3. Enzimas responsáveis pela replicação
1 Rompem as pontes de hidrogênio às
custas da energia de hidrólise do ATP,
5
entre as bases.
2 Sintetiza o iniciador (primer):
1 + 2 = complexo de iniciação da
1 replicação (CIR).
2
3 Duas DNA polimerase (I e III)
acoplam-se ao CIR e iniciam o
alongamento da cadeia, uma na fita
contínua (leading) e outra na fita
descontínua (lagging).
DNA pol III - 30.000/min
DNA pol I –600/min.
3
4 Une a extremidade 5´fosfato de um
fragmento novo à extremidade 3´- OH
do próximo
5 Diminuem o grau de
4 superenrolamento do DNA no ponto
de origem da replicação
4. O RNA ou ARN
O Ácido Ribonucléico é um polinucleotídeo que difere do DNA
em três aspectos básicos:
O açúcar é uma Ribose;
DNA
É formado, geralmente, por
A-T
T-A uma fita simples que pode
G-C enrolar-se;
C-G
Não existe a base pirimídica
Timina e no seu lugar se
encontra a base Uracila.
Os pareamentos seguem a
RNA ordem A-U e G-C).
A-U
U-A
G-C
C-G
5. Tipos de RNA
RNAm O RNA mensageiro é formado no núcleo e
contém a “mensagem” - o código transcrito a partir do DNA -
para a síntese das proteínas. Cada conjunto de três
nucleotídeos no RNAm é chamado de CÓDON.
RNAt O RNA transportador está presente no citoplasma e
é responsável pelo transporte dos aminoácidos até os
ribossomos para a síntese protéica. No RNAt existe uma
seqüência de nucleotídeos correspondente ao códon
chamada de ANTI-CÓDON.
RNAr O RNA ribossômico ou ribossomal faz parte da
estrutura dos ribossomos e participa do processo de
tradução dos códons para construção das proteínas.
6. Regulação gênica
As regulações metabólicas são catalisadas por enzimas;
A transcrição e a tradução dirigem a síntese de proteínas,
muitas das quais servem como enzimas;
Síntese de proteínas requer gasto energético;
Regulação da síntese protéica é importante para a economia
energética celular;
Produção de proteínas necessárias em momentos específicos
7. Genes
Muitos genes, em torno de 60 a 80% não são
regulados, são constitutivos, ou seja seus produtos são
constantemente produzidos em velocidade fixa.
Produção de outras enzimas é regulada, de modo que
estejam presentes somente quando necessário.
Apenas 1% do DNA é transcrito em RNAm codificante
de proteínas e até 10% do DNA são transcritos em
RNA
8. Tipos de genes
Os que já funcionaram em uma fase anterior e atualmente não
funcionam mais
Os que estão em funcionamento em um determinado
momento
Os que ainda irão funcionar mais tarde
Os que funcionam sempre
9. Controle da expressão gênica
Controle do que é expresso pode ocorrer em vários níveis:
Transcrição
Processamento
Transporte do RNAm
Tradução
Pós-tradução
Funcionamento enzimático
10. RNA polimerase
Na maioria dos procariontes, uma única espécie de RNA
polimerase transcreve todos os tipos de RNA.
RNA polimerase consiste em quatro tipos de subunidades:
Beta: 150.000 dáltons (β); beta primo: 160.000 dáltons (β’);
alfa: 40.000 dáltons (α); sigma: 70.000 dáltons (σ)
11. Estrutura do RNA polimerase
O cerne da enzima contém dois polipeptídios α, um polipeptídio
β e β’.
A adição da subunidade α permite a iniciação nos sítios
promotores, formando uma holoenzima
β’ α β’
α
+ σ
α β α σ β’
Fator sigma
Cerne da enzima Holoenzima
12. Subunidades da RNA polimerase de
E. coli
• Grande e complexa, a holoenzima RNA polimerase de E. coli possui 5 tipos de
subunidades.
•Seu centro catalítico se encontra no chamado cerne da enzima (a2bb’).
•E, além das funções descritas no quadro1, a RNA polimerase também interage
com proteínas ativadoras e repressoras que modulam a taxa de expressão gênica
nas células.
13. Transcrição do DNA
• Quando se escreve um seqüência de nucleotídios
correspondente a um gene
•A seqüência é sempre escrita no sentido 5'-> 3'
15. A enzima RNA-polimerase abre
a dupla hélice do DNA;
Inicia-se a produção de uma
molécula de RNAm, no sentido
5’ 3’
Os nucleotídeos são ligados
respeitando a ordem A-U, G-C.
Fita de RNA
em Fita molde Finaliza a transcrição quando
formação DNA
a RNA-polimerase se desliga
do DNA, a molécula de RNAm
primário está formada e segue
para o citoplasma onde será
traduzida.
16. Iniciação
Regiões que indicam o inicio da transcrição
em procariontes são chamadas de
promotores
Seqüenciais promotoras em 13 pontos
diferentes de inicio de transcrição no
genoma E. coli.
17. A Unidade de T ranscrição
A transcrição de um segmento se inicia quando a RNA polimerase
reconhece e liga-se a seqüências específicas de nucleotídios em uma
região especial, no início do gene, denominada promotor
Além destas seqüências, o promotor engloba o ponto de início:
Primeiro par de bases a ser transcrito em RNA
A partir daí a RNA polimerase move-se ao longo do molde,
sintetizando RNA, até alcançar uma outra seqüência específica
que sinaliza o término da transcrição.
Unidade de transcrição estende-se do ponto de início (+1) no
promotor, até o terminador
18. Unidade de transcrição
Diagrama representativo de um promotor genérico de E. coli. As caixas -35 e -10
(também chamada caixa de Pribnow ou caixa TATA) são muito conservadas entre
distintos promotores.
Pequenas variações nestas seqüências podem reduzir drasticamente a afinidade do
fator sigma da RNA pol pelo promotor.
A base +1 é, por convenção, aquela onde se inicia a transcrição. A RNA pol, uma
vez acoplada ao promotor, ocupa cerca de 5 voltas do DNA.
19. Reconhecimento do P romotor
Para que este processo ocorra é necessário, antes de mais
nada, que a RNA polimerase identifique sinais
específicos no DNA, os quais direcionarão a transcrição
de genes específicos no momento adequado
Uma enorme variedade de sinais pode ser encontrada
nas regiões promotoras de diferentes genes.
É por este motivo que os promotores são locais
extremamente importantes no controle da expressão
gênica
20. Promotor
Existe, um consenso em torno de sua seqüência.
A primeira base transcrita em RNA com a base +1 = seqüência de
consenso de um promotor da bactéria Escherichia coli.
A freqüência com que um promotor é ligado e o gene é transcrito
pela RNA pol, está diretamente associada à homologia com a
seqüência de consenso.
consenso
É através da variação das seqüências nas duas caixas (conhecidas
como caixa TATA, ou caixa de Pribnow, e caixa -35) que é modulada a
transcrição relativa dos genes constitutivos (aqueles que são
expressos o tempo todo durante a vida da célula).
Um gene cujo produto deva ser abundante tem um promotor com
seqüência mais próxima ao consenso
21. Processo de T ranscrição
•Diz-se que as seqüências que antecedem o ponto de início localizam-se à
montante (upstream) e as que o sucedem localizam-se à jusante
(downstream)
•A posição das bases é numerada nos dois sentidos, a partir do ponto de
início, ao qual se atribui o valor +1. Os valores aumentam (valor positivo) à
jusante e diminuem (valor negativo) à montante
•A taxa de transcrição gênica também pode ser afetada pela ligação de
proteínas ativadoras e repressoras a sítios próximos aos pontos de
iniciação e pela distância entre as seqüências de consenso dos promotores,
sendo a separação ideal igual a 17 nucleotídeos (em procariotos).
22. Região consenso
Essas seqüências podem ser bastante variáveis, porém, mantêm
conservadas regiões responsáveis pela função promotora.
Em procariotos, duas dessas regiões:
10 pb = 5´ TATATT 3´
35pb = 5' TTGACA 3’
23. Processo de T ranscrição
Regiões chamadas de -35 e -10 devido as suas localizações
relativas ao ponto de inicio de transcriçao
A subunidade σ permite que a RNA polimerase reconheça
(sinalização) e se ligue especificamente a regiões de
promotores
A holoenzima procura um promotor e inicialmente se liga
frouxamente a ele, reconhecendo as regiões -35 e -10
Forma uma estrutura chamada “complexo promotor fechado”
fechado
A partir daí a enzima se liga fortemente, deselicoizando bases
próximas a região -10.
24. Probabilidades dos arranjos
O arranjo particular da estrutura do promotor permite que, com apenas um
par de 6 bases (cada caixa consenso tem em geral uma dúzia de bases) um
promotor seja determinado com imensa precisão.
O que queremos dizer com isto?
Podemos formular a questão de outra forma: qual a probabilidade de uma
seqüência de 6 bases ocorrer ao acaso no DNA?
Para cada base a probabilidade de ser um T, digamos, é 1/4, pois podemos
ter T, A, G ou C.
O mesmo se aplica para as demais bases da seqüência, portanto, a
probabilidade de se ter a seqüência TAATTA, por exemplo:
¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = (¼ )6 ~ 1/4000
25. Considerações
Não é uma probabilidade muito pequena, considerando que há de
2 a 10 milhões de bases num genoma procarioto.
O encontro de uma tal seqüência não pode ser fortuito!
Embora se tenha mais liberdade em alterar a seqüência da região
promotora fora das caixas de consenso, não podemos retirar nem
acrescentar bases entre as caixas, porque a distância entre elas
deve ser mantida.
Chegamos, então, a um importante conceito na biologia
molecular: distância também é informação.
O fator σ deve reconhecer as duas caixas de consenso. primeiro a
TATA e depois a -35 e para tal elas devem estar a uma
determinada distância entre si.
26. Alogamento
O RNA é sempre produzido no sentido 5’- 3’
Durante essa fase, o RNA recém-sintetizado pareia-se
temporariamente com a fita molde de DNA = híbrido curto RNA-
DNA.
Diferentemente da DNA polimerase, a RNA polimerase não tem
atividade de nuclease, ou seja, não revisa a cadeia de RNA
nascente.
Conseqüentemente, a fidelidade da síntese de RNA (transcrição) é
bem menor que aquela observada para o DNA (replicação).
Os RNAs sintetizados que apresentarem problemas serão
degradados e têm pouca probabilidade de serem prejudiciais,
uma vez que outros transcritos serão rapidamente produzidos.
27. Regiões Terminadoras
A análise de muitas dezenas de regiões terminadoras mostrou
que sua sequência apresenta características comuns, que
comuns
podem ser resumidas da seguinte forma:
Na fita de DNA que está servindo de molde para a síntese do
RNA surge uma sequência com cerca de 8 bases que, após um
espaçador de tamanho variável (4 a 15 bases, em geral),
É seguida de outra sequência complementar a ela, porém em
sentido contrário;
Logo após esta região simétrica há uma sequência longa de
Timinas (um poliT), na fita 5’-3’.
Esta estrutura, conhecida como grampo de terminação, sinaliza
terminação
para a polimerase que ela deve terminar a síntese de RNA.
28. Sinais de início e término da síntese de RNA pela RNA polimerase bacteriana.
O sinal de início é o promotor, reconhecido pelo fator sigma.
O sinal de término é reconhecido a posteriori (isto é, pela estrutura formada no RNA),
e tem, no DNA uma sequencia poli-T.
29. Término
O final da transcrição é um processo bem
controlado no qual seqüências típicas dos
transcritos de RNA (sinais de término) indicam o
local para a finalização da síntese dessa molécula.
Na bactéria E. coli existem no mínimo duas classes
de seqüências de sinalização do término da
transcrição:
uma utiliza a proteína r (rho)
outra não (rho-independente).
30. Formação do grampo de
finalização
O pareamento intramolecular das seqüências complementares do
RNA recém-sintetizado forma uma estrutura em grampo. Esse
acontecimento desencadeia os seguintes eventos:
Parada da RNA polimerase:
Destruição parcial do híbrido RNA-DNA (proporcionando
instabilidade da região que permanece ligada);
Dissociação do RNA nascente da enzima RNA polimerase
Restabelecimento da região dupla-fita do DNA;
Liberação da RNA polimerase da fita molde do DNA.
32. Afinal, qual é o destino dos RNAs na
bactéria?
A verdade é que a vida média de um mRNA bacteriano é muito
curta, raramente ultrapassando 60 segundos;
Por isso, um mRNA só é necessário por breves instantes, sendo
em seguida descartado.
No caso dos mRNA de procariotos, a sua degradação é
controlada por um processo engenhoso.
A transcrição e a tradução estão de tal forma acopladas
que, imediatamente após a síntese de um pequeno trecho de
mRNA, os ribossomos já se ligam a este RNA nascente,
protegendo-o da degradação pelas RNases bacterianas.
33. Mecanismo de transcritos
Uma primeira categoria em que se dividem os mecanismos reguladores, é
a que consiste em ligar (indução) ou desligar (repressão) óperons em
resposta a alterações ambientais (este sistema têm maior significância entre
os microorganismos).
A segunda categoria envolve o desencadeamento de circuitos pré-
programados de óperons.
Existem três categorias de genes:
o regulador
o operador
os estruturais;
34. O modelo ÓPERON LAC:
O regulador controla o operador e este, os estruturais;
O gene regulador produz uma proteína chamada repressor ;
O repressor se liga ao gene operador, impedindo a ligação da RNA pol e
portanto impedindo a transcrição dos genes estruturais que codificam as
enzimas de degradação da lactose;
Quando o indutor (no caso a lactose) é adicionada ao sistema, este se
sistema
liga ao repressor, liberando o operador, o que permitirá a ligação da RNA
pol ao sítio promotor e consequentemente os 3 genes estruturais serão
transcritos.
35. •Esquema representativo do controle
da transcrição dos genes para as
enzimas responsáveis pelo uso da
lactose em E. coli.
• O repressor, produto do gene i,
i
liga-se ao operador (em verdade, duas
moléculas), impedindo a ligação da
RNA polimerase ao sítio promotor P
e bloqueando a transcrição.
•A lactose no citosol bacteriano liga-se
ao repressor, inativando-o e liberando
o promotor para ser ligado pela
RNApol.
• O processo de transcrição estará
liberado até que a concentração
citosólica de lactose seja insuficiente
para garantir a inativação das
moléculas do repressor.
36. Que importância tem o operon
lac na genética molecular?
Muitos dos vetores de expressão, sejam eles fagos ou
plasmídeos, empregados em engenharia genética, têm o gene
clonado sob o controle de um promotor/operador lac.
Este sistema propicia o controle da expressão do gene clonado
através da adição de um análogo da lactose, o IPTG
(isopropiltiogalactosídeo).
Este produto é muitas vezes mais efetivo que a lactose na
indução da expressão do operão lac, além de não ser degradado.
37. Processo de Tradução
O processo de tradução se inicia pela ligação da sub-unidade
menor do ribossomo a um sítio (sequência) específica no
mRNA chamado RBS (ribosome binding site).
Esta ligação é mediada pelo pareamento de uma sequência do
rRNA 16 S (que faz parte da composição da sub-unidade
leve) com a sequência de Shine-Delgarno (ou RBS).
À sub-unidade menor acopla-se, então, o primeiro tRNA
(sempre para formil-metionina, em E. coli), e o conjunto
formil-metionina
desliza pelo mRNA até encontrar o códon AUG (identificado
pelo anticódon correspondente no tRNA).
38. Sítio E ( “empty” =
vazio), onde se aloja o
tRNA descarregado
antes de sair do
ribossomo
Estão representados
os diversos fatores que
participam do processo
de tradução, além do
ribossoma e dos
tRNAs.
39. Síntese Protéica
O RNAm transcrito no núcleo
chega ao citoplasma e se liga a
um ou mais ribossomos.
O ribossomo “lê” o primeiro
códon e um RNAt com o
anticódon correspondente
transporta um aminoácido e se
liga ao códon.
O ribossomo se desloca, no
sentido 5’3’ e lê o próximo
códon.
Os aminoácidos são unidos por
ligações peptídicas.
Ao final da tradução o
polipeptídeo se desliga e se
constituí na proteína.
40. TRADUÇÃO: SÍNTESE PROTEICA
Adição do aminoácido
Terminal 3´que liga ao
aminoácido -
correto: pareamento do
fenilalanina (Phe) códon (RNAm) com o
anticódon (RNAt)
Nucleotídeos
modificados
42. Proteínas
As proteínas se definem como polímeros formados pela
união, mediante a cadeias peptídicas, de unidades de menor
massa molecular chamadas aminoácidos;
As proteínas são macromoléculas
São compostos mais abundantes da matéria viva
São especificas
Através delas se expressam a informação genética