1. Aplicação dos marcadores moleculares
em plantas
Profa. Adriana Cibele de Mesquita Dantas

2. Biotecnologias em plantas
• Biologia Celular • Biologia Molecular
•Micropropagação • Marcadores moleculares
•Embriogenese somática • Análise da diversidade genética
•Resgate de embriões • Mapeamento genético de ligação
•Semente sintética •Seleção assistida
•Fusão de protoplasto •Genômica funcional
•Haplodiploidização • Transformação genética
•Variação somaclonal •Proteoma

3. Genética Genética de
Melhoramento populações
tradicional mendeliana
Marcadores genéticos
Genética Organização do Transferência
molecular genoma gênica
Sequenciamento

4. Métodos aplicados ao melhoramento
Métodos de melhoramento
genético de plantas
Germoplasma
Seleção Indução à mutação
Variação somaclonal Hibridação convencional
Hibridação somática
Transformação genética (Fusão de protoplastos)
Seleção e avaliação agronômica
Variedade comercial

5. Melhoramento tradicional
• Seleção de genótipos em plantas são
necessários vários ciclos de seleções e
recombinações;
• Características de interesse são geralmente
poligênicas,
• Herança complexa, difícil identificação;
• Grande número de cruzamentos;
• Muito esforço e planejamento;
• Polimorfismo limitado para ligação gênica

6. Melhoramento Tradicional
Receptividade do estigma
estádio balão Emasculação
Estoque de pólen -20°C Polinização manual

7. Até 1960 – Marcadores morfológicos
2. Primeira versões dos mapas genéticos;
3. Associação das marcas com características fenotípicas;
4. Restrito a poucas plantas (tomate, ervilha, milho);
5. Número reduzido de marcadores para um enorme
espectro de espécies vegetais;
6. Influência do ambiente e ação gênica;
7. Identificados a nivel de planta inteira ou adulta.

9. DETECÇÃO DO DOGMA CENTRAL
genes ambiente FENÓTIPO
DNA armazena RNA transfere Proteína executa
a informação a informação a função

10. Ampliação dos marcadores moleculares
MARCADORES
Morfológicos Bioquímicos DNA RNA
Marcadores moleculares

11. Marcador genético é uma característica que é capaz de
detectar diferenças entre dois ou mais indivíduos ou
organismos.
 deve ser capaz de diferenciar progenitores
 deve ser reproduzido com precisão na progênie
Do ponto de vista molecular, um marcador genético (ou loco marcador)
serve para identificar um local ou uma região de um cromossomo.
Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos:
alto nível de polimorfismo
estabilidade em diferentes ambientes
detectar grande número de locos não ligado

12. C
T
G
G
A
C
T
CCTGATGGATCGCGTACGTTGTACGCACAGTGTCGAAAAAG
CATACGGGGACTGCACGTACACGTAGCACGGCGTCGATTTT
GACGTGCACGTGTCAGTGCGATGAGTGAGTGACACACAGTG
CAGCGTGTGTACCCATGCGCGAAGTATGT

13. Marcadores moleculares
• São neutros em relação a efeitos epistáticos ou
pleitrópicos;
• Identificação de genótipos em estádios iniciais da planta;
• Acelera o processo de seleção e de recombinações
desejáveis.
• Todo e qualquer fenótipo molecular proveniente de um
gene expresso (isoenzimas, proteínas, RNAm);
• ou de um segmento específico de DNA (regiões
expressas ou não do genoma).

14. Três grandes aplicações
• Análise da diversidade genética entre
indivíduos
• Construção de mapas genéticos de
ligação
• Seleção assistida por marcadores
moleculares (SAM)

15. Classes dos marcadores
Isoenzimas
bioquímicos
Proteinas de sementes
restrição e
hibridação de
RFLP, minissatélites sequências de
(VNTR) dna
reação
polimerase em
RAPD, SSR, rDNA - ITS cadeia (PCR)
PCR + restrição
+ DNA
AFLP; cDNA+AFLP recombinante
PCR específicos
MitDNA, cpSSR em organelas

16. Ferramentas
PCR
Eletroforese Termociclador

17. Eletroforese
•O termo eletroforese foi criado
por Michaelis em 1909, descreve
migração de moléculas sob a
influência de um campo elétrico;
•Separação dos fragmentos da
molécula de DNA, RNA e
proteínas em gel
•Separação em função de suas
cargas elétricas, de seus pesos
moleculares e de suas
conformações.

18. Carregando o gel com as
amostras

20. Revelando gel de agarose em U.V. – brometo de etídeo

22. Eletroforese de isoenzimas
* Isoenzimas - diferentes formas moleculares (variantes) de uma
mesma enzima, apresentando função idêntica ou similar,
presente num mesmo indivíduo (Markert & Moller, 1959).
6PGDH -CM
Co-dominância Gel de Araucaria angustifolia
MANTOVANI, 2003

23. Isoenzimas
• Distintas formas de uma mesma enzima,
as isoenzimas, codificadas por diferentes
alelos, podem ser detectadas em
diferentes regiões do gel, caso apresentem
diferentes mobilidades eletroforéticas
• Cada banda revelada no gel se constitui
num marcador genético, pois entende-se
por marcador genético a constituição
genotípica de um loco num determinado
indivíduo

24. Aplicações das isoenzimas
• Kessel e Milchemore (1986) e Falcão e Contel
(1991) - abordam que as variações
isoenzimáticas são de grande importância nos
estudos genéticos:
• Indicadores dos níveis de polimorfismo
• Relacionamento filogenético
• Identificação de raças, espécies e populações
• Valiosa ferramenta para estudos evolutivos e
taxonômicos.

25. Fosfoglucomutase (PGM)
monomérica
alelo 1
alelo 2
alelo 3
Resultado da presença de mais de um gene codificando cada uma das enzimas
MANTOVANI, 2003

26. Estrutura genética de populações

27. Genética de Populações
Teorema de Hardy-Weinberg
Em populações infinitamente grandes,
com cruzamentos ao acaso (panmítica),
que não estiverem sofrendo influência dos
fatores evolutivos (mutações, seleção
natural, migrações), não haverá alteração do
pool gênico, isto é, as freqüências gênicas e
genotípicas se manterão constantes.

28. ORGANIZAÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA
• Base para um programa pré-melhoramento
• Caracterização morfológica e molecular
• Caracterização de bancos de germoplasma
• Coleções e seleções disponíveis em programas de melhoramento
• Cultivares comerciais

29. Análise da variabilidade genética

30. Reação de polimerase em cadeia (PCR)
Técnica usada para amplificar uma região específica de
DNA visando produzir quantidade de DNA suficiente
Amplificação do DNA

31. Extração de DNA (Doyle e Doyle, 1987)
Sol. extratora
Adição de CIA
Adição de CIA
1.5
1.5
1.5
1.0
1.0
1.0
Centrifugação
0.5
0.5
0.5
Amostra 0.1
Adição de etanol
RNAse
1.5
1.0
0.5
0.1
pellet

32. Constatações
• Logo após Kary Mullis ter descoberto a Polymerase Cadeia
Reação (PCR) ele percebeu que primers curtos ligariam a
vários locais em um genoma e assim poderiam produzir
fragmentos múltiplos.
• Welsh & McClelland (1990) e Williams et al. (1990)
desenvolveram Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) -
técnica que utiliza primer com 10 bases,
• O uso da reação da polimerização em cadeia (PCR)
proporciona a amplificação de um segmento de DNA,
delimitado por dois iniciadores (primers) com 10 pares de
bases, que são complementares a dois sítios, um em cada
fita do DNA, posicionados inversamente a uma distância
geralmente não superior a 4kb.

33.  Primer se anela a muitos locais no DNA
 Quando primer se anela em direção oposta – amplificação
DNA
Primers encontram-se na mesma direção,
amplificação NÃO acontecerá

34. RAPD
Dominante
DNA
100 - 1,500 bases
Primers são separados em pouca distância,
fragmento É AMPLIFICADO

35. RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA)
A B
A B

37. Marcadores “dominantes”
A1A1 A1A2 A2A2

38. Marcadores “dominantes”
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 Ind. L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8
01 0 1 0 1 1 0 1 1
02 1 0 0 0 1 1 0 1
03 0 0 1 1 1 0 0 1
L1
L2 04 0 1 1 1 0 1 0 1
L3 05 1 1 0 0 1 1 0 1
L4
06 0 0 1 0 1 0 0 1
L5
07 0 1 1 0 1 0 0 0
L6 08 0 1 0 1 0 1 0 1
L7 09 1 0 1 0 0 0 0 1
L8 10 0 1 0 1 1 0 0 1

39. Análise em gel de RAPD
QUAIS AS POLIMÓRFICAS?
QUAIS AS (CO)SEGREGANTES?

40. Onde estão localizados no genoma os
marcadores?
Genoma
Genes e sequências DNA extragênico
relacionadas
DNA codificante DNA não DNA repetitivo
codificante
RAPDs Introns Repetições em Repetições
Fragmentos de tandem dispersas
AFLPs genes
outros
Transposons
Satélites Sequências de inserção
Microssatélites
Minissatélites

41. Microsatélites
• SSR – Simple Sequence Repeats
– Pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos
repetidos em tandem - Amplificados via PCR
– Classe de marcadores moleculares mais polimórficos
Sinonímias
SSR (Simple Sequence Repeats);
STMS (Sequence Tagged Microsatellites);
SSLP (Single Sequence Length Polymorphisms);
Onde são encontrados ???
Mamíferos: (CA)n ( 50.000 a 100.000 vezes no genoma)
Plantas: (AT)n
Mitocôndrias
Cloroplastos

42. M
homozigoto
heterozigoto
Marcador co-dominante
Marcador multialélico

44. Marcadores “co-dominantes”
A1 A1 A1 A2 A2 A2

45. Marcadores “co-dominantes”
Ind. L1
01 1/3
02 3/4
01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 03 2/3
04 3/3
05 1/3
06 1/1
1
07 1/3
2
3
08 1/4
09 3/3
4
10 1/2

46. Sequenciamento de regiões microssatélites

49. Mapeamento genético de ligação
• Identificar marcadores genéticos ligados aos genes de interesse,
nos respectivos cromossomos;
•Disponibilizados para as principais espécies de importância
agronômica;
•QTLs e/ou QRLs rastreados e etiquetados,
visando uma melhoria na eficiência da seleção.
AFLP
Gene Vf
(Sarna)
Xu & Korban, 2000

50. CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA
Fenotipagem (Locos de resistência)
• Melrose x Gala – 86 plantas
• M13/91 x Gala - 129 plantas
• M13/91 x M46/94 -185 plantas

51. M9 x Marubakaido - 85 F1 (QTLs - loci quantitativos)
A B
Perfilhos uniformes
pulgão espinhos tipo spur Perfilhos uniformes

52. Marcas segregantes
Progênie F1 (Santa Rosa x Chatard)
S C M

53. 840
marcadores:
475 AFLPs
235 RAPDs
129 SSRs

55. Caracterização molecular
Identificação de marcas candidatas

56. Desenvolvimento de um SCAR
(Sequence characterized amplified RAPD)
• identificação de um iniciador que confere polimorfismo
a dois bulks de DNA com fenótipos contrastantes,
• o isolamento e a clonagem do fragmento amplificado
em um vetor (plasmideo),
• sequenciamento do fragmento isolado,
• desenho dos iniciadores de tamanho maior que os
decâmeros,
• teste final em plantas.

57. Validação das Marcas – Desenvolvimentos de
marcadores específicos (Clonagem por mapeamento)

58. Marcador Primer Gene Referencia
RAPDS
OPM18900 CACCATCCGT Vf Koller et al.,1994
OPU01400 ACGGACGTA Vf Koller et al.,1994
OPD20500 ACCCGGTCAC Vf Yang & Kruger, 1994
OPC081100 TGGACCGGTG Vf Tartarini 1996
OPC09900 CTCACCGTCC Vf Tartarini 1996
OPAL07580 CCGTCCATCC Vf Tartarini 1996
OPAM192200 CCAGGTCTTC Vf Tartarini 1996
OPA15900 TTCCGAACCC Vf Durham and Korban 1994
OPO141700 AGCATGGCTC Vf King et al. 1998
OPAF132000 CCGAGGTGAC Vf King et al. 1998
OPAG051900 CCCACTAGAC Vf King et al. 1998
OPAG12800 CTCCCAGGGT Vf King et al. 1998
SSR
CH05e03 For:CGAATATTTTCACTCTGACTGGG Vbj M.Gygax (Frey et al.,2004)
Rev:CAAGTTGTTGTACTGCTCCGA
CH02B10 For: CAAGGAAATCATCAAAGATTCAAG Vr Hemmat et al.,2002
Rev: CAAGTGGCTTCGGATAGT
CHVf1 For: ATCACCACCAGCAGCAAAG Vf C.Gessler (Frey et al.,2004)
Rev: CATACAAATCAAAGCACAACCC
CH02c06 For: TGACGAAATCCACTACTAATGCA Vr Baldi et al.,2004
Rev: GATTGCGCGCTTTTTAACAT
CH02C02a For: CTTCAAGTTCAGCATCAAGACAA Vr2 Patocchi et al., 2003
Rev: TAGGGCACACTTGCTGGTC
CH02B07 For: CCAGACAAGTCATCACAACACTC Vd Calenge et al., 2005
Rev: ATGTCGATGTCGCTCTGTTG
Primers específicos Vf
Vfa1 For: TCTATCTCAGTAGTTTCTATAATTCC Vf Xu & Korban (2002)
Rev:GTAGTTACTCTCAAGATTAAGAACTT
Vfa2 For: CTCAATCTCAGTAGTTTCTATGGA Vf Xu & Korban (2002)
Rev: CCCCCGAGATTAAGAGTTG
Vfa3 For:ATATTAGTAGTTTCTATAATCTGAAGG Vf Xu & Korban (2002)
Rev:CCCCCGAGATTAAGAGATG
Vfa4 For:TATCTCAATCTCAGTAGTAATAGTATC Vf Xu & Korban (2002)
Rev:GACCTTGGAAACCACAATC
AL07/SCAR 450 464 For: TCCTTACTGAGGAGGAAACCAG Tartarini et al. (1999)
Rev: CAAGGGAACTGATCTTTCGTTG
ARGH
ARGH 25/CH02B07 For:CAAACATCATCGTAATTTTGACG Vd Baldi et al.,2004
Rev:CATACTCTTCATGAGGATAATTC
ARGH37 For:TGCACGACATTAGCAACACTG Vr2 Baldi et al.,2004
Rev:GAAACAACTTCTTTTGAGAGTTC
ARGH17 For:TTGCCGACGTTCGTGATGCT Vr2 Baldi et al.,2004
Rev:GATATCCTTTGTTTGGACAACC
ARGH 34/CHVf1 For:TGTATGACCAGCCGAAGGTG Vf1 Baldi et al.,2004
REv:CCAGGACAACAATGTACCTC
Seleção assistida por marcadores
(SAM)

59. Proteínas
Atributos Isoenzimas de sementes RFLPs RAPDs Microssatélites AFLPs
Nível de baixo alto baixo-alto baixo-alto muito alto muito alto
Polimorfismo
Estabilidade moderada alta alta alta alta alta
ambiental
Número de locos moderado (<50) baixo (<10) alto alto alto alto
Expressão genética co-dominate co-dominante co-dominante dominante co-dominante dominante
Número de alelos por 2-5 multialélico multialélico 2 multialélico 2
loco
Distribuição no regiões de cópia regiões de cópia várias ao acaso ao acaso ao acaso
genoma única única
Acessibilidade muito alta muito alta média muito alta muito baixa média
tecnológica
Aplicabilidade no rápido, rápido, lento, rápido, baixo lento, custo alto rápido, custo
melhoramento baixo custo baixo custo custo médio custo baixo
Identificação de baixa baixa alta muito alta muito alta muito alta
genótipos
Avaliação de média baixa alta alta alta muito alta
germoplasma
Mapeamento baixa muito baixa alta alta muito alta alta
genético
Mapeamento de baixa inadequado média muito alta média muito alta
regiões específicas
Mapeamento baixa inadequado muito alta baixa alta baixa
comparativo
Genética de baixa baixa média alta muito alta muito alta
Autógamas
Genética de média baixa média alta muito alta muito alta
Alógamas
Análise Filogenética média baixa muito alta média alta média
Adaptado de Gepts (1993) e Ferreira & Grattapaglia (1995).

60. Melhoramento molecular
(molecular breeding)
Populações segregantes Expressão gênica - RNAm
Marcador molecular Bibliotecas cDNA
Polimorfismo
Banco de dados
Mapeamento de QRL/
QTL
Seleção assistida Proteôma