1. ASOCIACIÓN PARA EL ESTUDIO DE LA BIOLOGÍA DE LA REPRODUCCIÓN
Junio 2010 Vol.15 · Nº1
REVISTA
Complejo huso meiótico-placa metafásica
ACTUALIDAD DEBATE
Proteómica del espermatozoide humano. Es necesario considerar los intentos previos.
Metabolómica y reproducción humana. Auditorías para el 100% de los Centros.
Transparencia no siempre es sinónimo de
ARTÍCULOS honestidad.
Efecto del proceso de vitrificación sobre la
La nueva vía del Registro de Actividad
estructura del huso meiótico y organización
de la SEF: El aumento de la calidad.
cromosómica en ovocitos humanos en
metafase II.
FORMACIÓN CONTINUADA
Las variantes cromosómicas afectan la Impronta genómica y reproducción asistida.
calidad embrionaria.
AGENDA
AULA JOVEN NOTICIAS
Relación entre los patrones pronucleares y la NORMAS DE PUBLICACIÓN
calidad embrionaria según criterios asebir.
3. Í N D I C E
Junio 2010 Vol. 15 · Nº1
EDITA
Asociación para el Estudio de la Biología de la Reproducción
(ASEBIR).
EDITORES Y DIRECTORES CIENTÍFICOS
Marga Esbert - Barcelona
Jorge Cuadros - Madrid
COMITÉ EDITORIAL
Presidente:
Dr. Manuel Ardoy Vilches
SUMARIO
HOSPITAL UNIVERSITARIO GREGORIO MARAÑÓN - Madrid
Vicepresidenta y RRPP:
Dra. Carmen Ochoa Marieta
CER. CLINICA COTERO - Santander
SUMARIO Pág. Secretaría y RRPP:
Dra. Montserrat Boada Palá
INSTITUT UNIVERSITARI DEXEUS - Barcelona
EDITORIAL 3
Tesorería y Relaciones con la Industria:
Reconocimiento de la Embriología Clínica Dr. Fernando Marina Rugero
Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy INSTITUTO DE REPRODUCCION CEFER - Barcelona
Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica
Vocalía de Grupos de Interés e Investigación:
Dr. Josep Santaló Pedro
ACTUALIDAD 5 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BARCELONA - Bellaterra
Proteómica del espermatozoide humano
Rafael Oliva Virgili, Josep Maria Estanyol, Sara de Mateo López, Vocalía de congresos:
Judit Castillo Corullón, José Luis Ballescà Lagarda. Dra. María José Torelló Ybañez
HOSPITAL QUIRÓN BARCELONA - Barcelona
Metabolómica y reproducción humana Dra. Yolanda Mínguez Royo
Imma Sánchez Ribas, Francisco Domínguez, Carlos Simon IVI MADRID - Madrid
Vocalía de Docencia y formación continuada:
ARTÍCULOS 14 Dr. Ignacio Santiago Álvarez Miguel
Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso INST. EXTREMEÑO REPRODUCCIÓN ASISTIDA –IERA -Badajoz
meiótico y organización cromosómica en ovocitos humanos
Dr. Josu Franco Iriarte
en metafase II CENTRO SANITARIO VIRGEN DEL PILAR - San Sebastian
Cristina Costana Duque, Javier Alfonso, Rita Cervera, Ana Monzó,
Vicente Montañana, Miodrag Stojkovic, Alberto Romeu Dr. Juan Manuel Moreno García
CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante
Las variantes cromosómicas afectan la calidad embrionaria Vocalía Página Web:
Mireia Poveda, Teresa Rubio, Isabel Ochando, Laura Gil, Manuel Dr. Juan Manuel Moreno García
Lloret, José Jesús López-Gálvez, Antonio Urbano, Juan Manuel CLINICA VISTAHERMOSA - Alicante
Moreno, Joaquín Rueda Vocalía de publicaciones:
Dr. Jorge Martín Cuadros Fernández
AULA JOVEN 25 CLÍNICA FIV-MADRID - Madrid
Relación entre los patrones pronucleares y la calidad embrionaria
Dra. Marga Esbert Algam
según criterios asebir IVI BARCELONA - Barcelona
Marta Brossa, Xènia Blanch, Marta Antich
La Revista de ASEBIR (Asociación para el Estudio de la Biología
DEBATE 30 de la Reproducción) está indexada en la base de datos Latindex
Es necesario considerar los intentos previos y en la base de datos ICYT, de ciencia y tecnología, del Consejo
Auditorías para el 100% de los Centros Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) de España y ha
sido aceptada para su inclusión en Índice Médico Español
Transparencia no siempre es sinónimo de honestidad
(IME), la base de datos de Biomedicina del CSIC.
La nueva vía del Registro de Actividad de la SEF: El aumento de la calidad.
PUBLICIDAD Y COLABORACIONES
FORMACIÓN CONTINUADA 36 Secretaría ASEBIR
Impronta genómica y reproducción asistida C/ Cronos 20, Edificio 4, 1º, 6ª
28037 Madrid - Tfno: 91 367 89 94
Cristina Camprubí
www.asebir.com · asebir@asebir.com
AGENDA 42 DISEÑO, MAQUETACIÓN E IMPRESIÓN
NOTICIAS 43 GÓBALO: Gráfica · Web · Multimedia · Consultoría
INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES - NORMAS DE PUBLICACIÓN 44 C/ Castillo de Fuensaldaña 4, Oficina 213
28232 · Las Rozas · Madrid
Tfno - Fax.: 91 626 39 74
Imágenes de la portada: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa www.gobalo.es · info@gobalo.es
metafásica en oocitos humanos (Imagen superior) y configuración anormal (Imagen Depósito legal: M-18873-1996
izquierda). Cortesía de Duque et al. pp:14-17. ISSN: 1136-4424
Soporte válido: 78-R-CM
5. E D I T O R I A L
Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
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RECONOCIMIENTO DE LA EMBRIOLOGÍA CLÍNICA
Han pasado ya más de 30 años desde el nacimiento de Louise Brown. Desde aquellos días hasta hoy, la Reproducción Humana
Asistida, sobre todo la Embriología Clínica, ha experimentado enormes cambios. Han surgido nuevas alternativas, y otras se han
visto muy modificadas; y lo mejor de todo es que el cambio, la evolución, continúa.
La reproducción humana asistida y, sobre todo, aquello que nos ocupa: la Embriología, ha terminado ocupando un campo de
características propias y bien definidas dentro del panorama sanitario. Resulta difícil pensar que algún gestor de sanidad de las
diferentes autonomías pueda dudar de que esta atención sanitaria deba estar incluida en su cartera de servicios.
Muchos son los cambios que han consolidado un campo propio y específico para la Embriología Clínica. Tan sólo por enumerar
algunos:
-Aparición constante de alternativas terapéuticas específicas.
-Desarrollo de diferentes técnicas de diagnóstico. Tanto propias como traídas de otros tipos de laboratorios.
-Consolidación de la gestión del laboratorio de reproducción humana asistida, con características diferenciales del resto de
laboratorios.
-Implantación de la reproducción humana asistida en la cartera de servicios habitual del sistema sanitario Español
-Posibilidades docentes propias y de formación práctica, cada vez más asequibles.
-Desarrollo de investigación propia, junto con una gran cantidad de alternativas de intercomunicación científica.
-Existencia de diversas asociaciones científicas exclusivas de este campo.
-Desarrollo legislativo específico de forma habitual, no sólo a nivel nacional
-Un impacto incuestionable en la sociedad: natalidad, partos múltiples, preservación de la fertilidad, parejas homosexuales... La
reproducción humana asistida ha pasado al espectro de lo habitual.
A pesar de todo esto, hay una parcela esencial que se continúa dejando de lado: el reconocimiento específico, propio y oficial de
un ejercicio profesional, el de la Embriología Clínica. Consecuencia de este paso sería la definición de responsabilidades y funciones,
y por tanto la planificación de esquemas formativos. No cabe duda alguna, el principal beneficiario de tal reconocimiento sería el
propio paciente, tanto por la seguridad como por la calidad asistencial que recibiría.
A muchos nos cuesta pensar qué razones llevan a los responsables del Estado a mantener en una situación de casi parada un
reconocimiento que parece tan lógico a los profesionales cercanos a la reproducción humana asistida. Sin embargo, por nuestra
parte sí que ha habido un esfuerzo continuado. Podemos hacer un breve resumen.
Uno de los primeros pasos fue la Cualificación de Especialista en Reproducción Asistida Humana, emitida durante un breve periodo
de tiempo por el COB. Tras el escaso éxito de ésta, y pasado algún tiempo, surgió la posibilidad de que al profesional del Laboratorio
de Reproducción Humana Asistida se le reconociera una de las especialidades reguladas en el RD 1163/2002, que afectaba a biólogos,
químicos y bioquímicos. La solicitada mayoritariamente fue la de Análisis Clínicos. La respuesta oficial la conocemos todos, un
rotundo NO. De esta respuesta hubo dos consecuencias claras:
-Nosotros aprendimos que NO éramos asimilables como parte de una especialidad previa. Por tanto, sin lugar a dudas, el
reconocimiento pasaba por algo más exclusivo y específico.
-El ministerio no podía seguir mirando hacia otro lado durante más tiempo. Era demasiado obvio, tenía una enorme cantidad de
expedientes denegados encima de la mesa y todos tenían algo en común, trabajaban en reproducción humana asistida.
Tras esto, empezamos diferentes reuniones con el ministerio. Una de las primeras cosas que quedaron bien claras era la
imposibilidad, por el momento, de una especialidad propia. Máxime cuando la intención es disminuir el número de las que hay. Una
opción ofrecida fue la posibilidad de valorar el formar parte de las ramas, troncalidades, que pasarán a formar parte de un tronco
común, el del Laboratorio Clínico. Tal y como pasará con las hasta ahora existentes de forma individual: Análisis Clínico, Bioquímica
Clínica... Esta opción fue trabajada, y se presentó a la correspondiente Dirección General del Ministerio de Sanidad una propuesta
de programa formativo de troncalidad en Embriología Clínica. Ésta la podéis obtener en la Web de ASEBIR.
6. E D I T O R I A L
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Si bien actualmente las troncalidades no se han ultimado, parece complejo que se vayan a incluir más campos del conocimiento que
los ya aceptados como especialidad, aunque seguimos trabajando en ello con el ministerio y con las comunidades autónomas,
intentando hacer llegar el asunto al Consejo Interterritorial. Pero el ministerio nos propone una vía alternativa que ayudaría a
fundamentar pasos ulteriores, un Certificado en Embriología Clínica que fuera valorado y emitido por ASEBIR; máxime cuando es
conocedor del proceso de certificación de la ESHRE.
Sin olvidar el resto de los caminos abiertos, la vía principal de evolución por la que se ha optado, y prácticamente la única que el
ministerio deja como viable a corto-medio plazo, es este certificado. Sabemos que su relevancia dependerá de qué apoyos o
reconocimientos oficiales pueda llegar a tener, así como de la consideración personal que se le otorgue. Por el momento, la Dirección
General de Ordenación profesional, Cohesión del SNS y Alta Inspección del Ministerio de Sanidad y Política Social ha dado un visto
bueno a un esquema de Certificación en Embriología Clínica de ASEBIR. Éste tiene varias fases, y en la actualidad se está procediendo
a su desarrollo y puesta en marcha, tal y como se está informando a los socios.
La apuesta es arriesgada, sobre todo cuando la incertidumbre de saber a qué puerto nos hará llegar es grande. Pero el mensaje es
claro, si algo podemos decir en el presente, es que la Embriología Clínica ha madurado lo suficiente como para reclamar un lugar
propio.
Carmen Ochoa, Antonio González, Josep Santaló y Manuel Ardoy
Comisión para la Especialidad de Embriología Clínica.
7. A C T U A L I D A D
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PROTEÓMICA DEL ESPERMATOZOIDE HUMANO
Rafael Oliva Virgili1, Josep Maria Estanyol2, Sara de Mateo López1, Judit Castillo Corullón1, José Luis Ballescà Lagarda3
1
Servicio de Bioquímica y Genética Molecular, Centre de Diagnòstic Biomèdic, Hospital Clínic de Barcelona, y Laboratorio de Genética
Humana, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona.
2
Unitat de Proteòmica, Serveis de Suport a la Recerca, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona
3
Institut Clínic de Ginecología Obstetricia i Ginecologia, Hospital Universitari Clínic de Barcelona
e-mail: roliva@ub.edu
Fecha recepción: 16 abril 2010
Fecha aceptación: 18 abril 2010
LA TRANSICIÓN NUCLEOHISTONA- Mientras que la mayor parte del genoma organizados por protamina y en las
NUCLEOPROTAMINA Y ORGANIZACIÓN DEL de espermatozoide (alrededor de 85- regiones genómicas organizadas por las
DNA EN EL NÚCLEO DEL ESPERMATOZOIDE 95%) está fuertemente empaquetado en histonas no es al azar. Estudios recientes
forma de estructuras toroidales, basados en el análisis del genoma
La espermatogénesis es uno de los también es importante tener en cuenta paterno asociado a cada uno de estos
procesos que conlleva cambios más que alrededor del 5-15% del DNA de los dominios mediante microarrays, han
radicales en la estructura de la espermatozoides está organizado por permitido llegar a la conclusión básica
cromatina hasta dar lugar al proteínas histonas, muchas de las cuales de que las regiones asociadas a
espermatozoide maduro (Mezquita, son variantes específicas del nucleohistona se hallan asociadas con
1985; Oliva and Dixon, 1991). De forma espermatozoide (Fig. 1) (Gatewood et las regiones reguladoras de genes, lo
progresiva primero se desensambla la al., 1987; Oliva, 2006; Balhorn, 2007). que implica la existencia de marcas
estructura nucleosómica presente en las Se ha propuesto que las estructuras epigenéticas con una función potencial
espermatogonias, espermatocitos y toroidales de la nucleoprotamina, cada en el desarrollo embrionario (Arpanahi
espermátidas redondas, y es una con aproximadamente 50 kb de ADN, et al., 2009). En otro estudio reciente,
reemplazada transitoriamente por las podrían estar ancladas a la matriz basado en secuenciación genómica
proteínas de transición y por último por nuclear a través del DNA entre toroide y masiva, se ha detectado que las regiones
las protaminas (Mezquita, 1985; Oliva toroide (Shaman et al., 2007). asociadas a nucleosomas están
and Dixon, 1991; Oliva, 2006; Balhorn, Actualmente se sabe que la distribución significativamente enriquecidas en los
2007) (Fig. 1). de los genes en las regiones genómicas genes importantes para el desarrollo,
incluidos los genes imprintados, los
microRNAs, los genes Hox, y los
promotores de la transcripción de genes
del desarrollo y de factores de
señalización (Hammoud et al., 2009).
Además, se ha demostrado que las
modificaciones de histonas (H3K4me2,
H3K27me3) se localizan en
determinados loci correspondientes con
genes del desarrollo, y que los
promotores asociados a genes del
desarrollo se hallan hipometilados en el
espermatozoide, pero son metilados
durante la maduración (Hammoud et al.,
2009).
Además de estas marcas epigenéticas
determinadas por la distribución
diferencial de los genes en los dominios
asociados a la nucleohistona y a la
nucleoprotamina, hay otros tipos de
Figura 1. Representación esquemática de los cambios de la cromatina que ocurren durante la
información epigenética potencialmente
espermatogénesis. El lado izquierdo de la figura representa los cambios celulares durante la transmitida por el núcleo del
espermatogénesis y primeras fases del desarrollo embrionario. El lado derecho de esta figura representa espermatozoide. Una de las más
los cambios de la cromatina que tienen lugar durante la transición nucleohistona a nucleoprotamina en la conocidas y contrastadas es la
espermiogénesis y en las fases iniciales del desarrollo embrionario. Los cambios celulares en el lado
izquierdo de esta figura corresponden aproximadamente a las estructuras de la cromatina y actividades
metilación del DNA (Reik et al., 2001).
indicadas en el lado derecho. Las histonas están representadas en color rojo y el DNA se marca como líneas Más recientemente, la identificación de
azules. Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones. los RNAs presentes en el espermatozoide
8. A C T U A L I D A D
Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano.
6
y la demostración de su transferencia al al., 2008; 2009). Una cuestión crucial es los precursores de protamina en un
oocito abren la posibilidad de un papel si estos factores de transcripción y las subconjunto de los pacientes (de Yebra
de éstos en la fecundación (Ostenmeyer proteínas recientemente identificados et al., 1998; Bench et al., 1998). Además
et al., 2004). Otra fuente de información en los núcleos representan vestigios del de estos estudios en pacientes
epigenética potencial podría ser la proceso de la espermatogénesis o bien subfértiles, la expresión de protaminas
presencia de otras proteínas en el núcleo están marcando algunas regiones del también se ha estudiado en respuesta al
del espermatozoide, además de las genoma paterno y poseen una función estrés térmico y se ha descrito que
histonas y de las protaminas (Oliva et epigenética (Oliva et al., 2008; 2009; episodios de fiebre alta se correlacionan
al., 2009). Rousseaux et al., 2008). con la aparición de precursores de
protamina P2 y con un aumento en la
La primera evidencia de la presencia de Anomalías en el contenido de protamina proporción de las histonas entre los 33 y
proteínas en el espermatozoide que en pacientes subfértiles fueron ya 39 días después de la hipertermia
podían resultar cruciales para el descritas hace más de 20 años (Balhorn (Evenson et al., 2000).
desarrollo del embrión fue el hallazgo de et al., 1988). Posteriormente, otros
que en los seres humanos y en la mayoría estudios confirmaron la relación entre Los resultados del contenido de
de los mamíferos (con la excepción del un contenido anormal de protaminas y protaminas y de histonas se han
ratón), el centrosoma se hereda de alteraciones en los parámetros correlacionado con alteraciones en la
forma paterna (Chatzimeletiou et al., seminales en estos pacientes infértiles integridad del DNA y con los resultados
2008). También se ha demostrado que (de Yebra et al., 1993; Mengual et al., de reproducción asistida (Bizarro et al.,
variantes de histonas presentes en el 2003; Aoki et al., 2005). Una de las 1998; Nasr-Esfahani et al., 2005; Aoki et
espermatozoide contribuyen a la causas potenciales de alteraciones en la al., 2006; Torregrosa et al., 2006;
formación de la cromatina cigótica en relación de protaminas (P1/P2) puede Domínguez-Fandos et al., 2007; de
humanos y que los procesos encontrarse en un procesamiento Mateo et al., 2008; Aitken and de Yuliis
epigenéticos, implementados durante la anormal de protamina 2 e incremento de et al., 2010).
espermatogénesis, permiten distinguir
el pronúcleo paterno en el embrión (van
der Heijden et al., 2008; de Mateo et al.,
2010). Diversas proteínas adicionales
presentes en los espermatozoides
podrían estar también relacionadas con
el desarrollo embrionario (Martínez-
Heredia et al., 2006; de Mateo et al.,
2007).
Más recientemente, el análisis
proteómico de las proteínas
identificadas en los espermatozoides
maduros ha proporcionado algunos
resultados inesperados. Por ejemplo,
hay factores de transcripción, proteínas
de unión al DNA y proteínas implicadas
en el metabolismo de la cromatina en
células que son transcripcionalmente
inactivas (Oliva et al., 2008; 2009). Los
catálogos correspondientes a los
proteomas de espermatozoide humano
ya están disponibles (Martínez-Heredia
et al., 2006; Baker et al., 2007; Oliva et
al., 2009). Es notable la presencia Figura 2. Estrategias disponibles para el estudio del proteoma del espermatozoide.
de proteínas como la histona
La extracción típica de protaminas a partir de espermatozoides consistente en la reducción de los puentes
acetiltransferasa y deacetilasa, histona disulfuro de las protaminas con ditiotritol (DTT) / hidrocloruro de guanidina, seguido de la extracción con
metiltransferasa, metiltransferasa del 0,5 M HCl, precipitación y purificación de las proteínas y su separación mediante electroforesis en gel de
ADN, la topoisomerasa, helicasa, factores poliacrilamida ácido (izquierda). Con esta estrategia es posible visualizar las proteínas nucleares
mayoritarias: una banda proteica prominente correspondiente a la protamina 1 (P1) y un conjunto de
de transcripción, zinc fingers, proteínas
bandas correspondiente a la familia de la protamina 2 (P2). Para analizar el proteoma total es posible
homeobox, proteínas cromodominio, recurrir a la electroforesis bidimensional de las proteínas del espermatozoide. Para ello se suele recurrir a
proteínas centrosómicas, y la telomerasa una primera dimensión a través de isoelectroenfoque, separando las proteínas atendiendo a su punto
en las células que son isoeléctrico (pI), seguido de una segunda dimensión a través de electroforesis en gel de poliacrilamida –
SDS, que separa a las proteínas por su peso molecular aparente. La identificación de las proteínas se realiza
transcripcionalmente inertes y que
entonces a través de espectrometría de masas. Una última estrategia mucho más robusta consiste en la
tienen al menos el 85% de su DNA generación inicial de péptidos, seguida de su separación mediante cromatografía líquida e identificación
empaquetado por protaminas (Oliva et mediante espectrometría de masas (derecha). Basado en Oliva et al. (2009) con modificaciones.
9. A C T U A L I D A D
Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
7
Identificación de proteínas del muestras distintas. Un método es el 2D- implicados, como resultar de utilidad en
espermatozoide y de sus alteraciones a DIGE que se basa en el marcado el diagnóstico, pronóstico, y desarrollo
través de técnicas proteómicas. diferencial utilizando fluorocromos de de nuevas estrategias terapéuticas.
las proteínas extraídas del control (por
Esencialmente se han utilizado dos ejemplo con verde) y de las células AGRADECIMIENTOS
alternativas diferentes para el estudio experimentales (por ejemplo con rojo).
proteómico de los espermatozoides a Esto es seguido de su mezcla y Subvencionado en parte gracias al
través de espectrometría de masas (MS): separación en la misma 2D, lo que proyecto del Ministerio de Ciencia y
1) electroforesis bidimensional (2D) permite detectar las proteínas Tecnología (BFU2009-07118), Fondos
seguida de la identificación por MALDI- aumentadas o disminuidas observando FEDER a R.O.
MS o cromatografía líquida LC-MS/MS, y la desviación de la fluorescencia hacia
2) la digestión inicial de proteínas para uno de los fluorocromos (Baker et al., REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
generar péptidos, seguido por su 2005; Oliva et al. ,2008). Otra
separación y análisis LC-MS/MS (Oliva et alternativa es la cuantificación y Aitken RJ, De Iuliis GN. On the possible
al., 2009; Baker and Aitken et al., 2009). comparación de la abundancia relativa origins of DNA damage in human
La primera alternativa implica de las distintas proteínas en geles spermatozoa. Mol Hum Reprod. 2010;16:3-13.
generalmente la separación de las independientes. Estrategias más
proteínas utilizando isoelectroenfoque y recientes desarrolladas se basan en el Aoki VW, Emery BR, Liu L, Carrell DT.
es seguida por una electroforesis en gel marcado isotópico no radioactivo de las Protamine levels vary between individual
de poliacrilamida en presencia de SDS muestras problema y control (Baker et sperm cells of infertile human males and
(SDS-PAGE) para separar las proteínas al., 2009; Oliva et al., 2009). correlate with viability and DNA integrity. J
en una segunda dimensión en función de Androl. 2006;27:890-898.
su peso molecular (Fig. 2). La primera descripción del potencial de
análisis proteómico 2D en el estudio de Aoki VW, Liu L, Carrell DT. Identification and
Esta alternativa ha sido ampliamente defectos en espermatozoides se realizó evaluation of a novel sperm protamine
utilizada en el pasado, permitiendo en un paciente con un fallo reiterado de abnormality in a population of infertile
identificar muchas proteínas presentes fecundación en técnicas de fecundación males. Hum Reprod. 2005;20:1298-1306.
en el espermatozoide (Com et al., 2003; in vitro (Pixton et al., 2004). El
Pixton et al., 2004; Martínez-Heredia et proteoma de este paciente mostró 20 Arpanahi A, Brinkworth M, Iles D, et al.
al., 2006; 2009). Pero de las dos diferencias en comparación con los Endonuclease-sensitive regions of human
alternativas, la capacidad de análisis de controles y se consiguió identificar spermatozoal chromatin are highly enriched
la generación inicial de péptidos y su varias proteínas diferenciales. in promoter and CTCF binding sequences.
análisis mediante LC-MS/MS es muy Posteriormente se ha conseguido Genome Res. 2009;19:1338-1349.
superior. Por ejemplo, a través de 2D y identificar proteínas diferenciales en
MALDI-TOF o LC-MS/MS es posible pacientes astenozoospérmicos, Baker MA, Aitken, RJ. Proteomic insights
identificar hasta unos pocos cientos de oligozoospérmicos y en pacientes con into spermatozoa: critiques, comments and
proteínas (de Mateo et al., 2007; alteraciones en el contenido de concerns. Expert Rev Proteom. 2009; 6:691-
Martínez-Heredia et al., 2008), mientras protaminas o en la integridad del DNA 705.
que con la generación inicial de péptidos (Baker et al., 2005; de Mateo et al.,
seguido de LC-MS/MS es posible llegar a 2007; Oliva, 2007; Martínez-Heredia et Baker MA, Reeves G, Hetherington L, Muller
identificar hasta alrededor de 1000 al., 2009; Botta et al., 2009; Siva et al., J, Baur I, Aitken RJ. Identification of gene
proteínas diferentes (Baker et al., 2007; 2010). La proteómica se ha aplicado products present in Triton X-100 soluble and
Oliva et al., 2009). también al estudio de los antígenos insoluble fractions of human spermatozoa
inmunogénicos presentes en los lysates using LC-MS/MS analysis. Proteomics
Actualmente el catálogo más amplio de espermatozoides, tanto con el fin de Clin Appl. 2007; 1:524-532.
las proteínas presentes en el comprender la esterilidad inmunológica
espermatozoide humano se ha como para identificar posibles Baker MA, Witherdin R, Hetherington L,
conseguido a través de LC-MS/MS con candidatos inmuno-anticonceptivos Cunningham-Smith K, Aitken RJ.
1056 productos génicos identificados y (Oliva et al. ,2009). Identification of post-translational
es complementario al obtenido modifications that occur during sperm
mediante 2D e identificación de las La aplicación de las técnicas de maturation using difference in two-
proteínas (de Mateo et al., 2007; Baker proteómica en andrología y en biología dimensional gel electrophoresis. Proteomics.
et al., 2007; Oliva et al., 2009). Además reproductiva se halla en sus inicios, pero 2005; 5:1003-1012.
de la generación de catálogos de las los datos disponibles hasta la fecha ya
proteínas, la proteómica se ha aplicado indican su enorme potencial. Es Balhorn R, Reed S, Tanphaichitr N. Aberrant
también a la identificación de la previsible que en un futuro permitan una protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of
presencia de anomalías en pacientes disección molecular de las distintas infertile human males. Experientia. 1988;
estériles. Existen diversas estrategias causas de esterilidad masculina, 44:52-55.
para analizar el contenido diferencial de permitiendo tanto la identificación de
proteínas presentes en dos o más los mecanismos fisiopatogénicos Balhorn R. The protamine family of sperm
10. A C T U A L I D A D
Rafael Oliva Virgili et al. Proteómica del espermatozoide humano.
8
nuclear proteins. Genome Biol. 2007; 8:227. Evenson DP, Jost LK, Corzett M, Balhorn R. Oliva R, Martinez-Heredia J, Estanyol JM.
Characteristics of human sperm chromatin Proteomics in the study of the sperm cell
Bench G, Corzett MH, De Yebra L, Oliva R, structure following an episode of influenza composition, differentiation and function.
Balhorn R. Protein and DNA contents in and high fever: a case study. J Androl. 2000; Syst Biol Reprod Med. 2008; 54:23-36.
sperm from an infertile human male 21:739-746.
possessing protamine defects that vary over Oliva R, de Mateo S, Estanyol JM. Sperm cell
time. Mol Reprod Dev. 1998; 50:345-353. Gatewood JM, Cook GR, Balhorn R, Bradbury proteomics. Proteomics. 2009; 9:1004-1017.
EM, Schmid CW. Sequence-specific
Bizarro D, Manicardi GC, Bianchi PG, Bianchi packaging of DNA in human sperm Oliva R, de Mateo S, Ballescà JL (2009)
U, Mariethoz E, Sakkas D. In-situ chromatin. Science. 1987; 236:962-964. Proteomics in Andrology. In: Papers
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Reprod 1998; 4:127-132. Carrell DT, Cairns BR. Distinctive chromatin Eds.), Medimond International Proceedings.
in human sperm packages genes for Bologna. Pp 60-69.
Botta T, Blescia S, Martínez J, Lafuente R, embryo development. Nature. 2009;
Brassesco M, Ballescà JL y Oliva R. 460(7254):473-478. Ostermeier GC, Miller D, Huntriss JD,
Identificación de diferencias proteómicas Diamond MP, Krawetz SA. Reproductive
en muestras oligozoospérmicas. Rev Int Martinez-Heredia J, de Mateo S, Vidal- biology: delivering spermatozoan RNA to
Androl. 2009; 7:14-9. Taboada JM, Ballesca JL, Oliva R. the oocyte. Nature. 2004; 429:154.
Identification of proteomic differences in
Chatzimeletiou K, Morrison EE, Prapas N, asthenozoospermic sperm samples. Hum Pixton KL, Deeks ED, Flesch FM, Moseley FL,
Prapas Y, Handyside AH. The centrosome and Reprod. 2009; 23:783-791. Bjorndahl L, Ashton PR, Barratt CL, Brewis
early embryogenesis: clinical insights. IA. Sperm proteome mapping of a patient
Reprod Biomed Online. 2008; 16:485-491. Martinez-Heredia J, Estanyol JM, Ballesca who experienced failed fertilization at IVF
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11. A C T U A L I D A D
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9
METABOLÓMICA Y REPRODUCCIÓN HUMANA
Imma Sánchez Ribas12, Francisco Domínguez2, Carlos Simon3.
1
IVI Barcelona, Fundación IVI, Embryomics, 2Embryomics, 3 IVI Valencia, Fundación IVI
INTRODUCCIÓN análisis cualitativo y cuantitativo de Sin embargo, con las -Ómicas tenemos
proteínas y metabolitos, respectivamente, una situación de acercamiento
Uno de los mayores retos en el campo de en una célula, un organismo o una inductivo, donde no hay una hipótesis
la reproducción humana es la selección muestra bajo distintas condiciones, con la real, y la estrategia es generar esta
de los embriones más apropiados a finalidad de obtener un perfil hipótesis desde los datos obtenidos,
transferir. Hasta la fecha, en los ciclos comprensible de todas las proteínas y provocando un descubrimiento del
de Fecundación In Vitro, la evaluación metabolitos de esa célula, organismo o conocimiento y pudiendo a posteriori
morfológica sigue siendo el método de muestra. Los metabolitos de bajo peso testar estas nuevas hipótesis de la forma
asesoramiento utilizado para escoger el molecular representan el producto final tradicional. El diseño experimental es
mejor embrión o blastocisto, pero este de procesos de regulación celular, y por lo muy importante en el acercamiento
método de selección es altamente tanto revela la respuesta de los sistemas inductivo, porque determinará qué
subjetivo y su modesto poder predictivo biológicos a una variedad de influencias experimentos nos van a dar la
y la variabilidad inter- e intra- genéticas, nutricionales y ambientales información que estamos buscando. La
observador limita su valor. (Singh and Sinclair, 2007) estrategia en la que un algoritmo elige
qué experimentos hacer es conocida
Además, seleccionar el mejor embrión a Aunque la metabolómica es obviamente como “aprendizaje activo” y es la
transferir no sólo significa escoger el complementaria a la genómica y estrategia de elección. Para ello
embrión que nos va a dar más proteómica, tiene ventajas especiales. debemos contar con sistemas
posibilidades de embarazo, sino que La tabla número 1 recoge las ventajas informáticos de alta complejidad
también es crucial escoger aquel del estudio del metaboloma en (Waidyanathan, 2003; Goodacre, 2004)
embrión que nos va a aumentar la tasa comparación con el del transcriptoma y
de recién nacido vivo en casa. el proteoma (Dunn and Ellis, 2003). ¿QUÉ ES LA METABOLÓMICA?
Actualmente, lo más novedoso en el CAMBIO EN LAS ESTRATEGIAS DE Existe un debate activo en la comunidad
estudio de la embriogénesis son las GENERACION DE HIPÓTESIS científica sobre la definición exacta de
técnicas -Ómicas. Son disciplinas que metaboloma. Fue definido por primera vez
estudian los eventos e interacciones de las Las -Ómicas están transformando el por Oliver y cols. (1988) como el
estructuras celulares y sus procesos, desde método de investigación. El obtener tal complemento cuantitativo de todas las
el DNA hasta la función biológica; es decir, grado de información ha implicado un moléculas de bajo peso molecular que se
desde los genes hasta los metabolitos. cambio en el ciclo del conocimiento. En el encuentran en las células en un estado
Todos los procesos que contribuyen en el ciclo del conocimiento tradicional, el fisiológico particular o de desarrollo. Otra
definición sustenta que el metaboloma
consiste en sólo aquellas moléculas
pequeñas y nativas que están participando
en reacciones metabólicas generales y que
son requeridas para el mantenimiento,
crecimiento y funcionamiento de la célula
(Beecher et al., 2003).
En términos generales, por
metabolómica (Nicholson et al., 1999;
Fiehn et al., 2002) se entiende la
obtención, de una manera simultánea y
global, de perfiles correspondientes a
múltiples concentraciones de
metabolitos y de sus fluctuaciones
fenotipo pasan a través de este complejo conocimiento previo se utilizaba para sistémicas y celulares en respuesta a
sistema, y la Genómica, Transcriptómica, construir una hipótesis para ser testada fármacos, dieta, genética, estilo de vida,
Proteómica y Metabolómica intentan experimentalmente. El experimento entorno y estímulos, de forma que sea
comprender cómo un embrión crece y producía datos que daban consistencia o posible caracterizar los efectos adversos
cuáles son sus indicadores de éxito. no a la hipótesis inicial. Es decir, la y beneficiosos de esas interacciones.
hipótesis era el punto de partida. El
Las tecnologías proteómica y acercamiento, por tanto, era hipotético- La metabolómica busca una descripción
metabolómica han desarrollado el deductivo. analítica de muestras biológicas
12. A C T U A L I D A D
Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.
10
complejas, e intenta caracterizar y De todas ellas, las tecnologías más biológico o clínico y explicar los
cuantificar todas las moléculas empleadas para el análisis mecanismos bioquímicos relacionados
pequeñas de ese tipo de muestras. Sin metabolómico son la espectrometría de con los cambios observados, y así
embargo, medir el metaboloma es un masas, que generalmente incluye un ampliar el conocimiento existente.
reto analítico considerable. Esto es paso de separación cromatográfica, y la
debido a la naturaleza lábil de los espectroscopia de RMN, dado que ambas ESPECTROMETRÍA DE MASAS (EM O MS) Y
metabolitos, el rango ampliamente plataformas proporcionan una amplia RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN)
dinámico y diverso de muchos de ellos, información estructural y
la complejidad química y heterogénea de conformacional sobre múltiples clases Tanto la EM como la RMN se emplean de
los mismos, la falta de técnicas químicas en un procedimiento analítico forma rutinaria en los estudios
analíticas automatizadas que puedan único. Las dos técnicas poseen metabolómicos.
medir cuantitativamente un gran diferentes ventajas y desventajas desde
número de metabolitos de estructura el punto de vista técnico, y suelen La EM es una herramienta de análisis
desconocida, el rendimiento de las ofrecer información complementaria metabólomico muy poderosa, ya que
mediciones y la naturaleza elaborada de (Lenz et al., 2007). Ambos métodos provee una única mezcla de sensibilidad,
los protocolos de extracción (Whitfield proporcionan información sobre un rapidez, calidad y análisis potencialmente
et al., 2004). amplio conjunto de metabolitos, sin tener cuantitativo de una gran cantidad de
que preseleccionar qué analitos deben ser metabolitos. Puede ser usada sola o en
PLATAFORMAS DE ANÁLISIS detectados. Esto nos permite diseñar combinación con otras técnicas de
experimentos basados en el cromatografía. Los análisis de EM
Todos estos desafíos deben ser razonamiento inductivo para generar requieren una preparación exhaustiva de
abordados por la plataforma de análisis nuevas hipótesis, siendo una vía la muestra y una extracción de la misma
empleados. Las plataformas para las potencial de descubrimiento de utilizando solventes orgánicos que
medidas del metaboloma deben ser conocimiento a través del holismo. pueden provocar la pérdida de algunos
imparciales, sensibles y con una gran Además, los dos métodos pueden compuestos.
capacidad de análisis de alto emplearse para identificar las estructuras
rendimiento para discriminar un gran de los metabolitos, y para medir las La RMN es una técnica no destructiva, no
número de metabolitos. A pesar del gran concentraciones relativas y absolutas. invasiva, y que no modifica el equilibrio
éxito en el desarrollo de la tecnología biológico, y proporciona una
información detallada sobre las
Fig 1.
estructuras moleculares en solución.
Además la espectroscopia de RMN es una
técnica muy fiable para las aplicaciones
metabolómicas que requieren un alto
grado de reproducibilidad.
Ambas técnicas permiten la detección
simultánea de un amplio rango de
metabolitos estructuralmente diversos y
la detección en bajas concentraciones de
los mismos.
metabolómica, aún no es posible OBJETIVOS DE LA METABOLÓMICA Es importante tener en cuenta que, sea
analizar con una única plataforma cual sea el origen de las muestras,
analítica la diversidad de metabolitos Todos los estudios metabolómicos dan deben evitarse fuentes potenciales de
complejos. La Fig. 1 indica las distintas lugar a un conjunto de resultados artefactos durante el proceso de
tecnologías para el análisis complejo, que requiere un software recogida de las muestras biológicas, con
metabolómico de muestras, así como las específico para su visualización y el fin de obtener resultados que posean
características más relevantes de las métodos quimiométricos y una buena calidad y fiabilidad.
mismas. El tipo de muestras que se bioinformáticos para su interpretación.
analiza mediante estas técnicas son El objetivo de estos experimentos es Análisis estadístico multivariable
biofluidos como orina, plasma o suero generalmente el de obtener huellas
previa precipitación de proteínas; bioquímicas que puedan ser útiles desde Los métodos de análisis estadístico
metabolitos intracelulares de plantas, un punto de vista diagnóstico o de multivariable proporcionan un medio de
microbios y animales, previa extracción clasificación, y, en un segundo lugar, el optimizar la extracción de la información
mediante solventes polares y no polares; de identificar las sustancias que contenida en los espectros de EM y RMN
tejidos sin previa o mínima preparación contribuyen a dicho diagnóstico o de mezclas complejas. Una vez realizados
y huellas metabólicas en secreciones clasificación, ya que éstas conforman un todos los pasos anteriores, lo que se tiene
naturales de metabolitos intracelulares conjunto complejo de biomarcadores es una serie (uno por muestra) de perfiles
hacia el volumen extracelular. que puede ayudar a definir el contexto multivariable que representan un punto
13. A C T U A L I D A D
Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
11
en un espacio K-dimensional, y cuya emplea para revelar la estructura interna contienen módulos (B-Bioref-Code,
posición (coordinadas) depende de los de un conjunto de datos sin que medie Bruker BioSpin) que permiten la
valores de cada uno de los descriptores (o ningún tipo de conocimiento previo del identificación y asignación de metabolitos
metabolitos) que describen el sistema (la sistema. PLS, sin embargo, es un método presentes en mezclas complejas. Hay que
muestra). Cuando se trata de analizar una supervisado para regresión. En este tener en cuenta que las bibliotecas
serie de perfiles, resulta muy útil la caso, el objetivo es predecir las metabolómicas no son completas, y que
aplicación de lo que se denominan respuestas en un conjunto de datos. no todos los metabolitos hallados tienen
métodos basados en la proyección. Los Empleando una barrera de corte, PLS posibilidad de identificación.
métodos de proyección convierten tablas puede emplearse también para análisis
de datos multidimensionales en modelos basados en la clasificación y ASESORAMIENTO METABOLÓMICO DE
de dimensionalidad. Esto permite discriminación (PLS-DA, “Partial Least CALIDAD EMBRIONARIA
detectar además agrupaciones y Squares-Discriminant Analysis”).
tendencias, ya que puntos que se El metabolismo es intrínseco a la salud
encuentran cercanos corresponden a Identificación de metabolitos del embrión, por lo que muchas
perfiles multivariables relativamente investigaciones se han concentrado en
similares. De forma opuesta, puntos que Dependiendo del tipo de análisis que se desarrollar marcadores metabólicos no
se encuentran alejados unos de otros esté desarrollando, los estudios invasivos de capacidad de desarrollo,
presentan descriptores muy diferentes. metabolómicos pueden requerir la como el consumo de oxígeno, reacciones
identificación de los metabolitos REDOX, el consumo energético a través
Un ejemplo de lo explicado podemos verlo presentes en las muestras biológicas de Na+, K+ y ATPasa o el turnover de
en la Figura 2, donde puede apreciarse la analizadas. Este objetivo puede aminoácidos (Houghton et al., 2004).
Fig 2.
Las últimas investigaciones en las
técnicas moleculares están definiendo
perfiles génicos, proteicos y
metabolómicos para intentar detectar
cuál es el ovocito o embrión más hábil,
entendiendo esta habilidad como su
capacidad para implantar (Katz-Jaffe et
al., 2006; Patricio et al., 2007; Brison et
al., 2007; Seli et al., 2007)
Actualmente se están desarrollando
utilidad de esta herramienta para alcanzarse mediante la comparación entre técnicas cuantitativas para el
comprender los patrones que subyacen los desplazamientos químicos obtenidos asesoramiento no invasivo del
bajo la gran cantidad de información en los espectros de EM o RMN y aquellos metabolismo embrionario, y es el objetivo
generada en los estudios metabolómicos. disponibles en bases de datos como la de investigaciones actuales el determinar
Quedan patentes las relaciones entre las MMCD (Madison Metabolomics su valor como predictores de viabilidad
distintas muestras, pudiendo describir Consortium Database) (Cui et al., 2008)) embrionaria y embarazo (Seli et al., 2007).
agrupamientos, tendencias e influencias. o la HMDB (Human Metabolome
DataBase) (Wishart et al., 2007). Seli y col. publicaron en 2007 el primer
Aunque los métodos de proyección Alternativamente, existen programas estudio con un enfoque metabolómico
descritos forman la base de los estudios (p.ej., “Analysis of MIXtures”, AMIX, para estudiar la viabilidad del embrión
metabolómicos, los análisis estadísticos Bruker BioSpin) que permiten realizar humano. Ellos utilizaron como
dependen del tipo de estudio que se esté todas las etapas descritas anteriormente plataforma metabolómica de análisis el
desarrollando. Existe una gran variedad (selección de regiones de interés, Near-infrared and Raman spectroscopy,
de métodos que pueden emplearse en el segmentación del espectro, para analizar y comparar el perfil
análisis de datos metabolómicos. La normalización, análisis estadístico) y que metabolómico utilizando medios
principal diferencia entre todos ellos es condicionados provenientes de
si se dispone o no de información previa embriones que implantaron frente a los
Fig 3.
sobre la clasificación de muestras en que no implantaron. Aunque no
clases distintas, o si se sospecha la encontraron marcadores específicos, si
existencia de nuevas clases. Sin duda obtuvieron distintos espectros entre
alguna, los métodos más empleados de ambos grupos, siendo posible diferenciar
análisis multivariable son los fácilmente ambas poblaciones La Fig 3
denominados PCA (análisis de muestra los distintos espectros que
componentes principales (Holmes, obtuvieron de los medios de cultivo
1998)) y PLS (mínimos cuadrados embrionario analizados de cada una de las
parciales (Wold et al., 1984)). El PCA es muestras utilizadas en el estudio (Seli et
un método no supervisado que se al., 2007).
14. A C T U A L I D A D
Imma Sánchez Ribas et al. Metabolómica y reproducción humana.
12
El mismo grupo, en 2008, publica la Fig 4.
identificación de marcadores de
viabilidad utilizando análisis
metabolómico mediante NMR, en un
estudio retrospectivo realizado en 34
pacientes. Explican encontrar
diferencias significativas en
concentraciones de glutamato entre
embriones procedentes de embarazos
y/o partos y embriones procedentes de
fallo de implantación (Seli et al., 2008).
Otra aplicación de la metabolómica en el
campo de la Reproducción Humana es el
que estamos llevando en el Instituto
Valenciano de Infertilidad, con el apoyo
de la Fundación IVI. Nuestro objetivo muestras procedentes de embriones con R. Predicting human embryo viability: the road
es desarrollar un diagnóstico diagnóstico de aneuploidías se concentran to non-invasive análisis of the secretome using
preimplantacional no invasivo con la en un área distinta. metabolomic footprinting. Reproductive
ayuda de estas nuevas tecnologías. BioMedicine Online 2007; 15. 296-302.
Pretendemos encontrar un perfil DISCUSIÓN
metabolómico embrionario que nos Cui Q et al. Metabolite identification via the
permita discriminar los embriones El método de evaluación tradicional Madison Metabolomics Consortium Database.
normales de los embriones aneuploides, embrionario tiene una capacidad limitada Nat Biotechnol 2008; 26: 162-164.
utilizando el medio de cultivo donde para seleccionar embriones con desarrollo
éstos se desarrollan. potencial. Hay una clara necesidad de Dunn W, Ellis D. Metabolomics : current
mejora en nuestro trabajo diario; analytical platforms and methodologies.
La instrumentación de análisis deberíamos ser capaces de aumentar las Trends in analytical chemistry 2005; 24: 285-
metabolómico que estamos utilizando es tasas de gestación y disminuir el riesgo de 294.
la Espectrometría de Masas asociada a gestación múltiple. Actualmente existen
UPLC. El sistema de UPLC ha sido nuevas tecnologías en desarrollo para Fiehn O. Metabolomics – the link between
diseñado para detectar partículas conseguir este objetivo, pudiendo ser genotypes and phenotypes. Plant Mol Biol
pequeñas (1,7 mm) y encontrar así tecnologías que utilicemos en un futuro 2002; 48: 155-71.
perfiles de alta resolución. Por lo tanto, como herramientas útiles de selección
este sistema es óptimo para el análisis embrionaria, así como tecnologías que Goodacre R, Vaidyanathan S, Dunn W, Harrigan
de muestras de alta complejidad, como nos permitan expandir el conocimiento de G and Kell D. Metabolomics by numbers:
nuestros medios de cultivo, debido al la fisiología embrionaria con el objetivo acquiring and understanding global
alto poder de separación metabólica y de aumentar la eficacia de las Técnicas de metabolite data. Trends in Biotechnology
resolución de picos. Reproducción Asistida. 2004; 22: 245-252.
En los análisis llevados a cabo hasta la La capacidad de evaluar la producción y Holmes E, Nicholson J, Nicholls A, Lindon J,
fecha, hemos observado que el perfil consumo metabolómico de un embrión Connor S, Polley S, Connelly J. The
metabólico de los medios de cultivo individual nos llevaría a una mejor identification of novel biomarkers of renal
de los embriones humanos parece comprensión de la función celular y toxicity using automatic data reduction
discriminar entre embriones fisiología en etapas específicas de la techniques and PCA of proton NMR spectra of
cromosómicamente normales y embriogénesis. Por otra parte, este urine Chemometrics and Intelligent
anormales, aunque existen limitaciones enfoque nos ayudaría a mejorar los Laboratory Systems. 1998; 44: 245-255.
debidas a la baja cantidad de medios de cultivo de embriones y
metabolitos presentes en las muestras. podríamos identificar las interacciones Houghton F, Leese H. Metabolism and
entre los embriones y el epitelio uterino developmental competence of the
La Fig 4 es un score-plot donde cada punto materno antes de la implantación. preimplantational embryo. Europ Jour of Obst
representa un medio de cultivo Gyn Reprod Bio 2004.115S. S92-S96.
embrionario, lo que nos permite apreciar REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
la relación que hay entre las muestras. La Johnson HE, Broadhurst D, Goodacre R, Smith
tendencia observada es que muestras Beecher,CWW. The human metabolome. In AR. Metabolic fingerprinting of salt-stressed
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aneuploidías (PGD-AS) se concentran en Proteomic analysis of individual human
un área del diagrama de coordenadas, y Brison DR, Hollywood K, Arnesen R, Goodacre embryos to identify novel biomarkers of
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16. A R T Í C U L O I
14
EFECTO DEL PROCESO DE VITRIFICACIÓN SOBRE LA ESTRUCTURA
DEL HUSO MEIÓTICO Y ORGANIZACIÓN CROMOSÓMICA EN
OVOCITOS HUMANOS EN METAFASE II
EFFECT OF VITRIFICATION PROCEDURE ON SPINDLE AND CHROMOSOME
CONFIGURATION IN METAPHASE II HUMAN OOCYTES
Cristina Costana Duque*1, Javier Alfonso2, Rita Cervera3, Ana Monzó1,2, Vicente Montañana 1,2, Miodrag Stojkovic3, Alberto Romeu 1,2
1
Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. 2Instituto de Medicina Reproductiva (IMER),
Valencia. 3Laboratorio de Reprogramación Celular, Centro de Investigación Príncipe Felipe (CIPF), Valencia.
*Unidad de Reproducción Humana (Servicio de Ginecología). Hospital Universitario la Fe, Valencia. Av/ Campanar 21, 46009, Valencia.
e-mail: cristinacostana@hotmail.com
Fecha recepción: 30 abril 2010 · Fecha aceptación: 3 mayo 2010
RESUMEN
El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la técnica de vitrificación utilizando el método del Cryotip™ sobre la
integridad del huso meiótico y la organización cromosómica en ovocitos humanos en metafase II. La configuración del huso
meiótico y de la placa metafásica de los ovocitos frescos (control) y vitrificados se evaluó mediante microscopía confocal. La
tasa de supervivencia para los ovocitos desvitrificados fue del 91,6%. La proporción de ovocitos que mostró una configuración
normal del huso meiótico y de la placa metafásica fue similar en ovocitos frescos y vitrificados, sugiriendo que la técnica de
vitrificación con el Cryotip™ permite mantener el potencial de los ovocitos una vez desvitrificados. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
15(1):14-17.
Palabras clave: ovocitos metafase II, vitrificación, huso meiótico, organización cromosómica.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of vitrification procedure using the Cryotip™ method on spindle and
chromosome configurations in metaphase II human oocytes. The meiotic spindle and chromosome configurations in fresh
(control) and vitrified oocytes were studied by confocal microscopy. Survival rate for vitrified oocytes was 91.6%. The
proportion of oocytes showing normal spindle and chromosome configuration was similar for fresh and vitrified oocytes
showing that vitrification with the Cryotip™ method supports oocyte potential after warming. Rev Asoc Est Biol Rep 2010;
15(1):14-17.
Keywords: metaphase II oocytes, vitrification, meiotic spindle, chromosome configuration
INTRODUCCIÓN la sincronización donante-receptora en Los microtúbulos, que conforman el
ciclos de donación de ovocitos o, huso meiótico, y los microfilamentos,
La criopreservación de ovocitos permite simplemente, en mujeres fértiles que localizados en el córtex ovocitario, son
preservar la fertilidad en pacientes que deseen posponer la maternidad. muy susceptibles a la temperatura de
por diversas etiologías pueden enfriamiento (chilling) y a la exposición
desarrollar un Fallo Ovárico Prematuro La criopreservación ovocitaria utilizando a los crioprotectores (Boiso et al.,
(FOP). Es el caso de exposición a agentes la técnica de congelación convencional se 2002). Una alteración en estas
quimio/radioterápicos, enfermedades considera un procedimiento estructuras podría conducir a una
autoinmunes o hematológicas, o experimental, debido a las bajas tasas de alineación cromosómica incorrecta
procesos quirúrgicos potencialmente supervivencia y gestación y al limitado previa a la extrusión del corpúsculo
esterilizantes. La criopreservación número de recién nacidos logrado (ASRM, polar, a una segregación cromosómica
ovocitaria puede emplearse también 2006). Los protocolos de alterada, fecundación anómala y/o a una
para evitar la criopreservación de congelación/descongelación elevada incidencia de aneuploidías.
embriones, para rescatar ciclos convencionales conllevan una reducción
complicados con un síndrome de lenta de la temperatura en el tiempo, La vitrificación combina tasas de
hiperestimulación ovárica o con resultando en el daño de estructuras enfriamiento del orden de -15.000º C a -
ausencia de muestra seminal el día de la vitales de los ovocitos. 30.000º C por minuto (Liebermann et al.,
punción-aspiración folicular, para evitar 2003) y concentraciones elevadas de
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crioprotectores, aumentando de tal hiperestimulación ovárica controlada compuestas por medio 199 con
manera su viscosidad que no cristaliza que incluyó, como frenado hipofisario, concentraciones decrecientes de
sino que forma un estado amorfo similar agonistas de la GnRH en protocolo largo sacarosa (1.0M y 0.5M).
al vidrio. y como estimulación FSH recombinante.
Los ovocitos se recuperaron por punción La supervivencia ovocitaria se evaluó
La técnica de vitrificación permite burlar transvaginal ecoguiada, 36-38 horas inmediatamente tras la desvitrificación
dos de los factores que limitan el éxito tras la administración de la hCG. Los y tras 4 horas de cultivo in vitro,
de la criopreservación: por un lado, el complejos cúmulo-ovocito fueron valorándose la integridad de la zona
proceso conocido como chilling injury cultivados en medio IVF (Universal IVF pelúcida, la apariencia del citoplasma y
(Vatja and Kuwayama, 2006) y, por otro, Medium, Medicult, Jyllinge, Denmark) la ausencia de lisis celular.
la formación de cristales de hielo en el bajo condiciones de cultivo estándar
interior de las células (Mazur, 1984). El (37º C y 5% de CO2). Tras al menos 2 Fijación y tinción inmunocitoquímica:
primero se define como el daño horas de cultivo in vitro, los ovocitos
irreversible tras la exposición de las fueron incubados con 80 IU/mL La fijación de los ovocitos y tinción
células a bajas temperaturas (de + 15º C hialuronidasa (Hyadase, Medicult, inmunocitoquímica del huso meiótico se
a -5º C) antes de que se produzca la Jyllinge, Denmark) y las células del realizó siguiendo el protocolo descrito
enucleación del hielo. En consecuencia, cúmulo fueron eliminadas mediante el por Lin et al. (2008).
estructuras celulares como el pipeteado mecánico de los ovocitos. Los
citoesqueleto o las membranas celulares ovocitos fueron entonces observados Brevemente, los ovocitos MII
se ven claramente afectadas. El utilizando un microscopio invertido desvitrificados y frescos (grupo control)
fenómeno del chilling puede minimizarse (x200) y los ovocitos MII se identificaron fueron fijados a 37ºC durante 1 hora en
durante el proceso de vitrificación por la presencia del primer corpúsculo una solución de formaldehído al 2% y
mediante el empleo de tasas de polar. permeabilizados en una solución de
enfriamiento elevadas (Liebermann et Tritón X-100 al 0.5% durante 30
al., 2003). La velocidad de enfriamiento Se vitrificaron un total de 12 ovocitos en minutos a temperatura ambiente. Para
de la muestra va a depender del volumen estadio de MII recuperados de pacientes la tinción de la tubulina, los ovocitos se
de la solución de vitrificación, así, a incluidas en el Programa de Fecundación incubaron durante 90 minutos a 37ºC en
menor volumen, mayor velocidad de in vitro del Instituto de Medicina una solución de anticuerpos primarios
enfriamiento, aumentando ésta Reproductiva (IMER) de Valencia que anti-α y anti-β tubulina (1/400), seguido
mediante la inmersión directa en firmaron el correspondiente de 3 lavados y se incubaron durante 120
nitrógeno líquido. Para evitar la consentimiento informado. Como grupo minutos a 37ºC en una solución de
formación de cristales de hielo, en la control (ovocitos MII no vitrificados), se anticuerpo secundario Alexa 488
técnica de vitrificación se emplean incluyeron 6 ovocitos procedentes de (1/200). Para la tinción de
elevadas concentraciones de pacientes pertenecientes al Programa de microfilamentos, los ovocitos se
crioprotectores (Liebermann et al., Fecundación in vitro de la Unidad de incubaron en una solución de rodamina-
2003), sin olvidar su efecto tóxico para Reproducción del Hospital Universitario faloidina durante 60 minutos a
las células. Sin embargo, una la Fe de Valencia, previa firma del temperatura ambiente. Finalmente, los
composición adecuada de consentimiento de participación en un ovocitos fueron montados utilizando
crioprotectores puede solventar los Proyecto de Investigación desarrollado en medio de montaje con DAPI y
efectos tóxicos y osmóticos debidos a la el Centro de Investigación Príncipe Felipe mantenidos a 4ºC hasta su evaluación.
alta concentración de crioprotectores en (CIPF) de Valencia y con licencia por parte
la solución de vitrificación. La mezcla de del Instituto de Salud Carlos III. Evaluación del huso meiótico:
crioprotectores más utilizada es la
formada por etilenglicol (EG), Protocolo de vitrificación: Para la valoración de los microtúbulos,
dimetilsulfóxido (DMSO) y sacarosa. microfilamentos y cromosomas, se
Para la vitrificación ovocitaria se utilizó utilizó un microscopio confocal con
El objetivo de este estudio fue evaluar el el kit comercial de Irvine Scientific con lasser-scanning (Leica DM IRE 2)
efecto de la criopreservación ovocitaria el Cryotip™ como contenedor. Los equipado con un láser de argón,
mediante la técnica de vitrificación con ovocitos fueron equilibrados en una perteneciente al Servicio de Microscopía
un sistema cerrado (Cryotip™) sobre la solución compuesta por 7.5 % (v/v) de Confocal del CIPF de Valencia.
integridad del huso meiótico y la DMSO + 7.5% (v/v) de EG + 20%
organización cromosómica en ovocitos suplemento sustitutivo de suero en RESULTADOS
humanos Metafase II (MII). medio 199. Posteriormente, fueron
expuestos a la solución de vitrificación Se vitrificaron y desvitrificaron 12
MATERIAL Y MÉTODOS compuesta por 15 % (v/v) de DMSO + ovocitos MII. La tasa de supervivencia
15% (v/v) de EG + 0.5M de sacarosa + fue del 91,6% (11/12). Todos los
Ovocitos MII: 20% suplemento sustitutivo de suero en ovocitos que sobrevivieron a la
medio 199 y cargados en el Cryotip™. desvitrificación mostraron una
A todas las pacientes que formaron parte Para la desvitrificación, los ovocitos apariencia morfológica normal tras 4
del estudio se les aplicó un protocolo de fueron expuestos a soluciones horas de cultivo in vitro.
18. A R T Í C U L O I
Cristina Duque et al. Efecto del proceso de vitrificación sobre la estructura del huso meiótico.
16
Se fijaron para tinción correcta segregación cromosómica y AGRADECIMIENTOS
inmunocitoquímica 10 ovocitos MII evitar así la posible aparición de
desvitrificados y 6 ovocitos MII frescos. aneuploidías en el embrión. Aunque sólo Este estudio ha sido parcialmente
La tasa de ovocitos informativos fue del se observaron anomalías en el huso financiado por el Programa de Medicina
100% para el grupo control y del 70% meiótico/cromosomas en el grupo Regenerativa del Instituto de Salud
para los ovocitos desvitrificados. Esta de ovocitos desvitrificados, las Carlos III.
menor tasa de informatividad para diferencias no fueron estadísticamente
ovocitos desvitrificados fue debida a significativas respecto al grupo control REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
problemas acontecidos durante la (frescos). Estos resultados son similares
tinción, con independencia de la técnica a los descritos en la bibliografía (Li et Boiso I, Martí M, Santaló J. A confocal
de vitrificación. al., 2006; Cobo et al., 2008). microscopy analysis of the spindle and
chromosome configurations of human
En función de la orientación del La vitrificación utilizando el Cryotip™ oocytes cryopreserved at the germinal
complejo huso/cromosomas respecto al como contenedor permite la vitrificación vesicle and metaphase II stage. Human
plano focal, se consideró una de ovocitos en microvolúmenes (alrededor Reprod 2002; 17: 1885-1891.
configuración normal si: a) cuando al de 1 μL), incrementando la tasa de
estar orientado de forma paralela al enfriamiento y minimizando el efecto Cobo A, Pérez S, De los Santos MJ, Zulategui
plano focal el huso presenta una tóxico de los crioprotectores al disminuir J, Domingo J, Remohí J. Effect of different
estructura típica en forma de barril con su concentración. El mantenimiento de la cryopreservation protocols on the
los polos ligeramente señalados y los integridad del huso meiótico y de la placa metaphase II spindle in human oocytes.
cromosomas dispuestos en el ecuador, metafásica tras la desvitrificación sugiere Reprod Biomed Online 2008; 3: 350-359.
b) cuando al estar orientado de forma que dicha técnica de vitrificación permite
perpendicular al plano focal el huso preservar la calidad inicial del ovocito y el Li Y, Feng HL, Cao HL, Zheng GJ, Yang Y,
presenta una estructura circular con los potencial necesario para soportar el Mullen S, Critser JK, Chen ZJ. Confocal
cromosomas orientados en forma de posterior desarrollo embrionario. microscopic analysis of the spindle and
círculo y c) cuando al estar orientado de
forma oblicua al plano focal el huso
presenta una estructura en forma oval
(barril acortado) con los cromosomas
alineados en el ecuador. Por otro lado,
una configuración anómala del complejo
huso/cromosomas quedó representada
por una desorganización parcial o
completa de los microtúbulos o por una
dispersión cromosómica o apariencia
cromosómica aberrante o poco
condensada. En las Figuras 1 y 2 se
muestran una configuración normal y
una anómala del complejo
huso/cromosomas, respectivamente.
La proporción de ovocitos con una Figura 1: Configuración normal del complejo huso meiótico-placa metafásica.
configuración normal del huso meiótico
y una alineación correcta de los
cromosomas fue del 100% para los
ovocitos del grupo control y de 85,7%
para los ovocitos desvitrificados, sin que
se observaran diferencias significativas
entre ambos grupos.
DISCUSIÓN
En este trabajo se evalúa el efecto de la
técnica de vitrificación con un sistema
cerrado (Cryotip™) sobre la
configuración del huso meiótico y la
organización cromosómica en ovocitos
humanos en estadio de MII. La
integridad de este complejo es
imprescindible para que se produzca una Figura 2: Configuración anómala del complejo huso meiótico-placa metafásica.
19. A R T Í C U L O I
Rev Asoc Est Biol Rep Junio 2010 Vol. 15 Nº 1
17
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