de las distintas infertile human males. Experientia. 1988; estériles. Existen diversas estrategias causas de esterilidad masculina, 44:52-55. para analizar el contenido diferencial de permitiendo tanto la identificación de proteínas presentes en dos o más los mecanismos fisiopatogénicos Balhorn R. The protamine family of sperm
  • 10. A C T U A L I D A D Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano. 8 nuclear proteins. Genome Biol. 2007; 8:227. Evenson DP, Jost LK, Corzett M, Balhorn R. Oliva R, Martinez-Heredia J, Estanyol JM. Characteristics of human sperm chromatin Proteomics in the study of the sperm cell Bench G, Corzett MH, De Yebra L, Oliva R, structure following an episode of influenza composition, differentiation and function. Balhorn R. Protein and DNA contents in and high fever: a case study. J Androl. 2000; Syst Biol Reprod Med. 2008; 54:23-36. sperm from an infertile human male 21:739-746. possessing protamine defects that vary over Oliva R, de Mateo S, Estanyol JM. Sperm cell time. Mol Reprod Dev. 1998; 50:345-353. Gatewood JM, Cook GR, Balhorn R, Bradbury proteomics. Proteomics. 2009; 9:1004-1017. EM, Schmid CW. Sequence-specific Bizarro D, Manicardi GC, Bianchi PG, Bianchi packaging of DNA in human sperm Oliva R, de Mateo S, Ballescà JL (2009) U, Mariethoz E, Sakkas D. In-situ chromatin. Science. 1987; 236:962-964. Proteomics in Andrology. In: Papers competition between protamine and contribueted to the 9th International fluorochromes for sperm DNA. Mol Hum Hammoud SS, Nix DA, Zhang H, Purwar J, Congress of Andrology (Ballescà Jl, Oliva R, Reprod 1998; 4:127-132. Carrell DT, Cairns BR. Distinctive chromatin Eds.), Medimond International Proceedings. in human sperm packages genes for Bologna. Pp 60-69. Botta T, Blescia S, Martínez J, Lafuente R, embryo development. Nature. 2009; Brassesco M, Ballescà JL y Oliva R. 460(7254):473-478. Ostermeier GC, Miller D, Huntriss JD, Identificación de diferencias proteómicas Diamond MP, Krawetz SA. Reproductive en muestras oligozoospérmicas. Rev Int Martinez-Heredia J, de Mateo S, Vidal- biology: delivering spermatozoan RNA to Androl. 2009; 7:14-9. Taboada JM, Ballesca JL, Oliva R. the oocyte. Nature. 2004; 429:154. Identification of proteomic differences in Chatzimeletiou K, Morrison EE, Prapas N, asthenozoospermic sperm samples. Hum Pixton KL, Deeks ED, Flesch FM, Moseley FL, Prapas Y, Handyside AH. The centrosome and Reprod. 2009; 23:783-791. Bjorndahl L, Ashton PR, Barratt CL, Brewis early embryogenesis: clinical insights. IA. Sperm proteome mapping of a patient Reprod Biomed Online. 2008; 16:485-491. Martinez-Heredia J, Estanyol JM, Ballesca who experienced failed fertilization at IVF JL, Oliva R. Proteomic identification of reveals altered expression of at least 20 Com E, Evrard B, Roepstorff P, Aubry F, human sperm proteins. Proteomics. 2006; proteins compared with fertile donors: case Pineau C. New insights into the rat 6:4356-4369. report. Hum Reprod. 2004; 19:1438-1r447. spermatogonial proteome: identification of 156 additional proteins. Mol Cell Proteom. Mengual L, Ballesca JL, Ascaso C, Oliva R. Reik W, Dean W, Walter J. Epigenetic 2003; 2:248-261. 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Fertil Suppl. 2007; 65:527-30.
  • 11. A C T U A L I D A D Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 9 METABOLÓMICA Y REPRODUCCIÓN HUMANA Imma Sánchez Ribas12, Francisco Domínguez2, Carlos Simon3. 1 IVI Barcelona, Fundación IVI, Embryomics, 2Embryomics, 3 IVI Valencia, Fundación IVI INTRODUCCIÓN análisis cualitativo y cuantitativo de Sin embargo, con las -Ómicas tenemos proteínas y metabolitos, respectivamente, una situación de acercamiento Uno de los mayores retos en el campo de en una célula, un organismo o una inductivo, donde no hay una hipótesis la reproducción humana es la selección muestra bajo distintas condiciones, con la real, y la estrategia es generar esta de los embriones más apropiados a finalidad de obtener un perfil hipótesis desde los datos obtenidos, transferir. Hasta la fecha, en los ciclos comprensible de todas las proteínas y provocando un descubrimiento del de Fecundación In Vitro, la evaluación metabolitos de esa célula, organismo o conocimiento y pudiendo a posteriori morfológica sigue siendo el método de muestra. Los metabolitos de bajo peso testar estas nuevas hipótesis de la forma asesoramiento utilizado para escoger el molecular representan el producto final tradicional. El diseño experimental es mejor embrión o blastocisto, pero este de procesos de regulación celular, y por lo muy importante en el acercamiento método de selección es altamente tanto revela la respuesta de los sistemas inductivo, porque determinará qué subjetivo y su modesto poder predictivo biológicos a una variedad de influencias experimentos nos van a dar la y la variabilidad inter- e intra- genéticas, nutricionales y ambientales información que estamos buscando. La observador limita su valor. (Singh and Sinclair, 2007) estrategia en la que un algoritmo elige qué experimentos hacer es conocida Además, seleccionar el mejor embrión a Aunque la metabolómica es obviamente como “aprendizaje activo” y es la transferir no sólo significa escoger el complementaria a la genómica y estrategia de elección. Para ello embrión que nos va a dar más proteómica, tiene ventajas especiales. debemos contar con sistemas posibilidades de embarazo, sino que La tabla número 1 recoge las ventajas informáticos de alta complejidad también es crucial escoger aquel del estudio del metaboloma en (Waidyanathan, 2003; Goodacre, 2004) embrión que nos va a aumentar la tasa comparación con el del transcriptoma y de recién nacido vivo en casa. el proteoma (Dunn and Ellis, 2003). ¿QUÉ ES LA METABOLÓMICA? Actualmente, lo más novedoso en el CAMBIO EN LAS ESTRATEGIAS DE Existe un debate activo en la comunidad estudio de la embriogénesis son las GENERACION DE HIPÓTESIS científica sobre la definición exacta de técnicas -Ómicas. Son disciplinas que metaboloma. Fue definido por primera vez estudian los eventos e interacciones de las Las -Ómicas están transformando el por Oliver y cols. (1988) como el estructuras celulares y sus procesos, desde método de investigación. El obtener tal complemento cuantitativo de todas las el DNA hasta la función biológica; es decir, grado de información ha implicado un moléculas de bajo peso molecular que se desde los genes hasta los metabolitos. cambio en el ciclo del conocimiento. En el encuentran en las células en un estado Todos los procesos que contribuyen en el ciclo del conocimiento tradicional, el fisiológico particular o de desarrollo. Otra definición sustenta que el metaboloma consiste en sólo aquellas moléculas pequeñas y nativas que están participando en reacciones metabólicas generales y que son requeridas para el mantenimiento, crecimiento y funcionamiento de la célula (Beecher et al., 2003). En términos generales, por metabolómica (Nicholson et al., 1999; Fiehn et al., 2002) se entiende la obtención, de una manera simultánea y global, de perfiles correspondientes a múltiples concentraciones de metabolitos y de sus fluctuaciones fenotipo pasan a través de este complejo conocimiento previo se utilizaba para sistémicas y celulares en respuesta a sistema, y la Genómica, Transcriptómica, construir una hipótesis para ser testada fármacos, dieta, genética, estilo de vida, Proteómica y Metabolómica intentan experimentalmente. El experimento entorno y estímulos, de forma que sea comprender cómo un embrión crece y producía datos que daban consistencia o posible caracterizar los efectos adversos cuáles son sus indicadores de éxito. no a la hipótesis inicial. Es decir, la y beneficiosos de esas interacciones. hipótesis era el punto de partida. El Las tecnologías proteómica y acercamiento, por tanto, era hipotético- La metabolómica busca una descripción metabolómica han desarrollado el deductivo. analítica de muestras biológicas
  • 12. A C T U A L I D A D Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana. 10 complejas, e intenta caracterizar y De todas ellas, las tecnologías más biológico o clínico y explicar los cuantificar todas las moléculas empleadas para el análisis mecanismos bioquímicos relacionados pequeñas de ese tipo de muestras. Sin metabolómico son la espectrometría de con los cambios observados, y así embargo, medir el metaboloma es un masas, que generalmente incluye un ampliar el conocimiento existente. reto analítico considerable. Esto es paso de separación cromatográfica, y la debido a la naturaleza lábil de los espectroscopia de RMN, dado que ambas ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM O MS) Y metabolitos, el rango ampliamente plataformas proporcionan una amplia RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) dinámico y diverso de muchos de ellos, información estructural y la complejidad química y heterogénea de conformacional sobre múltiples clases Tanto la EM como la RMN se emplean de los mismos, la falta de técnicas químicas en un procedimiento analítico forma rutinaria en los estudios analíticas automatizadas que puedan único. Las dos técnicas poseen metabolómicos. medir cuantitativamente un gran diferentes ventajas y desventajas desde número de metabolitos de estructura el punto de vista técnico, y suelen La EM es una herramienta de análisis desconocida, el rendimiento de las ofrecer información complementaria metabólomico muy poderosa, ya que mediciones y la naturaleza elaborada de (Lenz et al., 2007). Ambos métodos provee una única mezcla de sensibilidad, los protocolos de extracción (Whitfield proporcionan información sobre un rapidez, calidad y análisis potencialmente et al., 2004). amplio conjunto de metabolitos, sin tener cuantitativo de una gran cantidad de que preseleccionar qué analitos deben ser metabolitos. Puede ser usada sola o en PLATAFORMAS DE ANÁLISIS detectados. Esto nos permite diseñar combinación con otras técnicas de experimentos basados en el cromatografía. Los análisis de EM Todos estos desafíos deben ser razonamiento inductivo para generar requieren una preparación exhaustiva de abordados por la plataforma de análisis nuevas hipótesis, siendo una vía la muestra y una extracción de la misma empleados. Las plataformas para las potencial de descubrimiento de utilizando solventes orgánicos que medidas del metaboloma deben ser conocimiento a través del holismo. pueden provocar la pérdida de algunos imparciales, sensibles y con una gran Además, los dos métodos pueden compuestos. capacidad de análisis de alto emplearse para identificar las estructuras rendimiento para discriminar un gran de los metabolitos, y para medir las La RMN es una técnica no destructiva, no número de metabolitos. A pesar del gran concentraciones relativas y absolutas. invasiva, y que no modifica el equilibrio éxito en el desarrollo de la tecnología biológico, y proporciona una información detallada sobre las Fig 1. estructuras moleculares en solución. Además la espectroscopia de RMN es una técnica muy fiable para las aplicaciones metabolómicas que requieren un alto grado de reproducibilidad. Ambas técnicas permiten la detección simultánea de un amplio rango de metabolitos estructuralmente diversos y la detección en bajas concentraciones de los mismos. metabolómica, aún no es posible OBJETIVOS DE LA METABOLÓMICA Es importante tener en cuenta que, sea analizar con una única plataforma cual sea el origen de las muestras, analítica la diversidad de metabolitos Todos los estudios metabolómicos dan deben evitarse fuentes potenciales de complejos. La Fig. 1 indica las distintas lugar a un conjunto de resultados artefactos durante el proceso de tecnologías para el análisis complejo, que requiere un software recogida de las muestras biológicas, con metabolómico de muestras, así como las específico para su visualización y el fin de obtener resultados que posean características más relevantes de las métodos quimiométricos y una buena calidad y fiabilidad. mismas. El tipo de muestras que se bioinformáticos para su interpretación. analiza mediante estas técnicas son El objetivo de estos experimentos es Análisis estadístico multivariable biofluidos como orina, plasma o suero generalmente el de obtener huellas previa precipitación de proteínas; bioquímicas que puedan ser útiles desde Los métodos de análisis estadístico metabolitos intracelulares de plantas, un punto de vista diagnóstico o de multivariable proporcionan un medio de microbios y animales, previa extracción clasificación, y, en un segundo lugar, el optimizar la extracción de la información mediante solventes polares y no polares; de identificar las sustancias que contenida en los espectros de EM y RMN tejidos sin previa o mínima preparación contribuyen a dicho diagnóstico o de mezclas complejas. Una vez realizados y huellas metabólicas en secreciones clasificación, ya que éstas conforman un todos los pasos anteriores, lo que se tiene naturales de metabolitos intracelulares conjunto complejo de biomarcadores es una serie (uno por muestra) de perfiles hacia el volumen extracelular. que puede ayudar a definir el contexto multivariable que representan un punto
  • 13. A C T U A L I D A D Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 11 en un espacio K-dimensional, y cuya emplea para revelar la estructura interna contienen módulos (B-Bioref-Code, posición (coordinadas) depende de los de un conjunto de datos sin que medie Bruker BioSpin) que permiten la valores de cada uno de los descriptores (o ningún tipo de conocimiento previo del identificación y asignación de metabolitos metabolitos) que describen el sistema (la sistema. PLS, sin embargo, es un método presentes en mezclas complejas. Hay que muestra). Cuando se trata de analizar una supervisado para regresión. En este tener en cuenta que las bibliotecas serie de perfiles, resulta muy útil la caso, el objetivo es predecir las metabolómicas no son completas, y que aplicación de lo que se denominan respuestas en un conjunto de datos. no todos los metabolitos hallados tienen métodos basados en la proyección. Los Empleando una barrera de corte, PLS posibilidad de identificación. métodos de proyección convierten tablas puede emplearse también para análisis de datos multidimensionales en modelos basados en la clasificación y ASESORAMIENTO METABOLÓMICO DE de dimensionalidad. Esto permite discriminación (PLS-DA, “Partial Least CALIDAD EMBRIONARIA detectar además agrupaciones y Squares-Discriminant Analysis”). tendencias, ya que puntos que se El metabolismo es intrínseco a la salud encuentran cercanos corresponden a Identificación de metabolitos del embrión, por lo que muchas perfiles multivariables relativamente investigaciones se han concentrado en similares. De forma opuesta, puntos que Dependiendo del tipo de análisis que se desarrollar marcadores metabólicos no se encuentran alejados unos de otros esté desarrollando, los estudios invasivos de capacidad de desarrollo, presentan descriptores muy diferentes. metabolómicos pueden requerir la como el consumo de oxígeno, reacciones identificación de los metabolitos REDOX, el consumo energético a través Un ejemplo de lo explicado podemos verlo presentes en las muestras biológicas de Na+, K+ y ATPasa o el turnover de en la Figura 2, donde puede apreciarse la analizadas. Este objetivo puede aminoácidos (Houghton et al., 2004). Fig 2. Las últimas investigaciones en las técnicas moleculares están definiendo perfiles génicos, proteicos y metabolómicos para intentar detectar cuál es el ovocito o embrión más hábil, entendiendo esta habilidad como su capacidad para implantar (Katz-Jaffe et al., 2006; Patricio et al., 2007; Brison et al., 2007; Seli et al., 2007) Actualmente se están desarrollando utilidad de esta herramienta para alcanzarse mediante la comparación entre técnicas cuantitativas para el comprender los patrones que subyacen los desplazamientos químicos obtenidos asesoramiento no invasivo del bajo la gran cantidad de información en los espectros de EM o RMN y aquellos metabolismo embrionario, y es el objetivo generada en los estudios metabolómicos. disponibles en bases de datos como la de investigaciones actuales el determinar Quedan patentes las relaciones entre las MMCD (Madison Metabolomics su valor como predictores de viabilidad distintas muestras, pudiendo describir Consortium Database) (Cui et al., 2008)) embrionaria y embarazo (Seli et al., 2007). agrupamientos, tendencias e influencias. o la HMDB (Human Metabolome DataBase) (Wishart et al., 2007). Seli y col. publicaron en 2007 el primer Aunque los métodos de proyección Alternativamente, existen programas estudio con un enfoque metabolómico descritos forman la base de los estudios (p.ej., “Analysis of MIXtures”, AMIX, para estudiar la viabilidad del embrión metabolómicos, los análisis estadísticos Bruker BioSpin) que permiten realizar humano. Ellos utilizaron como dependen del tipo de estudio que se esté todas las etapas descritas anteriormente plataforma metabolómica de análisis el desarrollando. Existe una gran variedad (selección de regiones de interés, Near-infrared and Raman spectroscopy, de métodos que pueden emplearse en el segmentación del espectro, para analizar y comparar el perfil análisis de datos metabolómicos. La normalización, análisis estadístico) y que metabolómico utilizando medios principal diferencia entre todos ellos es condicionados provenientes de si se dispone o no de información previa embriones que implantaron frente a los Fig 3. sobre la clasificación de muestras en que no implantaron. Aunque no clases distintas, o si se sospecha la encontraron marcadores específicos, si existencia de nuevas clases. Sin duda obtuvieron distintos espectros entre alguna, los métodos más empleados de ambos grupos, siendo posible diferenciar análisis multivariable son los fácilmente ambas poblaciones La Fig 3 denominados PCA (análisis de muestra los distintos espectros que componentes principales (Holmes, obtuvieron de los medios de cultivo 1998)) y PLS (mínimos cuadrados embrionario analizados de cada una de las parciales (Wold et al., 1984)). El PCA es muestras utilizadas en el estudio (Seli et un método no supervisado que se al., 2007).
  • 14. A C T U A L I D A D Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana. 12 El mismo grupo, en 2008, publica la Fig 4. identificación de marcadores de viabilidad utilizando análisis metabolómico mediante NMR, en un estudio retrospectivo realizado en 34 pacientes. Explican encontrar diferencias significativas en concentraciones de glutamato entre embriones procedentes de embarazos y/o partos y embriones procedentes de fallo de implantación (Seli et al., 2008). Otra aplicación de la metabolómica en el campo de la Reproducción Humana es el que estamos llevando en el Instituto Valenciano de Infertilidad, con el apoyo de la Fundación IVI. Nuestro objetivo muestras procedentes de embriones con R. Predicting human embryo viability: the road es desarrollar un diagnóstico diagnóstico de aneuploidías se concentran to non-invasive análisis of the secretome using preimplantacional no invasivo con la en un área distinta. metabolomic footprinting. Reproductive ayuda de estas nuevas tecnologías. BioMedicine Online 2007; 15. 296-302. Pretendemos encontrar un perfil DISCUSIÓN metabolómico embrionario que nos Cui Q et al. Metabolite identification via the permita discriminar los embriones El método de evaluación tradicional Madison Metabolomics Consortium Database. normales de los embriones aneuploides, embrionario tiene una capacidad limitada Nat Biotechnol 2008; 26: 162-164. utilizando el medio de cultivo donde para seleccionar embriones con desarrollo éstos se desarrollan. potencial. Hay una clara necesidad de Dunn W, Ellis D. Metabolomics : current mejora en nuestro trabajo diario; analytical platforms and methodologies. La instrumentación de análisis deberíamos ser capaces de aumentar las Trends in analytical chemistry 2005; 24: 285- metabolómico que estamos utilizando es tasas de gestación y disminuir el riesgo de 294. la Espectrometría de Masas asociada a gestación múltiple. Actualmente existen UPLC. El sistema de UPLC ha sido nuevas tecnologías en desarrollo para Fiehn O. Metabolomics – the link between diseñado para detectar partículas conseguir este objetivo, pudiendo ser genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol pequeñas (1,7 mm) y encontrar así tecnologías que utilicemos en un futuro 2002; 48: 155-71. perfiles de alta resolución. Por lo tanto, como herramientas útiles de selección este sistema es óptimo para el análisis embrionaria, así como tecnologías que Goodacre R, Vaidyanathan S, Dunn W, Harrigan de muestras de alta complejidad, como nos permitan expandir el conocimiento de G and Kell D. Metabolomics by numbers: nuestros medios de cultivo, debido al la fisiología embrionaria con el objetivo acquiring and understanding global alto poder de separación metabólica y de aumentar la eficacia de las Técnicas de metabolite data. Trends in Biotechnology resolución de picos. Reproducción Asistida. 2004; 22: 245-252. En los análisis llevados a cabo hasta la La capacidad de evaluar la producción y Holmes E, Nicholson J, Nicholls A, Lindon J, fecha, hemos observado que el perfil consumo metabolómico de un embrión Connor S, Polley S, Connelly J. The metabólico de los medios de cultivo individual nos llevaría a una mejor identification of novel biomarkers of renal de los embriones humanos parece comprensión de la función celular y toxicity using automatic data reduction discriminar entre embriones fisiología en etapas específicas de la techniques and PCA of proton NMR spectra of cromosómicamente normales y embriogénesis. Por otra parte, este urine Chemometrics and Intelligent anormales, aunque existen limitaciones enfoque nos ayudaría a mejorar los Laboratory Systems. 1998; 44: 245-255. debidas a la baja cantidad de medios de cultivo de embriones y metabolitos presentes en las muestras. podríamos identificar las interacciones Houghton F, Leese H. Metabolism and entre los embriones y el epitelio uterino developmental competence of the La Fig 4 es un score-plot donde cada punto materno antes de la implantación. preimplantational embryo. Europ Jour of Obst representa un medio de cultivo Gyn Reprod Bio 2004.115S. S92-S96. embrionario, lo que nos permite apreciar REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS la relación que hay entre las muestras. La Johnson HE, Broadhurst D, Goodacre R, Smith tendencia observada es que muestras Beecher,CWW. The human metabolome. In AR. Metabolic fingerprinting of salt-stressed procedentes de embriones diagnosticados metabolic profiling: its role in biomarker tomatoes. Phytochemistry 2003; 62: 919-28. normales mediante diagnóstico discovery and gene function analysis, 2003. preimplantacional para screening de pp. 311-319. Katz-Jaffe M, Gardner D, Schoolcraft W. aneuploidías (PGD-AS) se concentran en Proteomic analysis of individual human un área del diagrama de coordenadas, y Brison DR, Hollywood K, Arnesen R, Goodacre embryos to identify novel biomarkers of
  • 15. A C T U A L I D A D Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 13 development and viability. Fertility and Scott R, Seli E, Miller K, Sakkas D, Scott K, Burns Urbanczyk-Wochniak E, Luedemann A, Kopka Sterility 2006;1. D. Noninvasive metabolomic profiling of J, Selbig J, Roessner-Tunali U, Willmitzer L, embryo culture media using Raman Fernie AR. Parallel analysis of transcript and Kell D et al. (1999). Technological and medical spectroscopy predicts embryomic reproductive metabolic profile. EMBO Rep 2003; 4: 989- implications of metabolic control analysis. potential: a prospective blinded pilot study. 992. Kluwr Academic Publishers, London, p3. Fertyl Steril 2008; 90: 77-83. Waidyanathan S. et al. Explanatory Lenz EM, Wilson ID. Analytical Strategies in Seli E, Sacas D, Scott C, Kwok S, Rosendahl S, optimisation of protein mass spectrometry via Metabonomics. J Proteome Res 2007; 6: 443-458. Burns D. Non invasive metabolomis proflling genetic search. Anal.Chem 2003; 75. of embryo culture media using Raman and Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E. near-infraread spectroscopy correlates with Whitfield PD, German A and Noble P. ‘Metabonomics’: understanding the metabolic reproductive potencial of embryos in women Metabolomics: and emerging post-genomic responses of living system to pathophysiological undergoing in vitro fertilization.Fertyl Steril tool for nutrition. British Journal of Nutrition. stimuli via multivariate statistical analysis of 2007; 88: 1350–7. 2004; 92: 549-555 . biological NMR spectroscopic data. Xenobiotica 1999; 29: 1181-9. Seli E, Botros L, Sakkas D, and Burns DH. Wishart DS, et al. HMDB: the Human Noninvasive metabolomic profiling of embryo Metabolome Database. Nucleic Acids Res. Oliver SG et al. Systematic functional analysis culture media using proton nuclear magnetic 2007; 35. D521-D526. of de yeast genome. Trends biotechnol 1988; resonance correlates with reproductive potential 16: 373-378 of embryos in women undergoing in vitro Wold S, et al. The Collinearity Problem in fertilization. Fertil Steril 2008; 90: 2183-89. Linear Regression. The Partial Least Squares Patricio P, Fragouli E, Bianchi V, Borini A, Wells (PLS) Approach to Generalized Inverses J Sci D. Molecular methods for selection of the ideal Singh R, Sinclair K. Metabolomics: approache Stat Comput 1984; 5: 735-743. oocyte. Reproductive BioMedicine Online to assessing oocyte and embryo quality, 2007; 15: 346-353. Theriogenology 2007, doi:10.1016.
  • 16. A R T Í C U L O I 14 EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II EFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOME CONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2 1 Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER), Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia. *Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia. e-mail: cristinacostana@hotmail.com Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010 RESUMEN El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre la integridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del huso meiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. La tasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuración normal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica de vitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):14-17. Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica. ABSTRACT The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle and chromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh (control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. The proportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytes showing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010; 15(1):14-17. Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration INTRODUCCIÓN la sincronización donante-receptora en Los microtúbulos, que conforman el ciclos de donación de ovocitos o, huso meiótico, y los microfilamentos, La criopreservación de ovocitos permite simplemente, en mujeres fértiles que localizados en el córtex ovocitario, son preservar la fertilidad en pacientes que deseen posponer la maternidad. muy susceptibles a la temperatura de por diversas etiologías pueden enfriamiento (chilling) y a la exposición desarrollar un Fallo Ovárico Prematuro La criopreservación ovocitaria utilizando a los crioprotectores (Boiso et al., (FOP). Es el caso de exposición a agentes la técnica de congelación convencional se 2002). Una alteración en estas quimio/radioterápicos, enfermedades considera un procedimiento estructuras podría conducir a una autoinmunes o hematológicas, o experimental, debido a las bajas tasas de alineación cromosómica incorrecta procesos quirúrgicos potencialmente supervivencia y gestación y al limitado previa a la extrusión del corpúsculo esterilizantes. La criopreservación número de recién nacidos logrado (ASRM, polar, a una segregación cromosómica ovocitaria puede emplearse también 2006). Los protocolos de alterada, fecundación anómala y/o a una para evitar la criopreservación de congelación/descongelación elevada incidencia de aneuploidías. embriones, para rescatar ciclos convencionales conllevan una reducción complicados con un síndrome de lenta de la temperatura en el tiempo, La vitrificación combina tasas de hiperestimulación ovárica o con resultando en el daño de estructuras enfriamiento del orden de -15.000º C a - ausencia de muestra seminal el día de la vitales de los ovocitos. 30.000º C por minuto (Liebermann et al., punción-aspiración folicular, para evitar 2003) y concentraciones elevadas de
  • 17. A R T Í C U L O I Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 15 crioprotectores, aumentando de tal hiperestimulación ovárica controlada compuestas por medio 199 con manera su viscosidad que no cristaliza que incluyó, como frenado hipofisario, concentraciones decrecientes de sino que forma un estado amorfo similar agonistas de la GnRH en protocolo largo sacarosa (1.0M y 0.5M). al vidrio. y como estimulación FSH recombinante. Los ovocitos se recuperaron por punción La supervivencia ovocitaria se evaluó La técnica de vitrificación permite burlar transvaginal ecoguiada, 36-38 horas inmediatamente tras la desvitrificación dos de los factores que limitan el éxito tras la administración de la hCG. Los y tras 4 horas de cultivo in vitro, de la criopreservación: por un lado, el complejos cúmulo-ovocito fueron valorándose la integridad de la zona proceso conocido como chilling injury cultivados en medio IVF (Universal IVF pelúcida, la apariencia del citoplasma y (Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro, Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark) la ausencia de lisis celular. la formación de cristales de hielo en el bajo condiciones de cultivo estándar interior de las células (Mazur, 1984). El (37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2 Fijación y tinción inmunocitoquímica: primero se define como el daño horas de cultivo in vitro, los ovocitos irreversible tras la exposición de las fueron incubados con 80 IU/mL La fijación de los ovocitos y tinción células a bajas temperaturas (de + 15º C hialuronidasa (Hyadase, Medicult, inmunocitoquímica del huso meiótico se a -5º C) antes de que se produzca la Jyllinge, Denmark) y las células del realizó siguiendo el protocolo descrito enucleación del hielo. En consecuencia, cúmulo fueron eliminadas mediante el por Lin et al. (2008). estructuras celulares como el pipeteado mecánico de los ovocitos. Los citoesqueleto o las membranas celulares ovocitos fueron entonces observados Brevemente, los ovocitos MII se ven claramente afectadas. El utilizando un microscopio invertido desvitrificados y frescos (grupo control) fenómeno del chilling puede minimizarse (x200) y los ovocitos MII se identificaron fueron fijados a 37ºC durante 1 hora en durante el proceso de vitrificación por la presencia del primer corpúsculo una solución de formaldehído al 2% y mediante el empleo de tasas de polar. permeabilizados en una solución de enfriamiento elevadas (Liebermann et Tritón X-100 al 0.5% durante 30 al., 2003). La velocidad de enfriamiento Se vitrificaron un total de 12 ovocitos en minutos a temperatura ambiente. Para de la muestra va a depender del volumen estadio de MII recuperados de pacientes la tinción de la tubulina, los ovocitos se de la solución de vitrificación, así, a incluidas en el Programa de Fecundación incubaron durante 90 minutos a 37ºC en menor volumen, mayor velocidad de in vitro del Instituto de Medicina una solución de anticuerpos primarios enfriamiento, aumentando ésta Reproductiva (IMER) de Valencia que anti-α y anti-β tubulina (1/400), seguido mediante la inmersión directa en firmaron el correspondiente de 3 lavados y se incubaron durante 120 nitrógeno líquido. Para evitar la consentimiento informado. Como grupo minutos a 37ºC en una solución de formación de cristales de hielo, en la control (ovocitos MII no vitrificados), se anticuerpo secundario Alexa 488 técnica de vitrificación se emplean incluyeron 6 ovocitos procedentes de (1/200). Para la tinción de elevadas concentraciones de pacientes pertenecientes al Programa de microfilamentos, los ovocitos se crioprotectores (Liebermann et al., Fecundación in vitro de la Unidad de incubaron en una solución de rodamina- 2003), sin olvidar su efecto tóxico para Reproducción del Hospital Universitario faloidina durante 60 minutos a las células. Sin embargo, una la Fe de Valencia, previa firma del temperatura ambiente. Finalmente, los composición adecuada de consentimiento de participación en un ovocitos fueron montados utilizando crioprotectores puede solventar los Proyecto de Investigación desarrollado en medio de montaje con DAPI y efectos tóxicos y osmóticos debidos a la el Centro de Investigación Príncipe Felipe mantenidos a 4ºC hasta su evaluación. alta concentración de crioprotectores en (CIPF) de Valencia y con licencia por parte la solución de vitrificación. La mezcla de del Instituto de Salud Carlos III. Evaluación del huso meiótico: crioprotectores más utilizada es la formada por etilenglicol (EG), Protocolo de vitrificación: Para la valoración de los microtúbulos, dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa. microfilamentos y cromosomas, se Para la vitrificación ovocitaria se utilizó utilizó un microscopio confocal con El objetivo de este estudio fue evaluar el el kit comercial de Irvine Scientific con lasser-scanning (Leica DM IRE 2) efecto de la criopreservación ovocitaria el Cryotip™ como contenedor. Los equipado con un láser de argón, mediante la técnica de vitrificación con ovocitos fueron equilibrados en una perteneciente al Servicio de Microscopía un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la solución compuesta por 7.5 % (v/v) de Confocal del CIPF de Valencia. integridad del huso meiótico y la DMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20% organización cromosómica en ovocitos suplemento sustitutivo de suero en RESULTADOS humanos Metafase II (MII). medio 199. Posteriormente, fueron expuestos a la solución de vitrificación Se vitrificaron y desvitrificaron 12 MATERIAL Y MÉTODOS compuesta por 15 % (v/v) de DMSO + ovocitos MII. La tasa de supervivencia 15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa + fue del 91,6% (11/12). Todos los Ovocitos MII: 20% suplemento sustitutivo de suero en ovocitos que sobrevivieron a la medio 199 y cargados en el Cryotip™. desvitrificación mostraron una A todas las pacientes que formaron parte Para la desvitrificación, los ovocitos apariencia morfológica normal tras 4 del estudio se les aplicó un protocolo de fueron expuestos a soluciones horas de cultivo in vitro.
  • 18. A R T Í C U L O I Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico. 16 Se fijaron para tinción correcta segregación cromosómica y AGRADECIMIENTOS inmunocitoquímica 10 ovocitos MII evitar así la posible aparición de desvitrificados y 6 ovocitos MII frescos. aneuploidías en el embrión. Aunque sólo Este estudio ha sido parcialmente La tasa de ovocitos informativos fue del se observaron anomalías en el huso financiado por el Programa de Medicina 100% para el grupo control y del 70% meiótico/cromosomas en el grupo Regenerativa del Instituto de Salud para los ovocitos desvitrificados. Esta de ovocitos desvitrificados, las Carlos III. menor tasa de informatividad para diferencias no fueron estadísticamente ovocitos desvitrificados fue debida a significativas respecto al grupo control REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS problemas acontecidos durante la (frescos). Estos resultados son similares tinción, con independencia de la técnica a los descritos en la bibliografía (Li et Boiso I, Martí M, Santaló J. A confocal de vitrificación. al., 2006; Cobo et al., 2008). microscopy analysis of the spindle and chromosome configurations of human En función de la orientación del La vitrificación utilizando el Cryotip™ oocytes cryopreserved at the germinal complejo huso/cromosomas respecto al como contenedor permite la vitrificación vesicle and metaphase II stage. Human plano focal, se consideró una de ovocitos en microvolúmenes (alrededor Reprod 2002; 17: 1885-1891. configuración normal si: a) cuando al de 1 μL), incrementando la tasa de estar orientado de forma paralela al enfriamiento y minimizando el efecto Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui plano focal el huso presenta una tóxico de los crioprotectores al disminuir J, Domingo J, Remohí J. Effect of different estructura típica en forma de barril con su concentración. El mantenimiento de la cryopreservation protocols on the los polos ligeramente señalados y los integridad del huso meiótico y de la placa metaphase II spindle in human oocytes. cromosomas dispuestos en el ecuador, metafásica tras la desvitrificación sugiere Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359. b) cuando al estar orientado de forma que dicha técnica de vitrificación permite perpendicular al plano focal el huso preservar la calidad inicial del ovocito y el Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y, presenta una estructura circular con los potencial necesario para soportar el Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocal cromosomas orientados en forma de posterior desarrollo embrionario. microscopic analysis of the spindle and círculo y c) cuando al estar orientado de forma oblicua al plano focal el huso presenta una estructura en forma oval (barril acortado) con los cromosomas alineados en el ecuador. Por otro lado, una configuración anómala del complejo huso/cromosomas quedó representada por una desorganización parcial o completa de los microtúbulos o por una dispersión cromosómica o apariencia cromosómica aberrante o poco condensada. En las Figuras 1 y 2 se muestran una configuración normal y una anómala del complejo huso/cromosomas, respectivamente. La proporción de ovocitos con una Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica. configuración normal del huso meiótico y una alineación correcta de los cromosomas fue del 100% para los ovocitos del grupo control y de 85,7% para los ovocitos desvitrificados, sin que se observaran diferencias significativas entre ambos grupos. DISCUSIÓN En este trabajo se evalúa el efecto de la técnica de vitrificación con un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la configuración del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en estadio de MII. La integridad de este complejo es imprescindible para que se produzca una Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.
  • 19. A R T Í C U L O I Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1 17 chromosome configurations of human Committee of the Society for Assisted oocytes matured in vitro. Fertil Steril 2006; Reproductive Technology. Ovarian tissue 85 (4): 827-832. and oocyte cryopreservation. Fertil Steril 2006; 86: S142-7. Liebermann J, Dietl J, Vanderzwalmen P, Tucker MJ. Recent developments in human Vatja G, Kuwayama M. Improving oocyte, embryo and blastocyst vitrification: cryopreservation systems. Theriogenol where are we now? Reprod Biomed Online 2006; 65: 236-244. 2003; 7: 623-633. Lin T, Tsay C, Chen C, Tang P, Ju J. Nuclear and cytoskeletal dynamics during oocyte maturation and development of somatic cell cloned pig embryos injected with membrane disintegrated donor cells. Anim Reprod Sci 2008; 103: 107-119. Mazur P. Freezing of living cells: mechanisms and implications. Am J Physiol 1984; 247: C125-42. The Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Practice