Préparation des échantilons pour l'analyse microbiologique

PRÉPARATION DES ÉCHANTILLONS POUR
L’ANALYSE MICROBIOLOGIQUE
01-D-550

TABLE DES MATIÈRES
1. INTRODUCTION ....................................................................................... 4
2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE........................................................... 4
3. RÉCEPTION, ENTREPOSAGE ET DÉCONGÉLATION DES ÉCHANTILLONS............ 4
3.1 Vérification des conditions de transport et de l'intégrité des contenants.... 4
3.2 Identification et enregistrement des échantillons................................... 5
3.3 Entreposage des échantillons ............................................................. 5
3.3.1 Généralités............................................................................. 5
3.3.2 Préparation de l'échantillon pour le maintien de la viabilité des
Campylobacters thermotolérants lors d'un entreposage prolongé
avant analyse......................................................................... 5
3.3.3 Préparation de l'échantillon pour le maintien des cellules végétatives
de Clostridium perfringens lors d'un entreposage prolongé avant
analyse ................................................................................. 6
3.4 Décongélation des échantillons ........................................................... 6
4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE……………………………………..........................…………………...7
4.1 Définitions....................................................................................... 7
4.1.1 Échantillon ............................................................................. 7
4.1.2 Unité composite ...................................................................... 7
4.1.3 Unité d'analyse ....................................................................... 7
4.2 Mesures d'hygiène et de salubrité ....................................................... 7
4.3 Prise de l'unité d'analyse et pesée....................................................... 7
4.3.1 Tous les aliments .................................................................... 7
4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides.............................................. 8
4.3.3 Regroupement des unités d'analyse pour la recherche de bactéries
pathogènes telles Salmonella et Listeria monocytogenes (unité
composite)............................................................................. 8
4.3.4 Viandes................................................................................. 9
4.3.4.1 En bloc...................................................................... 9
4.3.4.2 Prélèvement sur une tranche (ou portion individuelle) ...... 9
4.3.5 Poisson entier cru................................................................... 9
4.3.6 Mollusques crus ..................................................................... 9
4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits ...................................10
4.3.8 Volaille crue avec peau...........................................................10
4.3.9 Oeufs ..................................................................................10

4.3.10 Laits secs ............................................................................11
4.3.11 Produits chambrés ................................................................11
4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.)
et fromages gras .................................................................11
4.3.13 Produits secs déshydratés (exemple : épices, céréales,
légumineuses sèches, riz sec)................................................11
4.3.14 Graines de germes (luzerne, radis, mung, etc.).........................13
4.3.15 Analyse de surface par lavage ................................................13
4.3.16 Produits très salés (>5 %) .....................................................13
4.3.17 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d'érable, etc.) ...........13
4.3.18 Conserves ..........................................................................14
4.3.19 Fromages ............................................................................14
4.3.20 Éponges ..............................................................................14
5. DILUANTS ...............................................................................................14
5.1 Choix du diluant approprié ................................................................14
5.1.1 Diluant d'emploi général .........................................................14
5.1.2 Diluant à utiliser si les analyses incluent la recherche de
Salmonella spp......................................................................14
5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux .....................................................15
6. BROYAGE ET HOMOGÉNÉISATION ..............................................................15
6.1 Définitions......................................................................................15
6.1.1 Suspension mère (première dilution).........................................15
6.1.2 Dilutions décimales subséquentes .............................................15
6.2 Procédures .....................................................................................15
7. ANNEXE ..................................................................................................17
8. BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................18
9. APPROBATION .........................................................................................18

Préparation des échantillons pour l’analyse microbiologique
1. INTRODUCTION
Le prélèvement effectué dans le but de réaliser une analyse microbiologique est une
étape très importante de la chaîne analytique. Il est primordial de s'assurer de
l'intégrité et de la représentativité des échantillons. La méthode de prélèvement peut
influencer grandement les résultats obtenus. Cette méthode comprend les étapes de
l'arrivée des échantillons au laboratoire de microbiologie jusqu'au broyage des
échantillons, c’est-à-dire jusqu’à l’obtention de la suspension-mère. Les échantillons
doivent être en tout temps minutieusement manipulés en respectant l’ensemble des
règles d’asepsie de manière à éviter toute contamination.
L’ensemble des protocoles pour la fabrication des diluants mentionnés dans ce
document se retrouve dans le document 01-D-100.
2. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT DE BASE
Balance analytique de portée suffisante avec une précision de lecture de 0,1 g
ou appareil à dilution automatique (ex: Dilumat AES laboratoire), facultatif.
Bouillons d'enrichissement ou solutions de dilution en volume de 225 ml ±
2 % ou autres volumes, selon le cas.
Couteaux, fourchettes, spatules, forceps, ciseaux, scalpels, cuillères, etc.,
stériles.
Éthanol 70 % et 95 % pour flambage, si nécessaire.
Homogénéisateur de type péristaltique (Stomacher) avec des sacs stériles de
plastique.
Pipettes bactériologiques stériles de 10,0 ml.
Réfrigérateurs à 2 ± 2 o
C. Congélateurs à -20 ± 2 o
C.
Savons et détergents germicides
3. RÉCEPTION, ENTREPROSAGE ET DÉCONGELATION DES
ÉCHANTILLONS
3.1 Vérification des conditions de transport et de l’intégrité des
contenants
Lorsque les délais de transport (≤ 36 heures) et la température de conservation
(≤ 4 °C) des échantillons sont adéquats, vérifier les contenants afin de détecter tout
défaut physique. Inspecter minutieusement les sacs de plastique, les bouteilles et
autres contenants afin de vérifier s'il y a présence de trous, de fissures ou de perte
de liquide. Vérifier si l'eau de la glacière ne s'est pas infiltrée dans l'échantillon.
S'assurer que les sacs de plastique (type WhirlPak) soient très bien roulés et fermés
hermétiquement. N'importe laquelle des irrégularités citées précédemment invalide
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l'échantillon pour l’analyse microbiologique et le client concerné doit en être informé
afin de procéder à un autre prélèvement, si nécessaire.
3.2 Identification et enregistrement des échantillons
S'assurer que chaque échantillon est étiqueté et accompagné d'une demande
d'analyse ou d’un procès-verbal de prélèvement lui attribuant un numéro de
laboratoire officiel et renfermant l'ensemble de toutes les informations y étant
rattachées. Vérifier la correspondance entre la description de l'échantillon sur la
demande et la nature des échantillons expédiés. Compléter la description,
particulièrement si elle a un impact sur l’interprétation des résultats (exemples :
produit cuit, produit congelé, produit fermenté, etc.). Procéder aux enregistrements
et à la détermination des paramètres analytiques.
3.3 Entreposage des échantillons
Généralités
3.3.1 Dans des conditions optimales, on doit toujours analyser les échantillons
immédiatement, ou dans le plus court délai après leur réception au
laboratoire. Si exceptionnellement l'analyse doit être reportée, entreposer les
échantillons à -20 °C, à la température de la pièce, ou à 4 °C, selon la nature
de l’échantillon. L'interprétation des résultats devra tenir compte de cette
période d’entreposage.
Pour les Campylobacters thermotolérants et les bactéries anaérobies strictes,
ainsi que pour tout autre microorganisme dont la survie est susceptible d'être
fortement compromise par des conditions d'entreposage prolongées ou par
une congélation, l'analyse doit absolument être effectuée immédiatement
après leur réception ou selon les indications des points 3.3.2 et 3.3.3.
A moins d’indication contraire, les échantillons d'aliments périssables ne
doivent pas être entreposés plus de 36 heures à une température variant de 0
à 4 o
C entre le prélèvement et l’analyse au laboratoire. Les produits non
périssables, les conserves ou les aliments secs, doivent être conservés à la
température de la pièce dans un endroit réservé à cette fin. Les aliments
reçus congelés au laboratoire doivent être entreposés à -20 o
C jusqu'au
moment de l'analyse.
Afin de maintenir la chaîne de froid, les échantillons ne doivent pas séjourner
plus de 15 minutes hors du réfrigérateur.
Suite au prélèvement, les échantillons sont réfrigérés immédiatement. Par la
suite, ils sont congelés (-20 o
C) pendant une période à déterminer en fonction
des besoins. Les échantillons doivent toujours être classés et conservés dans
un endroit propre et à l'abri de toute contamination extérieure.
3.3.2 Préparation de l'échantillon pour le maintien de la viabilité des
Campylobacters thermotolérants lors d’un entreposage prolongé avant
analyse.
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Si la recherche de Campylobacter ne peut être effectuée lors de la réception,
ne jamais congeler l’échantillon. Une conservation à 4 °C pour 3 jours peut
être possible et est préférable. Si le produit est salé ou acide, l’analyse doit
être effectuée le plus tôt possible.
Si la période de conservation avant analyse est supérieure à 3 jours, le
protocole suivant doit être suivi.
1- Prélever 25 g d'aliment et diluer avec 75 ml de peptone-sel (5.1.1).
2- Homogénéiser au Stomacher. Éviter d’incorporer trop d’air dans le milieu.
3- Prélever 10 ml de l'homogénat et incorporer 90 ml de milieu Cary-Blair
diminué en agar (Annexe A ).
4- Conserver à 4 °C jusqu`à l'analyse.
Il est fortement recommandé d'effectuer l'analyse à l'intérieur d'un délai de
7 jours. Pour Campylobacter, la perte de viabilité est beaucoup plus
importante à 25 °C qu'à 4 °C.
3.3.3 Préparation de l'échantillon pour le maintien des cellules végétatives de
Clostridium perfringens lors d’un entreposage prolongé avant analyse.
Généralement, il est recommandé pour les épisodes de toxi-infections
alimentaires où l'on soupçonne Clostridium perfringens comme agent
étiologique, d’analyser les échantillons immédiatement, ou de les réfrigérer et
de les analyser le plus tôt possible. Ne jamais congeler à -20 °C.
Certaines souches perdent de la viabilité durant la réfrigération, mais la perte
serait plus grande lorsqu’elles sont congelées à -20 °C. Les aliments qui
doivent être entreposés pour plus de 48 heures devraient être traités avec un
tampon glycérol-sel (Annexe B) pour donner une concentration finale de 10 %
en glycérol et entreposé à -70 °C jusqu'à leur analyse. Les échantillons traités
avec le glycérol et expédiés dans la glace sèche présentent une perte de
viabilité minimale.
Lors de l'homogénéisation, mélanger au Stomacher pendant 2 minutes ou
manuellement en ayant pris soin d’enlever l’air du sac contenant l'échantillon.
3.4 Décongélation des échantillons
Habituellement, les échantillons sont décongelés à 2 - 4 o
C pendant un maximum de
18 heures. Si une décongélation rapide est nécessaire, ils peuvent être décongelés à
moins de 40 o
C pour une durée maximale de 15 minutes. Dans un tel cas, si
l'échantillon est décongelé rapidement dans un bain-marie, une agitation continuelle
doit être appliquée.
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4. PRÉLÈVEMENT ET PESÉE
4.1 Définitions
4.1.1 Échantillon : L’unité ou les unités d’échantillonnage prélevées pour l’analyse
par le client.
4.1.2 Unité composite : Regroupement des unités d’analyse ou d’échantillonnage
pour l’analyse.
4.1.3 Unité d’analyse : La quantité de produit prélevée de l’unité d’échantillonnage
pour analyse.
4.2 Mesures d’hygiène et de salubrité
4.2.1 La salle de prélèvement (murs et planchers) doit être, en tout temps,
exempte de poussières et de saletés. Avant chaque série de prélèvements, les
surfaces de travail doivent être lavées et désinfectées à l'aide d'un détergent
germicide reconnu. Des contrôles de la qualité de l'air et des surfaces de
travail doivent être effectués régulièrement.
4.2.2 Les manipulations doivent être effectuées toujours de façon aseptique. Le
personnel n'oubliera pas que les vêtements, les cheveux, les mains et l'air
expiré contiennent ou supportent toujours des microorganismes. Il évitera
soigneusement la contamination des produits étudiés. La propreté des mains
et des ongles est primordiale.
4.2.3 Pour certains travaux nécessitant une asepsie plus rigoureuse, une stérilité
(exemple : prélèvement du contenu des conserves) ou représentant un
danger pour la santé humaine, les prélèvements devront être effectués dans
une chambre stérile ou sous une hotte à flux laminaire. Les instruments
utilisés pour le prélèvement doivent toujours être stériles ou désinfectés,
selon le(s) microorganisme(s) recherché(s) et ne servir que pour un seul
échantillon. Ils doivent être nettoyés, stérilisés ou désinfectés de nouveau
avant chaque usage ultérieur. Les échantillons à prélever doivent être gardés
réfrigérés en tout temps. Afin de maintenir la chaîne de froid, les échantillons
doivent être sortis en petit nombre à la fois du réfrigérateur et pour un
maximum de 15 minutes à la température de la pièce.
4.3 Prise de l'unité d'analyse et pesée
4.3.1 Tous les aliments
Toute observation spécifique ou anormale du produit examiné, (exemples : mauvaise
odeur, présence de matière brune en suspension, couleur verdâtre) doit être
signalée. Lorsqu’une balance régulière est utilisée et que la quantité d'aliment
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prélevée est différente de 25 g, cela doit être noté dans le cahier des prélèvements.
Pour chaque pesée, le numéro d'échantillon et les initiales de la personne qui prélève
doivent être inscrits dans le cahier des prélèvements. Si un diluteur automatique est
utilisé comme balance, un enregistrement sur étiquette ou support informatique est
conservé.
L'extérieur des contenants des échantillons doit toujours être propre avant le
prélèvement. Nettoyer et désinfecter avec de l'éthanol 70 %, au besoin.
Peser 25 g de l'échantillon dans un sac stérile de polyéthylène ou un contenant de
verre stérile préalablement taré. En général, il est important de prélever au
minimum à 4 ou 5 endroits dans l'échantillon afin d'obtenir la représentativité.
Si l'aliment est composé de plusieurs éléments, chaque élément sera prélevé dans
une proportion sensiblement équivalente à celle qu'il représente; la prise de l'unité
d'analyse devra comporter des parties superficielles et des parties profondes dans les
mêmes proportions que dans l'aliment sauf lors de spécifications particulières.
Dans certains cas, lorsque spécifié par le professionnel, l'analyse de chaque portion
différente peut être réalisée séparément (exemple : sandwich, analyse de la
garniture seulement). Si la totalité de l'échantillon est de moins de 25 g, peser
l'échantillon au complet et additionner une quantité du diluant requis pour obtenir
une dilution 1 :10. Le volume total de liquide doit couvrir l'échantillon. À noter que
l’utilisation du poids pour l’ajout du diluant est considérée comme un moyen plus
fiable d’obtenir la dilution désirée.
4.3.2 Aliments liquides ou semi-liquides
Mélanger jusqu’à homogénéisation complète. S'il s'agit d'échantillons liquides,
prélever 25 g ou 25 ml et s’il s’agit d’échantillons semi-liquides, prélever 25 g.
4.3.3 Regroupement des unités d’analyse pour la recherche de bactéries
pathogènes telles Salmonella et Listeria monocytogenes (unité
composite)
Application
Les échantillons peuvent être regroupés par deux pour la recherche de Salmonella et
de Listeria monocytogenes, par exemple. Éviter de regrouper des échantillons relatifs
aux toxi-infections, aux plaintes de consommateurs et aux saisies particulièrement
pour la recherche de la bactérie pathogène incriminée.
Protocoles
Ne regrouper que des produits de composition et de caractéristiques physico-
chimiques similaires (Exemple : pH). Respecter les numéros de lots s'il y a lieu.
a) Dans les cas où le prélèvement sert également à l’analyse de bactéries
indicatrices, effectuer le regroupement de la façon suivante :
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Peser 25 g de chacun des échantillons (2) dans 2 sacs à Stomacher distincts.
Ajouter 225 ml de milieu d'enrichissement à salmonelles ou autre, selon le
pathogène recherché et homogénéiser au Stomacher séparément. Prélever les
aliquotes nécessaires aux analyses des bactéries indicatrices ( Ex : E. coli) et
autres, si requis. Par la suite, combiner les 2 homogénats dans le même sac
en transvidant et poursuivre l’analyse.
Note. Le milieu de pré-enrichissement utilisé ne doit pas avoir d’effet
inhibiteur sur l’ensemble des bactéries recherchées, sinon, effectuer un
autre homogénat avec de l’eau peptone-sel 0,1 %.
b) Si l’analyse d’un pathogène seulement est requise :
Peser 25 g de chacun des 2 échantillons dans un même sac. Ajouter 225 ml
du diluant approprié et homogénéiser les 2 prélèvements ensemble au
Stomacher. Par la suite, ajouter un autre 225 ml de diluant à l’homogénat et
homogénéiser manuellement. Incuber et poursuivre l’analyse. Si le résultat
s'avère positif, reprendre l'analyse des 2 échantillons distinctement, si
nécessaire, ou refaire prélever par le client.
4.3.4 Viandes
4.3.4.1 En bloc
Prélever le premier centimètre de surface à 4 ou 5 endroits à l'aide d'un instrument
stérile.
4.3.4.2 Prélèvement sur une tranche (ou portion individuelle)
Ce prélèvement s’applique sur les parties superficielles et profondes. Dégager, si
nécessaire, la tranche de son emballage au moyen des ciseaux ou du bistouri puis la
placer sur le plateau en l'étalant complètement.
Au moyen de la pince et du couteau, prélever une languette en effectuant deux
sections parallèles à 1 cm de distance dans la partie médiane de la tranche et
perpendiculairement à son grand axe. Découper cette languette en plus petits
fragments qui seront placés dans le sac de plastique prévu à cet effet.
4.3.5 Poisson entier cru
Enlever la peau à l'aide d'instruments stériles et prélever le premier centimètre de
surface à 4 ou 5 endroits.
4.3.6 Mollusques crus
- Les coquilles des mollusques doivent être lavées et brossées à l'eau potable
courante jusqu'à ce que les crevasses et les interstices soient propres et
exempts de boue.
- Rincer à l'eau du robinet et assécher avec un essuie-tout.
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- Une manipulation supplémentaire peut être effectuée si requise, en
désinfectant la surface des coquilles avec de l'alcool 70 % particulièrement
près de l'ouverture. Utiliser des instruments stériles pour ouvrir les coquilles.
Récupérer le liquide et détacher la chair avec un couteau et des pinces en
évitant toute contamination par l’extérieur de la coquille.
- S'il y a présence de byssus, le couper aux ciseaux avant ouverture, mais ne
pas l'arracher.
4.3.7 Crustacés non décortiqués crus ou cuits
Les crustacés tels que le homard et le crabe sont décortiqués avec des instruments
stériles et la chair est prélevée à l'aide de pinces stériles à 4 ou 5 endroits de
l'échantillon.
Les petites crevettes sont décortiquées à l'aide de pinces stériles et la chair en est
prélevée. Plusieurs crevettes constituent alors l’unité d’analyse.
4.3.8 Volaille crue avec peau
En général, prélever une proportion peau et muscle (premier centimètre) à 4 ou 5
endroits sur la coupe de volaille.
Pour les volailles entières crues, la recherche de salmonelles est préférablement
effectuée sur 25 g de muscles pectoraux et de peau.
4.3.9 Oeufs
4.3.9.1 Procédure de prélèvement pour la détection des salmonelles sur la
coquille et à l'intérieur des œufs
Faire un groupe de 4 ou 6 oeufs par échantillon. Ceux-ci ne doivent avoir aucune
craquelure.
Extérieur
À l'aide d'une pince stérile, prendre les oeufs et les déposer doucement dans un sac
stérile contenant 225 ml d'eau peptonée tamponnée. Laver les coquilles délicatement
avec le diluant, puis les retirer (toujours à l'aide de la pince) et les déposer dans un
contenant d'éthanol 70 %.
L'eau peptonée tamponnée est par la suite incubée à 35 o
C.
Intérieur
Les oeufs sont retirés immédiatement du bain contenant l'éthanol 70 % (étape
précédente) et déposés sur un papier absorbant pour enlever l'excès d'alcool. Ne pas
laisser tremper les œufs dans l’alcool. Par la suite, permettre un temps de contact
de 10 minutes. Les 4 à 6 oeufs sont cassés dans un sac stérile. Le technicien doit
porter une nouvelle paire de gants entre chacun des échantillons (4 à 6 œufs).
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Bien mélanger au Stomacher les oeufs pendant environ 30 secondes. Avec une
pipette stérile, prélever 50 g (pour 4 à 6 œufs) du mélange et ajouter environ 200
ml d’eau peptonée tamponnée. Agiter au Stomacher 2 minutes et compléter à 500 g
avec le diluant afin d’obtenir la dilution 1 :10.
4.3.9.2 Procédure pour analyse de l’intérieur seulement
Laver les oeufs à l'eau et au savon germicide. Nettoyer à l'éthanol 70 % à l'aide d'un
coton stérile et laisser sécher (une précaution supplémentaire peut être apportée en
flambant l’œuf à l'extrémité opposée de la chambre d'air jusqu'à ce qu'une très
mince couche d'albumen soit coagulée et collée sur la coquille). Briser délicatement
la coquille avec un couteau stérile ou en portant des gants stériles pour dégager
l'intérieur de l’œuf.
4.3.10 Laits secs
Mélanger soigneusement le contenu du récipient fermé en secouant manuellement
de façon répétée. Peser 25 g de l'échantillon directement dans le flacon contenant
225 ml de diluant réchauffé à 40 o
C. Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes
à température de la pièce est nécessaire avant d'homogénéiser. Cette étape
consiste à revivifier les cellules microbiennes endommagées.
Agiter 25 fois le flacon afin d'homogénéiser le produit dans le diluant. Laisser la
mousse se disperser avant d'effectuer la prise d'essai (3 minutes au maximum).
Note : Dans le but d'avoir une meilleure reconstitution, en particulier pour certaines
poudres difficiles à dissoudre, il peut être utile d'employer des billes de
verre préalablement stérilisées.
4.3.11 Produits chambrés
Les diluants utilisés pour les produits chambrés doivent être à la température de la
pièce.
4.3.12 Produits gras (beurre, margarine, saindoux, etc.) et fromages gras
Utiliser un diluant contenant du citrate de sodium 2 % comme dispersant. Utiliser le
diluant préalablement chauffé à 45 o
C pour permettre une émulsion complète du
gras avant l'homogénéisation. Homogénéiser et prélever dans la phase aqueuse en
évitant de prélever du gras. Ensemencer dans les 15 minutes.
4.3.13 Produits secs déshydratés (exemples : épices, céréales,
légumineuses sèches, riz sec)
Mélanger soigneusement les échantillons secs avec un ustensile stérile avant de
prélever.
Un pré-trempage dans le diluant de 30 minutes à température de la pièce est
nécessaire avant d'homogénéiser. Cette étape consiste à revivifier les cellules
microbiennes endommagées.
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Note : Pour la recherche de Salmonella spp., des rapports de dilution
(poids/volume) entre les épices ou assaisonnements et le bouillon
d’enrichissement sont recommandés (autre que 1 : 10). Certaines épices
sont bactéricides ou bactériostatiques, c’est pourquoi une dilution supérieure
est nécessaire (voir page suivante).
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Rapport recommandé entre les épices et les assaisonnements et le bouillon de
pré-enrichissement (p/v)1
Aneth, graines 1:10 Macis, poudre 1:10
Anis vert 1:10 Marjolaine 1:10
Arrow-root, poudre 1:10 Menthe, flocons 1:20
Assaisonnement à l'italienne 1:20 Menthe, poudre 1:10
Assaisonnement (suprême) 1:10 Moutarde, graines 1:10
pour salade Muscade (noix entières) 1:10
Basilic, feuilles 1:20 Oignon, poudre 1:10
Orange, morceaux 1:10
Cannelier, fleurs 1:20 Origan, feuilles 1:50
Cannelle, bâtons 1:10 et 1:100
Cardamome, graines 1:10 Paprika 1:10
Cari, poudre 1:10 Pavot, graines 1:10
Carvi, graines 1:10 Persil, flocons 1:20
Casse, bourgeons Piment de la Jamaïque 1:10 et 1:100
Casse, poudre 1:50 Piment de la Jamaïque, poudre 1:20 et 1:100
Céleri, flocons 1:20 Piment du Chili, entier 1:10
Céleri, graines 1:10 Poivre au citron 1:50
Cerfeuil, feuilles 1:20 Poivre blanc 1:10
Champignons, tranches 1:20 Poivre de Cayenne 1:10
Ciboulette hachée 1:20 Poivre, grains 1:10
Clou de girofle 1:50 et 1:1000 Poivre noir 1:10
Coriandre, graines 1:10
Crème de tartre 1:10 Romarin, feuilles 1:10
Cumin, graines 1:10
Curcuma, poudre 1:10 Safran 1:20
Sarriette moulue 1:50
Estragon 1:20 Sauge, feuilles 1:20
Épices pour tarte à la
citrouille
1:50 Sésame, graines 1:10
Fenouil, graines 1;10 Thym, poudre 1:50
Fines herbes pour salade 1:10
Zeste de citron 1:10
Gingembre, racine 1:10
Laurier, feuilles 1:20
Légumes, flocons 1:20
Pour la poudre ou les flocons d’ail ou d’oignons, utiliser du bouillon
trypticase renfermant 0,5 % de K2SO3 (rapport 1 : 10).
1
Modifié le tableau pour s’adapter à la méthode MFHPB-20.
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4.3.14 Graines de germes (luzerne, radis, mung, etc.)2
1.Peser de façon stérile 125 g de graines dans un contenant stérile (par exemple, un
ou deux grands plats de Pétri de 14 cm) et ajouter de l'eau distillée stérile jusqu'à ce
que le niveau dépasse les graines. Recouvrir de façon stérile et incuber à 30 °C
pendant trois jours.
2. Le premier volume d'eau ajouté sera absorbé après environ deux heures. Ajouter
encore de l'eau pour rétablir le niveau. Continuer de surveiller le niveau d'eau
pendant le reste de la période d'incubation et en ajouter encore au besoin.
3. Après trois jours d'incubation, les enveloppes devraient avoir éclaté et une
certaine germination devrait être apparente. Il faut plus de temps à certaines graines
qu'à d'autres pour germer, mais trois jours devraient suffire dans la plupart des cas.
Peser de façon stérile 25 g de la «boue» germée (c.-à-d. mélange de graines
germées et d'eau) et ajouter à 225 mL de bouillon nutritif pour pré-enrichissement
pendant la nuit. Exécuter la méthode MFHPB-20.
4.3.15 Analyse de surface par lavage
Il arrive que le produit alimentaire ou un contenant ne soit contaminé qu'en surface
ou encore que sa flore superficielle présente un intérêt particulier pour le contrôle.
Dans ces cas, une homogénéisation par broyage n'est pas effectuée ; les
microorganismes superficiels doivent être délogés pour les mettre en suspension. Les
résultats peuvent être rapportés soit par poids de l'aliment, soit par la surface totale
analysée ou simplement par la présence ou l’absence du microorganisme recherché.
En règle générale la surface à analyser est mise en contact avec un diluant
approprié, contenant fréquemment un agent tensioactif non bactéricide (exemple :
tween 80), et une agitation manuelle est effectuée. Éviter d'ajouter trop de diluant
qui entraînerait une dilution trop grande. Il faut suffisamment de diluant pour
permettre un bon lavage de la surface. Puis, prélever la suspension microbienne à
l’aide d’une pipette pour analyse subséquente. Le volume de diluant obtenu est noté
pour permettre de calculer le compte pour la surface totale.
4.3.16 Produits très salés (>5 %)
Pour le dénombrement de la microflore générale (bactéries, levures et moisissures),
le diluant utilisé doit contenir 5 % de NaCl. Utiliser ce diluant pour la suspension-
mère et les dilutions subséquentes. Par la suite, choisir le milieu de culture
nécessaire pour éviter les effets de la pression osmotique.
4.3.17 Produits très sucrés (miel, sucreries, sirop d’érable, etc.)
Pour la recherche d’une microflore générale (numération bactérienne des levures ou
des moisissures) lorsqu’un aliment renferme plus de 25 % de sucre, utiliser un
diluant à 40 % de sucre (exemple : eau peptonée 0,1 % + 40 % dextrose) afin
d’éviter la perte des cellules osmophiles. Utiliser ce diluant pour la suspension mère
et les dilutions décimales subséquentes. Le milieu de culture devra aussi contenir
40 % de sucre.
2
Modifié la procédure de germination pour s’adapter à la méthode MFHPB-20A.
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4.3.18 Conserves
Se référer à la méthode 01-M-020.
4.3.19 Fromages
Lorsque la croûte de fromage est consommable, elle doit être prélevée
représentativement en fonction de la proportion qu’elle représente (exemple :
plusieurs pointes à différents endroits). Selon l’analyse à effectuer, si les moisissures
utilisées pour l’affinage de certains fromages provoquent de l’interférence pour la
lecture des résultats, enlever la croûte avant de prélever l’unité d’échantillonnage.
4.3.20 Éponges
À la réception de l’échantillon, il est considéré que la dilution est 10-1
. Le diluant
approprié est ajouté jusqu'à l’obtention d’un poids de 100 g (10-2
).
5. DILUANTS
Le choix d’un diluant est fonction du produit à analyser; également le type de
microorganisme à rechercher peut être un facteur déterminant dans le choix d’un
diluant. Se reporter aux normes spécifiques des produits et à la méthode d’analyse.
Lorsque les analyses ne requièrent pas la recherche de salmonelles, le diluant
général « Peptone-Sel » (selon la norme ISO 6887 ) semble le plus approprié pour la
majorité des aliments.
5.1 Choix du diluant approprié
5.1.1 Diluant d’emploi général
Peptone-sel
Peptone 1,0 g
Chlorure de sodium 8,5 g
Eau 1 000 ml
Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC.
pH final : 7,0 ± 0,2
5.1.2 Diluant à utiliser si les analyses incluent la recherche de Salmonella
spp.
Eau peptonée tamponnée
Peptone 10,0 g
Chlorure de sodium 5,0 g
Phosphate disodique (Na2HPO4) 3,5 g
Dihydrogénophosphate de potassium (KH2PO4) 1,5 g
Eau 1 000 ml
Dissoudre les ingrédients et distribuer. Stériliser 15 minutes à 121 ºC.
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pH final : 7,2 ± 0,2
5.2 Bouillons d’enrichissement initiaux
Lors du regroupement des unités d’échantillonnage et pour les unités
d’échantillonnage d’un poids supérieur à 25 g, tous les bouillons d’enrichissement
initiaux doivent être chauffés à environ la température d’incubation avant de
procéder à la dilution des échantillons avec le bouillon, à l’exception d’une analyse
dont la température d’incubation est supérieure à 35 ºC, telle que E. coli O157 ou
Shigella spp. Le bouillon de ces analyses doit être préchauffé à environ 35 ºC. Le
bouillon préchauffé doit être utilisé dans la journée.
Pour les bouillons d’enrichissement secondaire, ainsi que pour les unités
d’échantillonnage de 25 g ou moins, il est acceptable que la température du bouillon
soit augmentée seulement à la température ambiante avant de procéder à l’analyse.
6. BROYAGE ET HOMOGÉNEISATION
6.1 Définitions
6.1.1 Suspension mère (première dilution)
Suspension, solution ou émulsion obtenue après qu’une quantité pesée (unité
d’analyse) du produit à analyser ait été mélangée, si nécessaire, en utilisant un
homogénéisateur et en observant des précautions appropriées, avec une quantité
neuf fois égale de diluant, sauf exception, en laissant se déposer les particules
grossières, s’il y en a.
Note 1 : Dans certains cas, il peut être nécessaire d’ajouter davantage de diluant,
notamment pour les produits donnant une suspension mère 1:10 trop
visqueuse ou trop épaisse. On devra en tenir compte dans la suite des
opérations et dans l’expression des résultats.
Note 2 : Cette première dilution permet une limite de détection minimum de
10 UFC (unité formant une colonie) par gramme. S’il est souhaitable pour
certains dénombrements dans certains produits de descendre au-dessous
de ce seuil, il est possible de réaliser une suspension avec une quantité
inférieure de diluant. Par contre, il doit être convenu que l’ensemencement
de cette suspension peut éventuellement entraîner des difficultés liées au
déséquilibre du rapport inoculum/milieu.
6.1.2 Dilutions décimales subséquentes
Suspensions ou solutions obtenues en mélangeant un volume déterminé de la
suspension mère avec un volume neuf fois égal de diluant, et en répétant cette
opération sur chaque dilution ainsi préparée, jusqu’à l’obtention d’une gamme de
dilutions décimales appropriées pour l’inoculation des milieux de culture.
6.2 Procédures
Il est suggéré d'utiliser un homogénéisateur de type péristaltique (Stomacher) plutôt
qu'un mélangeur de type rotatif pour le broyage des échantillons. Une
01-D-550 Page 16 de 18 AEV 2007-09-13

homogénéisation complète de l'aliment n'est pas nécessaire. Les microorganismes
seront délogés de l'échantillon par de forts jets de liquide et par l'écrasement de
l'aliment. Habituellement, l'aliment devrait être homogénéisé pour une période d’
une minute et demie. Selon la consistance, l'homogénéisation peut être prolongée
jusqu'à 2 minutes.
L'homogénéisateur péristaltique ne doit pas être utilisé pour certains produits
alimentaires tels que :
- les produits risquant d'entraîner des perforations du sac (présence de particules
pointues, dures ou sèches);
- les produits difficiles à homogénéiser de par leur texture (par exemple :
saucisson sec).
Dans ces cas, l’homogénéisation manuelle est privilégiée.
La distribution des microorganismes dans un aliment est plus ou moins uniforme.
Pour assurer une meilleure répartition des microorganismes, agiter les échantillons
liquides et semi-liquides environ 25 fois. La période entre l'agitation et le
prélèvement ne devrait pas excéder 3 minutes.
Après le broyage ou l'homogénéisation, la suite de l'analyse (les dilutions et
l'ensemencement) doit avoir lieu le plus rapidement possible pour éviter une
multiplication des microorganismes dans le liquide de dilution enrichi par le produit
alimentaire broyé et plus ou moins dissous. L'ensemble des manipulations, de la
suspension mère jusqu'à l'ensemencement sur gélose ou bouillon, doit être effectué
dans un délai maximum de 45 minutes.
Après l’homogénéisation, laisser les grosses particules se déposer, si nécessaire,
pendant 15 minutes au maximum.
Ne pas attendre plus de 10 minutes entre les dilutions décimales et l'incorporation à
la gélose.
Une partie de l'homogénat peut être conservée au congélateur à -20 o
C suite à
l'ajout de glycérol (en concentration finale de 10 %).
MESURE DU pH des DILUANTS ET DES BOUILLONS D’ENRICHISSEMENT ;
Bien que cela ait été mentionné dans les versions précédentes de certaines
méthodes, l’ajustement du pH du diluant avec la matrice alimentaire avant
l’ensemencement n’est pas recommandé pour les méthodes quantitatives, sauf
lorsque précisé par le fabricant (par exemple 3M exige un ajustement pour les
Petrifilm). Ceci permet au produit d’être évalué tel que présenté au consommateur,
empêchant tout biais (positif ou négatif) qui en découlerait si le pH était ajusté avant
l’ensemencement. Ce point sera corrigé dans les versions révisées de ces méthodes.
Pour les méthodes qualitatives l’ajustement du pH du bouillon d’enrichissement avec
la matrice alimentaire est encore nécessaire s’il est mentionné dans la méthode.
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7. ANNEXE
A – Milieu de conservation Cary-Blair. (optimisé pour Campylobacter spp. )
Thioglycolate de sodium……………………………1,5 g
Phosphate disodique………………………………….1,1 g
Chlorure de sodium................................5,0 g
Chlorure de calcium………………………………….0,09 g
Pyruvate de sodium…………………………………….10 g
Agar…………………………………………………………….1,6 g
Dissoudre les ingrédients dans 1 litre d’eau purifiée. Chauffer doucement jusqu’à
ébullition pour dissoudre l’agar. Ajuster le pH à 8,4. Distribuer et stériliser par
vapeur d’eau pendant 15 minutes.
pH final : 8,4 ± 0,2
B- Milieu tamponné glycérine-sel
Glycérol………………………………………………….100 ml
Phosphate dipotassique…………………………12,4 g
Phosphate monopotassique…………………….4,0 g
Chlorure de sodium…………………………………4,2 g
Dissoudre le chlorure de sodium dans environ 500 ml d’eau purifiée et y ajouter le
glycérol et les phosphates. Ajuster le pH à 7,2 et compléter à 1000 ml. Distribuer et
stériliser à l’autoclave à 121 ºC pendant 15 minutes.
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8. BIBLIOGRAPHIE
Bacteriological Analytical Manual, 2003, Division of Microbiology, Center for Food
Safety and Applied Nutrition, U.S. Food and Drug Administration, Chapitre 1-Food
sampling and preparation of sample homogenate.
BOURGEOIS, C.M. et J.Y. LEVEAU, 1991, Techniques d'analyse et de contrôle dans
les industries agro-alimentaires : Le contrôle microbiologique, Chapitre 2, 2e
édition,
Lavoisier - Tec & Doc, Paris. 572 p.
VANDERZANT, C. et D.F. SPLITTSTOESSER, 1992, Compendium of Methods for
Microbiological Examination of Foods, Chapitre 2, 3e
édition, APHA, U.S., 1219 p.
Analyse microbiologique, 1996, Méthodes sectorielles, Tome 2, Contrôle de la qualité
des produits alimentaires, AFNOR, 6e
édition.
LUECHTEFIELD, N.W., WANG, W.-L., BLASER, M.J., & L. RELLER, Evaluation of
Transport and Storage Techniques for Isolation of Campylobacter fetus subsp jejuni
from Turkey Meat Specimens, J Clin Microbiol. 1981 Mar ;13:438-43
Compendium des méthodes pour l’analyse microbiologique et la détection de
matières étrangères dans les diluants, Méthodes officielles pour l’analyse
microbiologique des aliments, Volume 1 - Annexe I 2003 et supplément à l’annexe I
juin 2005, Direction générale de la protection de la santé, Santé Canada,
Gouvernement du Canada.
Compendium des méthodes pour l’analyse microbiologique et la détection de
matières étrangères dans les diluants, Méthodes officielles pour l’analyse
microbiologique des aliments, Volume 2 – Méthode MFHPB-20, Isolement et
identification des Salmonella dans les aliments (Tableau V), ainsi que MFHPB-20A,
Modification de la procédure MFHBP-20 pour l’analyse de graines utilisées dans la
production de semences, Direction générale de la protection de la santé, Santé
Canada, Gouvernement du Canada.
9. APPROBATION
Christine Barthe, Microbiologiste
Kim Weaver, Technicienne qualité technique au service de microbiologie
Daniel Tremblay, Chef du Service de la microbiologie
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